Neural Activity Propagação em uma Unfolded Hippocampal Preparação com um penetrante Micro-eletrodo Matriz
Summary
Nós desenvolvemos uma hipocampo in vitro desdobrada que preserva CA1-CA3 matriz de neurónios. Combinada com a rede de micro-eléctrodo penetrante, actividade neuronal pode ser monitorizada em ambas as orientações longitudinais e transversais. Este método oferece vantagens em relação a preparações de fatias do hipocampo como a propagação em todo o hipocampo podem ser gravados simultaneamente.
Abstract
Este protocolo descreve um método para a preparação de uma nova preparação de hipocampo in vitro fixa combinada com uma rede de micro-maquinado para mapear a actividade neuronal no hipocampo. A preparação transversal fatia do hipocampo é a preparação do tecido mais comum para estudar hipocampo eletrofisiologia. Uma fatia de hipocampo longitudinal também foi desenvolvido a fim de investigar as ligações longitudinais no hipocampo. Os hipocampo do rato também intactos podem ser mantidas in vitro, porque a sua espessura permite a difusão de oxigénio adequado. No entanto, estas três preparações não fornecem acesso direto a propagação neural já que alguns dos tecidos está ausente ou dobrado. O hipocampo intacto desdobrado fornece tanto transversais e longitudinais conexões em uma configuração plana para acesso direto ao tecido para analisar toda a extensão da propagação do sinal no hipocampo in vitro. A fim de controlar eficazmente a atividade neural de tele camada de células, um feito penetrar rede de micro-eléctrodo (PMEA) foi fabricado e aplicado ao hipocampo desdobrado. O PMEA com 64 eletrodos de 200 mm de altura poderia gravar a atividade neural profundo dentro do hipocampo do rato. A combinação única de uma preparação do hipocampo e desdobrada a PMEA fornece uma nova ferramenta in vitro para estudar a velocidade e direcção de propagação da actividade neural nas regiões bidimensionais CA1-CA3 do hipocampo, com uma alta relação sinal-ruído.
Introduction
Compreendendo a condução neural ou propagação de sinais neurais é crucial para a determinação do mecanismo da comunicação neuronal, tanto no funcionamento normal e em condições patológicas do cérebro 1-3. O hipocampo é uma das estruturas mais estudadas no cérebro, uma vez que desempenha papel fundamental em diversas funções cerebrais como memória, e rastreamento espacial e está envolvido em várias alterações patológicas que afetam drasticamente o comportamento bem 1,6. Embora, o hipocampo exibe uma organização complexa, os diferentes elementos da sua estrutura pode ser facilmente identificado e consultados na preparação fatia 4-6. No sentido transversal do hipocampo, actividade neuronal é conhecida a propagar através da via de tri-sináptica que compreendem o giro dentado (DG), CA3, CA1 andsubiculum 4,5. Acredita-se que a transmissão sináptica e a condução axonal, desempenham um papel importante para comuniem neste circuito transversal 4,6. No entanto, a propagação do sinal neural ocorre em ambas direções transversal e longitudinal 4,6. Isto implica que o hipocampo não pode ser totalmente investigado usando preparações de fatias que limitam a observação de uma determinada direcção de propagação 4. A fatia longitudinal foi desenvolvido para investigar os caminhos axonal ao longo do eixo longitudinal 5. Pesquisadores observaram gama e teta oscilações específicas de comportamento predominantemente ao longo eixos transversal e longitudinal, respectivamente 6. Esses comportamentos foram estudados separadamente, mas o acesso simultâneo a ambos os sentidos é crucial para entender esses comportamentos. Mesmo com o desenvolvimento da preparação hipocampo intactos, é difícil controlar a propagação ao longo de todo o tecido devido à estrutura dobrada do hipocampo 4. O hipocampo desdobrado dá acesso aos neurônios embaladosem uma forma de uma camada de células de 7,8 bidimensional plana.
Por desdobramento do giro dentado (DG) (Figura 1), o hipocampo adopta um formato achatado com uma configuração rectangular, em que ambos transversais e longitudinais permanecem intactos ligações com a camada de células piramidais dispostos numa chapa bidimensional contendo tanto CA3 e CA1, deixando uma peça plana de tecido neural que pode ser utilizado para investigar a propagação neural (Figura 2) 8. Actividade neural pode ser monitorada com pipetas individuais de vidro, matrizes microeléctrodos, eléctrodos estimulantes, bem como corantes sensíveis à voltagem (VSD) 3,7,8. Além disso, o indicador de tensão geneticamente codificado a partir de ratinhos transgénicos que pode ser usado para controlar o padrão de propagação 9.
A configuração plana da rede do hipocampo desdobrada é bem adequado para a gravação óptica método mas também para uma matriz de microeléctrodos. Most das matrizes disponíveis no mercado são fabricados com eletrodos de perfil plano ou baixo e pode gravar a atividade neural em ambas as fatias de tecido e neurônios cultivados 10-12. No entanto, a relação sinal-para-ruído (SNR) decresce quando os sinais são obtidos a partir de um tecido intacta uma vez que a soma dos neurónios estão localizadas mais profundamente no tecido. Matrizes de eletrodos de microeletrodos com proporções elevadas são necessárias para melhorar o SNR.
Para este efeito, uma matriz de microeléctrodos penetrante (PMEA), foi desenvolvido no nosso laboratório, e proporciona a capacidade para sondar directamente no tecido através da inserção de 64 pontos com um diâmetro de 20 mm e altura de 200 mm no hipocampo desdobradas 7,13 . Esta matriz de microeléctrodos tem SNR superior em comparação com o corante de imagem sensível à voltagem e o SNR permanece estável durante uma experiência 7,13. A combinação da preparação do hipocampo e desdobrada a PMEA proporciona uma nova maneira de investirIGATE a propagação neural ao longo de um plano bidimensional. Experimentos usando esta técnica já produziu resultados significativos sobre os mecanismos de propagação do sinal neural no hipocampo em que a atividade neural pode propagar de forma independente das sinapses sinápticas ou elétricos 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
O desenvolvimento do hipocampo preparação desdobrada, em que os eixos longitudinais e transversais do hipocampo são preservadas em combinação com uma matriz de microeléctrodos penetrante, fornece uma ferramenta poderosa para investigar as ligações anatomia ou propagação neural no hipocampo 7. Este procedimento de desdobramento é também aplicável para estudar hipocampo em ratos adultos. Estudos recentes com esta preparação mostrou que a actividade epileptiforme induzido-4-AP poderia propagar com…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health (National Institute of Neurological Disorders and Stroke) Grant 1R01NS060757-01 and by the E.L. Lindseth endowed chair to Dominique M. Durand. We thank Dr. Andrew M. Rollins’ laboratory for the help on the OCT imaging.
Materials
| desiccator jar | LABRECYCLERS Inc. | 5410 | Place regular paper towels at the bottome of the jar for animal anesthesia use. |
| A blade and Custome made surgical stage for unfolding hippocampus | N/A | N/A | A petri dish is place upside down (in the center) in the ice with a wet filter paper place on top of it. |
| Custom made tissue recovery chamber | N/A | N/A | Plastic tubes were glued with plastic mesh at the bottom and bubbled with 95% O2/ 5% CO2 in the aCSF. |
| Straight Operating Scissors | Fisher Scientific | S17336B Medco Instruments No.:81995 | This scissors is used to decapitate the mice. |
| Integra Miltex Goldman-Fox Scissors | Fisher Scientific | 12-460-517 MILTEX INC No.:5-SC-320 | This scissors is used to cut the skull of the mice. |
| Miltex Hysterectomy Forceps |
Claflin Medical equipment | CESS-722033-00001 | This Forceps is used to peel the cut skull to expose the brain |
| Micro Spatula | Cardinal Health | This micro spatula is used to tranfer the whole brain of a semisphere into the recorering chamber. | |
| Frey Scientific Stainless Steel Semi-Micro Spatula | Cardinal Health | this semi micro spatula is used to tranfer the unfolded hippocampus into the glucose aCSF in the recovering chamber. | |
| small paint brush | Lowe's | tem #: 105657 Model #: 90219 | The one with the smallest size in a normal paint brush package |
| Fire polished glass help tool | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
| Custom made glass needle | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
| Custom made glass tool with a metal wire loop | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes with a reshaped metal wire loop. |
| Custom made glass solution dropper | N/A | N/A | This tool was made from the regular Pasteur glass pipettes with its tips cut and a rubber head attached with the cut end. |
| Custom made tissue anchor | N/A | N/A | Nylon fiber mesh was glued on a insulated copper wire ring. The tissue anchor was hold by an micromanipulator. |
| Custom fabricated microelectrode array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
| Custom made filter and amplifiers circuits for the array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
| Data acquisition processor 3400a | Microstar Laboratories | N/A | This is a complete data acquisition system with A/D converter. |
Referencias
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