Summary

地中マイクロ電極アレイと非折り畳み海馬準備神経活動の伝播

Published: March 27, 2015
doi:

Summary

私たちは、ニューロンのCA1-CA3配列を保持するインビトロ折り畳まれていない海馬を開発した。貫​​通微小電極アレイと組み合わせて、神経活動は、長手方向および横方向の向きでモニターすることができる。全体の海馬での伝搬を同時に記録することができますように、この方法は、海馬スライス標本上の利点を提供する。

Abstract

このプロトコルは、海馬における神経活動をマッピングするための微細加工のアレイと組み合わせる新しいインビトロフラット海馬の準備を調製するための方法を説明します。横断海馬スライス標本は、海馬の電気生理学を研究するための最も一般的な組織調製である。縦海馬スライスはまた、海馬における縦の接続を調べるために開発されました。その厚さは、十分な酸素の拡散を可能にするので、無傷のマウスの海馬はまた、インビトロで維持することができる。組織の一部が欠落している9893のどちらかであるので、これらの3つの調製は、神経伝播への直接アクセスを提供しません。折り畳まれていない無傷の海馬横断し、インビトロで海馬における信号伝搬の全範囲を分析する組織に直接アクセスするための平坦な構成の縦接続の両方を提供する。効果的にtから神経活動を監視するために彼細胞層、カスタムを作製した微小電極アレイ(PMEA)を貫通製折り畳ま海馬に適用する。高さが200μmの64の電極を有するPMEAは、深いマウス海馬の中に神経活動を記録することができます。折り畳ま海馬調製およびPMEAのユニークな組み合わせは、高い信号対雑音比と海馬の二次元CA1-CA3領域における神経活動の伝播速度と方向を研究するための新規のin vitroツールを提供する。

Introduction

神経信号の神経伝導または伝播を理解することは、脳1-3の正常な機能および病理学的状態の両方における神経コミュニケーションのメカニズムを決定するために重要である。海馬は、メモリ、および空間追跡などのいくつかの脳機能において基本的な役割を果たしており、劇的に挙動ならびに1,6に影響与えるいくつかの病理学的変化に関与しているため、脳の中で最も広く研究構造の一つである。海馬は複雑な組織を示すが、その構造の異なる要素は、容易に識別され、スライス標本4-6にアクセスすることができる。海馬の横方向に、神経活動は、歯状回(DG)、CA3、CA1 andsubiculum 4,5を備えトライシナプス経路を介して伝播することが知られている。これは、シナプス伝達および軸索伝導communicatiために主要な役割を果たすと考えられているこの横方向の回路4,6のオン。しかし、神経信号の伝播が横方向と縦方向4,6の両方で行われます。これは海馬が完全に伝播4の特定の方向に観測を制限スライス標本を使って調べることができないことを意味します。長手方向のスライスは、長手方向軸5に沿って軸索経路を調査するために開発された。研究者は、主に横方向と縦軸にそれぞれ6に沿って行動固有のガンマ及びシータ振動を観測した。これらの動作は別々に研究されてきた、まだ両方向への同時アクセスは、これらの動作を理解することが重要です。でも無傷の海馬製剤の開発は、海馬4の折り畳まれた構造に起因する組織全体を通して伝播を監視することは困難である。折り畳まれていない海馬はパックニューロンへのアクセスを提供します平らな二次元の細胞層7,8の形態である。

歯状回(DG)( 図1)を展開することによって、海馬は、横方向及び縦方向の両方の接続がCA3およびCA1の両方を含む二次元のシートに配置された錐体細胞層に無傷のままでいる長方形の形状と平坦な形状を採用している神経伝播を研究するために使用することができる神経組織のフラット部分を残して( 2)8。神経活動は、個々のガラスピペット、マイクロ電極アレイ、刺激電極、ならびに電圧感受性色素(VSD)、3,7,8でモニターすることができる。また、トランスジェニックマウスの遺伝的にコードされた電圧インジケータは、伝播パターン9を追跡するために使用することができる。

折り畳まれていない海馬ネットワークの平坦な構成は、光学的な方法の記録のためにだけでなく、微小電極アレイに適しています。 M市販の配列のOSTは、平らなまたはロープロファイル電極が製造され、両方の組織スライスと培養神経細胞10-12に神経活動を記録することができます。しかしながら、信号対雑音比(SNR)は、ニューロンの細胞体は、組織内に深く配置されているので、信号が無傷の組織から得られた場合に減少する。高アスペクト比を有する微小電極アレイは、SNRを改善するために必要とされる。

この効果により、貫通微小電極アレイ(PMEA)が我々の研究室で開発され、折り畳まれていない海馬7,13に直径20μmと200μmの高さのスパイク64を挿入することにより、組織に直接プローブする能力を提供する。この微小電極アレイは、電位感受性色素イメージングに比べてより高いSNRを有しており、SNRが、実験7,13の間に安定している。折り畳まれていない海馬準備とPMEAの組み合わせが投資する新しい方法を提供します2次元平面上での神経伝達をIGATE。この技術を用いた実験では、すでに神経活動は、独立して、シナプスや電気シナプス7の伝播することが可能となる海馬における神経信号伝搬のメカニズムについての重要な結果が得られている。

Protocol

注:動物実験プロトコルを見直し、大学で施設内動物管理使用委員会によって承認された。 P20へP10歳の時にいずれかの性別のCD1マウスをこの研究で使用されている。 手術と実験録音1.ソリューションのNaCl 124、KClの3.75、KH 2 PO 4 1.25、MgSO 4を2、NaHCO 3で26、ブドウ糖10、およびCaCl 2 2:(mm)を含む通常の人工脳脊髄液(aCSFの)バッフ?…

Representative Results

ここで、図面に示されたデータは、4-AP(100μM)を室温で記録チャンバー内の組織のインキュベーションの間に添加するaCSF(25°C)で折り畳ま海馬製剤で記録した。通常、アクティビティが5分以内に開始しますが、高齢の動物からいくつかの海馬組織中でそれは時間がかかることがあります。以前に14,15を報告したようにPMEAで観察4-APによって誘発される神経細胞の発火は同じです。?…

Discussion

海馬の縦方向および横軸が貫通する微小電極アレイと組み合わせて保存されて折り畳まれていない海馬調製物の開発が海馬7の解剖接続または神経伝播を研究する強力なツールを提供する。この展開手順は、成体マウスにおける海馬の研究にも適用可能である。この調製物を用いた最近の研究では、4-AP誘発性てんかん様活動は、折り畳まれていない海馬( 6)7,8

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by National Institutes of Health (National Institute of Neurological Disorders and Stroke) Grant 1R01NS060757-01 and by the E.L. Lindseth endowed chair to Dominique M. Durand. We thank Dr. Andrew M. Rollins’ laboratory for the help on the OCT imaging.

Materials

desiccator jar LABRECYCLERS Inc. 5410 Place regular paper towels at the bottome of the jar for animal anesthesia use. 
A blade and Custome made surgical stage for unfolding hippocampus N/A N/A A petri dish is place upside down (in the center) in the ice with a wet filter paper place on top of it. 
Custom made tissue recovery chamber N/A N/A Plastic tubes were glued with plastic mesh at the bottom and bubbled with 95% O2/ 5% CO2 in the aCSF.
Straight Operating Scissors Fisher Scientific S17336B                                            Medco Instruments No.:81995  This scissors is used to   decapitate the mice.
Integra Miltex Goldman-Fox Scissors Fisher Scientific 12-460-517                        MILTEX INC                           No.:5-SC-320 This scissors is used to cut the skull of the mice. 
Miltex
Hysterectomy Forceps
Claflin Medical equipment CESS-722033-00001 This Forceps is used to peel the cut skull to expose the brain
Micro Spatula Cardinal Health This micro spatula is used to tranfer the whole brain of a semisphere into the recorering chamber. 
Frey Scientific Stainless Steel Semi-Micro Spatula Cardinal Health this semi micro spatula is used to tranfer the unfolded hippocampus into the glucose aCSF in the recovering chamber.
small paint brush Lowe's tem #: 105657                  Model #: 90219 The one with the smallest size in a normal paint brush package
Fire polished glass help tool N/A N/A This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes.
Custom made glass needle N/A N/A This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes.
Custom made glass tool with a metal wire loop N/A N/A This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes with a reshaped metal wire loop.
Custom made glass solution dropper N/A N/A This tool was  made from the regular Pasteur glass pipettes with its tips cut and a rubber head attached with the cut end.
Custom made tissue anchor N/A N/A Nylon fiber mesh was glued on a insulated copper wire ring. The tissue anchor was hold by an micromanipulator. 
Custom fabricated microelectrode array N/A N/A More detail about the array please refer to  Kibler, et al, 2011. 
Custom made filter and amplifiers circuits for the array N/A N/A More detail about the array please refer to  Kibler, et al, 2011. 
Data acquisition processor 3400a Microstar Laboratories N/A This is a complete data acquisition system with A/D converter.

Referencias

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Citar este artículo
Zhang, M., Kibler, A. B., Gonzales-Reyes, L. E., Durand, D. M. Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array. J. Vis. Exp. (97), e52601, doi:10.3791/52601 (2015).

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