עצבי פעילות הרבייה בהיפוקמפוס הכנה פרש בחודר מיקרו-אלקטרודה Array
Summary
פיתחנו היפוקמפוס פרש במבחנה השומר מערך CA1-CA3 של נוירונים. בשילוב עם מערך מיקרו-אלקטרודה החודרת, פעילות עצבית יכולה להיות במעקב בשתי אוריינטציות אורכי ורוחביות. שיטה זו מספקת יתרונות על פני הכנות פרוסה בהיפוקמפוס כמו ההתפשטות בכל היפוקמפוס ניתן להקליט בו זמנית.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר שיטה להכנה חדשה בהיפוקמפוס ההכנה השטוח מבחנה בשילוב עם מערך מיקרו-במכונה כדי למפות פעילות עצבית בהיפוקמפוס. ההכנה הפרוסה בהיפוקמפוס רוחבית היא הכנת רקמה הנפוצה ביותר ללמוד אלקטרופיזיולוגיה היפוקמפוס. פרוסה בהיפוקמפוס אורך פותח גם כדי לחקור קשרים אורך בהיפוקמפוס. ניתן גם לשמור על ההיפוקמפוס העכבר שלם במבחנה בגלל עוביו מאפשר דיפוזיה חמצן נאותה. עם זאת, שלושת תכשירים אלה אינם מספקים גישה ישירה להתפשטות עצבית שכן חלק מהרקמה חסר או מקופל. ההיפוקמפוס שלם המקופל מספק הן רוחבי וקשרים ארוכי טווח בתצורה שטוחה לגישה ישירה לרקמות לנתח את מלוא היקף התפשטות אות בהיפוקמפוס במבחנה. על מנת לפקח על הפעילות העצבית מt ביעילותהוא שכבת תאים, מנהג עשה חודר מערך מיקרו-אלקטרודה (PMEA) היה מפוברק ופנה להיפוקמפוס פרש. PMEA עם 64 אלקטרודות של 200 מיקרומטר בגובה יכול להקליט פעילות עצבית עמוק בתוך ההיפוקמפוס העכבר. שילוב הייחודי של הכנה בהיפוקמפוס מקופלת וPMEA מספק כלי חוץ הגופייה חדש ללמוד את המהירות וכיוון של התפשטות של פעילות עצבית באזורי CA1-CA3 דו-ממדיים של ההיפוקמפוס עם אות גבוהה יחס רעש.
Introduction
הבנת ההולכה או התפשטות העצבית של אותות עצביים היא קריטית לקביעת המנגנון של תקשורת עצבית בשני התפקוד הנורמלי ומצבים פתולוגיים במוח 1-3. ההיפוקמפוס הוא אחד המבנים הנחקרים ביותר בהרחבה במוח מאז שהיא ממלאת תפקיד בסיסי בכמה תפקודי מוח כגון זיכרון, ומעקב במרחב ובמעורב במספר שינויים פתולוגיים באופן דרמטי את ההשפעה על התנהגות, כמו גם 1,6. אמנם, ההיפוקמפוס מציג ארגון מורכב, האלמנטים השונים של המבנה שלו ניתן לזהות בקלות והגישה בהכנת פרוסה 4-6. בכיוון הרוחבי של ההיפוקמפוס, פעילות עצבית ידועה להפיץ דרך המסלול תלת-סינפטי המרכיב את המשונן gyrus (DG), CA3, CA1 andsubiculum 4,5. הוא האמין כי שידור סינפטי והולכת axonal לשחק תפקיד מרכזי לcommunicatiבמעגל רוחבי זה 4,6. עם זאת, התפשטות של אות עצבית מתרחשת בשני כיוונים רוחביים ואורך 4,6. משמעות הדבר הוא כי ההיפוקמפוס לא יכול להיחקר באופן מלא על ידי שימוש בהכנות פרוסה המגבילות את התצפית לכיוון מסוים של התפשטות 4. פרוסה האורך פותחה כדי לחקור את מסלולי axonal לאורך ציר אורך 5. חוקרים הבחינו תנודות גמא ותטא התנהגות ספציפית בעיקר לאורך רוחבי וצירה אורך בהתאמה 6. התנהגויות אלו נחקרו בנפרד, אך גישה בו זמנית לשני הכיוונים היא חיונית כדי להבין התנהגויות אלו. אפילו עם הפיתוח של תכשיר ההיפוקמפוס שלם, שקשה לפקח על ההתפשטות בכל רחבי הרקמה בשל מקופל המבנה של ההיפוקמפוס 4. ההיפוקמפוס פרש מספק גישה לתאי העצב ארוזבצורה של 7,8 שכבת תאים דו-ממדי שטוחה.
על ידי התגלגלות gyrus המשונן (DG) (איור 1), ההיפוקמפוס מאמץ צורה שטוחה עם תצורה מלבנית שבשני רוחבי וחיבורי אורך להישאר שלמים עם שכבת תאי הפירמידה מסודרת בגיליון דו-ממדי המכיל את שני CA3 וCA1, משאיר פיסת הרקמה עצבית שיכול לשמש כדי לחקור התפשטות עצבית שטוחה (איור 2) 8. פעילות עצבית אז יכולה להיות במעקב עם טפטפות פרט זכוכית, מערכי microelectrode, אלקטרודות גירוי, כמו גם צבעי מתח רגישים (VSD) 3,7,8. בנוסף, מחוון מתח מקודד גנטי מעכברים הטרנסגניים ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר התפשטות הדפוס 9.
התצורה שטוחה של הרשת בהיפוקמפוס המקופלת היא גם מתאימה להקלטת שיטה אופטית אלא גם למערך microelectrode. Most של המערכים הזמינים המסחרית מיוצר עם אלקטרודות פרופיל שטוח או נמוך והוא יכול להקליט פעילות עצבית בשתי פרוסות רקמה ונוירונים בתרבית 10-12. עם זאת, יחס אות לרעש (SNR) יורד כאשר האותות המתקבלים מרקמה שלמה מאז סומה של תאי העצב ממוקמים עמוקה יותר לתוך הרקמה. מערכי אלקטרודה microelectrode עם יחס רוחב-גובה גבוה נדרשים כדי לשפר את יחס האות לרעש.
ברוח זו, מערך microelectrode חודר (PMEA) פותח במעבדה שלנו, ומספק את היכולת לחקור ישירות לתוך הרקמות על ידי הוספת 64 קוצים בקוטר של 20 מיקרומטר וגובה של 200 מיקרומטר להיפוקמפוס פרש 7,13 . יש מערך microelectrode זה SNR גבוה יותר בהשוואה להדמית הצבע רגישה המתח ויחס האות לרעש נותר יציבה במהלך ניסוי 7,13. השילוב של ההכנה בהיפוקמפוס המקופלת וPMEA מספק דרך חדשה להשקיעIgate ההתפשטות העצבית על מטוס דו-ממדי. ניסויים באמצעות טכניקה זו כבר הניבו תוצאות משמעותיות על המנגנונים של התפשטות אות עצבית בהיפוקמפוס לפי פעילות עצבית יכולה להפיץ באופן עצמאי של סינפסות הסינפטי או חשמלית 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפיתוח של תכשיר היפוקמפוס המקופל, שבו צירי האורך ורוחב של ההיפוקמפוס נשמרים בשילוב עם מערך microelectrode חודר, מספק כלי רב עוצמה כדי לחקור את קשרי האנטומיה או התפשטות עצבית בהיפוקמפוס 7. הליך התגלגלות גם לגבי ללימוד היפוקמפוס בעכברים בוגרים. מחקרים שנעשה לאחרונה עם ה…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health (National Institute of Neurological Disorders and Stroke) Grant 1R01NS060757-01 and by the E.L. Lindseth endowed chair to Dominique M. Durand. We thank Dr. Andrew M. Rollins’ laboratory for the help on the OCT imaging.
Materials
| desiccator jar | LABRECYCLERS Inc. | 5410 | Place regular paper towels at the bottome of the jar for animal anesthesia use. |
| A blade and Custome made surgical stage for unfolding hippocampus | N/A | N/A | A petri dish is place upside down (in the center) in the ice with a wet filter paper place on top of it. |
| Custom made tissue recovery chamber | N/A | N/A | Plastic tubes were glued with plastic mesh at the bottom and bubbled with 95% O2/ 5% CO2 in the aCSF. |
| Straight Operating Scissors | Fisher Scientific | S17336B Medco Instruments No.:81995 | This scissors is used to decapitate the mice. |
| Integra Miltex Goldman-Fox Scissors | Fisher Scientific | 12-460-517 MILTEX INC No.:5-SC-320 | This scissors is used to cut the skull of the mice. |
| Miltex Hysterectomy Forceps |
Claflin Medical equipment | CESS-722033-00001 | This Forceps is used to peel the cut skull to expose the brain |
| Micro Spatula | Cardinal Health | This micro spatula is used to tranfer the whole brain of a semisphere into the recorering chamber. | |
| Frey Scientific Stainless Steel Semi-Micro Spatula | Cardinal Health | this semi micro spatula is used to tranfer the unfolded hippocampus into the glucose aCSF in the recovering chamber. | |
| small paint brush | Lowe's | tem #: 105657 Model #: 90219 | The one with the smallest size in a normal paint brush package |
| Fire polished glass help tool | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
| Custom made glass needle | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
| Custom made glass tool with a metal wire loop | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes with a reshaped metal wire loop. |
| Custom made glass solution dropper | N/A | N/A | This tool was made from the regular Pasteur glass pipettes with its tips cut and a rubber head attached with the cut end. |
| Custom made tissue anchor | N/A | N/A | Nylon fiber mesh was glued on a insulated copper wire ring. The tissue anchor was hold by an micromanipulator. |
| Custom fabricated microelectrode array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
| Custom made filter and amplifiers circuits for the array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
| Data acquisition processor 3400a | Microstar Laboratories | N/A | This is a complete data acquisition system with A/D converter. |
Referencias
- Richardson, K. A., Schiff, S. J., Gluckman, B. J. Control of traveling waves in the Mammalian cortex. Phys Rev Lett. 94 (2), 028103-028112 (2005).
- Luhmann, H. J., Dzhala, V. I., Ben-Ari, Y. Generation and propagation of 4-AP-induced epileptiform activity in neonatal intact limbic structures in vitro. Eur J Neurosci. 12 (8), 2757-2768 (2000).
- Grinvald, A., Manker, A., Segal, M. Visualization of the spread of electrical activity in rat hippocampal slices by voltage-sensitive optical probes. J Physiol. 333, 269-291 (1982).
- Gloveli, T., et al. Orthogonal arrangement of rhythm-generating microcircuits in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (37), 13295-13300 (2005).
- Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neurociencias. 31 (3), 571-591 (1989).
- Albani, S. H., McHail, D. G., Dumas, T. C. Developmental studies of the hippocampus and hippocampal-dependent behaviors: insights from interdisciplinary studies and tips for new investigators. Neurosci Biobehav Rev. 43, 183-190 (2014).
- Zhang, M., et al. Propagation of Epileptiform Activity Can Be Independent of Synaptic Transmission, Gap Junctions, or Diffusion and Is Consistent with Electrical Field Transmission. J Neurosci. 34 (4), 1409-1419 (2014).
- Kibler, A. B., Durand, D. M. Orthogonal wave propagation of epileptiform activity in the planar mouse hippocampus in vitro. Epilepsia. 52 (9), 1590-1600 (2011).
- Wang, D., McMahon, S., Zhang, Z., Jackson, M. B. Hybrid voltage sensor imaging of electrical activity from neurons in hippocampal slices from transgenic mice. J Neurophysiol. 108 (11), 3147-3160 (2012).
- Wingenfeld, K., Wolf, O. T. Stress , memory, the hippocampus. Front Neurol Neurosci. 34, 109-121 (2014).
- Liu, J. S., et al. Spatiotemporal dynamics of high-K+-induced epileptiform discharges in hippocampal slice and the effects of valproate. Neurosci Bull. 29 (1), 28-36 (2013).
- Oka, H., Shimono, K., Ogawa, R., Sugihara, H., Taketani, M. A new planar multielectrode array for extracellular recording: application to hippocampal acute slice. J Neurosci Methods. 93, 61-68 (1999).
- Kibler, A. B., Jamieson, B. G., Durand, D. M. A high aspect ratio microelectrode array for mapping neural activity in vitro. J Neurosci Methods. 204 (2), 296-305 (2012).
- Schechter, L. E. The potassium channel blockers 4-aminopyridine and tetraethylammonium increase the spontaneous basal release of [3H]5-hydroxytryptamine in rat hippocampal slices. J Pharmacol Exp Ther. 282 (1), 262-270 (1997).
- Perreault, P., Avoli, M. 4-aminopyridine-induced epileptiform activity and a GABA-mediated long-lasting depolarization in the rat hippocampus. J Neurosci. 12 (1), 104-115 (1992).
- Chesnut, T. J., Swann, J. W. Epileptiform activity induced by 4-aminopyridine in immature hippocampus. Epilepsy Res. 2 (3), 187-195 (1988).
- Nam, Y., Wheeler, B. C. In Vitro Microelectrode Array Technology and Neural Recordings. Crit Rev Biomed Eng. 39 (1), 45-62 (2011).
- Gonzalez-Sulser, A., et al. Hippocampal neuron firing and local field potentials in the in vitro 4-aminopyridine epilepsy model. J Neurophysiol. 108 (9), 2568-2580 (2012).
