Vi har utviklet en in vitro utfoldet hippocampus som bevarer CA1-CA3 utvalg av nerveceller. Kombinert med den inntrengende mikroelektrodesystem, kan nevral aktivitet overvåkes i både den langsgående og tverrgående retninger. Denne metoden gir fordeler i forhold til hippokampalt snitt preparater som forplantning i hele hippocampus kan registreres samtidig.
Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for fremstilling av et nytt in vitro flat hippocampus preparat i kombinasjon med en mikromaskinerte matrise til kart nevral aktivitet i hippocampus. Den tverrgående hippokampalt snitt preparat er den vanligste vevspreparat å studere hippocampus elektrofysiologi. En longitudinell hippocampus skive ble også utviklet for å undersøke langsgående forbindelser i hippocampus. De intakte mus hippocampus kan også bli opprettholdt in vitro, fordi dens tykkelse tillater tilstrekkelig oksygendiffusjon. Men disse tre preparatene ikke gir direkte tilgang til nevrale forplantning siden noen av vevet mangler eller brettet. Utbrettet intakt hippocampus gir både tverrgående og langsgående forbindelser i en flat konfigurasjon for direkte tilgang til vevet for å analysere det fulle omfanget av signalforplantning i hippocampus in vitro. For å effektivt overvåke nevrale aktiviteten fra tHan cellelag, et spesiallaget gjennomtrengende mikroelektrodesystem (PMEA) ble fremstilt og anvendt til utfoldet hippocampus. Den PMEA med 64 elektroder av 200 mikrometer i høyden kan spille inn nevrale aktiviteten dypt inne muse hippocampus. Den unike kombinasjonen av en utbrettet hippocampus preparat og PMEA gir et nytt in vitro redskap for å studere den hastighet og retning av forplantningen av nevral aktivitet i de todimensjonale CA1-CA3 regioner av hippocampus med et høyt signal-til-støy-forholdet.
Forståelse av nevrale ledning eller forplantning av nervesignaler er avgjørende for bestemmelse av mekanismen for nevral kommunikasjon både i normal funksjon og patologiske tilstander i hjernen 1-3. Hippocampus er en av de mest omfattende studert strukturer i hjernen, siden den er med fundamental rolle i flere hjernefunksjoner som hukommelse, og romlig sporing og er involvert i flere patologiske forandringer som dramatisk påvirke oppførselen samt 1,6. Selv, viser hippocampus en kompleks organisasjon, kan de ulike elementene i sin struktur lett identifiseres og åpnes i stykket forberedelse 4-6. I tverretningen av hippocampus, er nevral aktivitet er kjent for å forplante seg gjennom tri-synaptiske bane som omfatter gyrus dentatus (DG), CA3, CA1 andsubiculum 4,5. Det antas at synaptisk overføring og aksonal conduction spille en viktig rolle for kommuniki denne tver kretsen 4,6. Men tar forplantning av nevrale signal sted i både tverrgående og langsgående retninger 4,6. Dette innebærer at hippocampus ikke fullt ut kan undersøkes ved hjelp av slice forberedelser som begrenser observasjon til en bestemt retning av forplantning 4. Den langsgående skive ble utviklet for å undersøke de aksonale trasé langs den langsgående aksen 5. Forskere har observert atferdsspesifikke gamma og theta svingninger hovedsakelig langs tverrgående og langsgående akser henholdsvis 6. Disse atferd har blitt studert separat, men samtidig tilgang til begge retninger er avgjørende for å forstå disse problemene. Selv med utviklingen av den intakte hippocampus fremstillingen, er det vanskelig å overvåke forplantningen gjennom hele vev på grunn av den foldede struktur av hippocampus 4. Utbrettet hippocampus gir tilgang til de pakket nevroneri form av en flat to-dimensjonal cellelaget 7,8.
Ved utfolding dentate gyrus (DG) (figur 1), inntar hippocampus en flattrykt form med en rektangulær konfigurasjon hvor både tverrgående og langsgående forbindelser forblir intakt med pyramidal cellelaget anordnet i et todimensjonalt ark inneholdende både CA3 og CA1, forlater et flatt stykke av nervevev som kan brukes til å undersøke nevrale formering (figur 2) 8. Nerveaktivitet kan overvåkes deretter med individuelle glass pipetter, microelectrode matriser, stimulerende elektroder, samt spenningsfølsomme fargestoffer (VSD) 3,7,8. I tillegg kan genetisk kodede spenningsindikator fra transgene musene anvendes for å spore utbredelsesmønsteret 9.
Den flate konfigurasjon av den utbrettede hippocampus nettverket er godt egnet for optisk metode opptak, men også for en microelectrode array. Most av de kommersielt tilgjengelige arrays er fabrikkert med flat eller lav profil elektroder og kan ta opp nevrale aktiviteten i både vev skiver og dyrkede nerveceller 10-12. Imidlertid reduserer signal-til-støy-forhold (SNR) når signalene mottas fra et intakt vev, siden soma av neuronene er plassert dypere inn i vevet. Microelectrode elektrodegrupper med høyt sideforhold er nødvendig for å forbedre SNR.
For dette formål har et gjennomtrengende microelectrode array (PMEA) er utviklet i vårt laboratorium, og gir mulighet for direkte å sondere i vevet ved å sette inn 64 pigger med en diameter på 20 um og en høyde på 200 mikrometer inn i de utspredte hippocampus 7,13 . Dette microelectrode matrise har høyere SNR i forhold til spenningen sensitive fargestoff bildebehandling og SNR forblir stabil under et eksperiment 7,13. Kombinasjonen av den ikke-brettede hippocampus preparatet og PMEA gir en ny måte å investereIgate nevrale forplantning over en to-dimensjonal planet. Eksperimenter ved hjelp av denne teknikken har allerede gitt betydelige resultater om mekanismene for nevrale signal forplantning i hippocampus der nevrale aktiviteten kan forplante uavhengig av synaptiske eller elektriske synapser 7.
Utviklingen av utbrettet hippocampus forberedelse, hvor de langsgående og tverrgående akser av hippocampus er bevart i kombinasjon med en gjennomtrengende microelectrode array, gir et kraftig verktøy for å undersøke anatomi tilkoblinger eller nevrale forplantning i hippocampus 7. Dette utfoldingsprosessen er også aktuelt for å studere hippocampus hos voksne mus. Nyere studier med dette preparat viste at 4-AP-indusert epileptiform aktivitet kunne forplante seg med en diagonal bølgefront over hele areal…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by National Institutes of Health (National Institute of Neurological Disorders and Stroke) Grant 1R01NS060757-01 and by the E.L. Lindseth endowed chair to Dominique M. Durand. We thank Dr. Andrew M. Rollins’ laboratory for the help on the OCT imaging.
desiccator jar | LABRECYCLERS Inc. | 5410 | Place regular paper towels at the bottome of the jar for animal anesthesia use. |
A blade and Custome made surgical stage for unfolding hippocampus | N/A | N/A | A petri dish is place upside down (in the center) in the ice with a wet filter paper place on top of it. |
Custom made tissue recovery chamber | N/A | N/A | Plastic tubes were glued with plastic mesh at the bottom and bubbled with 95% O2/ 5% CO2 in the aCSF. |
Straight Operating Scissors | Fisher Scientific | S17336B Medco Instruments No.:81995 | This scissors is used to decapitate the mice. |
Integra Miltex Goldman-Fox Scissors | Fisher Scientific | 12-460-517 MILTEX INC No.:5-SC-320 | This scissors is used to cut the skull of the mice. |
Miltex Hysterectomy Forceps |
Claflin Medical equipment | CESS-722033-00001 | This Forceps is used to peel the cut skull to expose the brain |
Micro Spatula | Cardinal Health | This micro spatula is used to tranfer the whole brain of a semisphere into the recorering chamber. | |
Frey Scientific Stainless Steel Semi-Micro Spatula | Cardinal Health | this semi micro spatula is used to tranfer the unfolded hippocampus into the glucose aCSF in the recovering chamber. | |
small paint brush | Lowe's | tem #: 105657 Model #: 90219 | The one with the smallest size in a normal paint brush package |
Fire polished glass help tool | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
Custom made glass needle | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
Custom made glass tool with a metal wire loop | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes with a reshaped metal wire loop. |
Custom made glass solution dropper | N/A | N/A | This tool was made from the regular Pasteur glass pipettes with its tips cut and a rubber head attached with the cut end. |
Custom made tissue anchor | N/A | N/A | Nylon fiber mesh was glued on a insulated copper wire ring. The tissue anchor was hold by an micromanipulator. |
Custom fabricated microelectrode array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
Custom made filter and amplifiers circuits for the array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
Data acquisition processor 3400a | Microstar Laboratories | N/A | This is a complete data acquisition system with A/D converter. |