Neuronale Aktivitätsausbreitung in einem ungefalteten Hippocampus Vorbereitung mit einem durchdringenden Mikroelektroden-Array
Summary
Wir haben einen in vitro ungefalteten Hippocampus die CA1-CA3 Anordnung von Neuronen bewahrt entwickelt. In Kombination mit der durchdringenden Mikroelektrodenanordnung kann die neuronale Aktivität in sowohl der Längs- und Querrichtungen überwacht werden. Diese Methode bietet Vorteile gegenüber hippocampalen Schnittpräparaten, wie die Ausbreitung im gesamten Hippocampus gleichzeitig aufgenommen werden.
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines neuen in vitro Flach Hippocampus Zubereitung in Kombination mit einer mikrobearbeiteten Array auf neuronale Aktivität Karte im Hippocampus. Die Querschnittpräparat Hippocampus ist die häufigste Gewebeaufbereitung zu Hippocampus Elektrophysiologie zu studieren. Eine Längshippocampusschnitt wurde um Längsverbindungen im Hippocampus untersuchen entwickelt. Die intakten Hippocampus der Maus kann auch in vitro aufrechterhalten werden, weil seine Dicke gestattet ausreichende Sauerstoffdiffusion. Allerdings sind diese drei Zubereitungen, bieten direkten Zugriff auf neuronale Ausbreitung da ein Teil des Gewebes ist nicht vorhanden oder gefaltet. Die abgewickelte intakten Hippocampus bietet sowohl Quer- und Längsverbindungen in einer flachen Konfiguration für den direkten Zugang zu dem Gewebe, das volle Ausmaß der Signalausbreitung im Hippocampus in vitro analysiert. Um die neuronale Aktivität von t wirksam zu überwachener Zellschicht, eine maßgeschneiderte dringenden Mikroelektrodenarrays (PMEA) wurde hergestellt und in die entfaltete Hippocampus angewendet. Die PMEA mit 64 Elektroden von 200 um in der Höhe könnte neuronale Aktivität tief in Hippokampus der Maus aufzeichnen. Die einzigartige Kombination von einem ungefalteten hippocampalen Präparat und PMEA stellt ein neues in vitro-Werkzeug, um die Geschwindigkeit und die Richtung der Ausbreitung der Nervenaktivität in der zweidimensionalen CA1-CA3 Hippocampus Regionen mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis zu untersuchen.
Introduction
Das Verständnis der neuronalen Leitungs oder eine Ausbreitung einer neuronalen Signale ist für die Bestimmung des Mechanismus der neuronalen Kommunikation sowohl in der normalen Funktion und pathologischen Zuständen im Gehirn 1-3. Der Hippocampus ist eine der am besten untersuchten Strukturen im Gehirn, da sie wesentliche Rolle spielt in verschiedenen Gehirnfunktionen wie Speicher und räumliche Verfolgung und ist in mehreren pathologischen Veränderungen, die dramatisch beeinflussen Verhalten sowie 1,6 beteiligt. Zwar weist der Hippocampus eine komplexe Organisation, können die verschiedenen Elemente der Struktur leicht identifiziert und im Schnittpräparat 4-6 aufgerufen werden. In der Querrichtung des Hippocampus wird die neuronale Aktivität bekannt, durch das tri-synaptischen Weg, Gyrus dentatus (DG), CA3, CA1 andsubiculum 4,5 aufweisen ausbreiten. Es wird angenommen, dass die synaptische Übertragung und axonalen Leitungs spielen eine wichtige Rolle für die Kommunikatiauf in dieser Querschluss 4,6. Jedoch Ausbreitungs neuronalen Signals findet in sowohl Quer- als auch Längsrichtungen 4,6. Dies impliziert, dass der Hippocampus nicht vollständig durch Verwendung Schnittpräparate, die die Beobachtung zu einer bestimmten Ausbreitungsrichtung 4 begrenzen sucht werden. Die Längs Scheibe wurde entwickelt, um die axonalen Bahnen entlang der Längsachse 5 zu untersuchen. Forscher haben Verhalten spezifischen gamma und theta Schwingungen vorwiegend entlang der Quer- und Längsachsen jeweils 6 beobachtet. Diese Verhaltensweisen wurden getrennt untersucht, aber gleichzeitigen Zugriff auf beide Richtungen ist von entscheidender Bedeutung, um dieses Verhalten zu verstehen. Auch bei der Entwicklung des intakten Hippocampus Herstellung ist es schwierig, die Ausbreitung über den gesamten Gewebes infolge gefalteten Struktur des Hippocampus 4 überwachen. Die entfaltete Hippocampus bietet Zugriff auf die verpackt Neuronenin einer Form einer flachen Zellschicht 7,8 zweidimensional.
Durch Entfalten des Gyrus dentatus (DG) (Abbildung 1), der Hippocampus nimmt eine abgeflachte Form mit einer rechteckigen Konfiguration, in welcher sowohl Quer- und Längsverbindungen intakt mit der pyramidalen Zellschicht in einer zweidimensionalen Platte, die sowohl CA3 und CA1 angeordnet zu bleiben, wobei ein Flachstück Nervengewebe, die verwendet werden können, um neuronale Ausbreitungs untersuchen (Figur 2) 8. Neuronale Aktivität kann dann mit einzelnen Glaspipetten Mikroelektrodenarrays, Stimulationselektroden sowie spannungsempfindlichen Farbstoffen (VSD) 3,7,8 überwacht werden. Zusätzlich können genetisch kodierte Spannungsanzeige aus transgenen Mäusen verwendet, um die Ausbreitungsmuster 9 verfolgen.
Die flache Konfiguration des ungefalteten hippocampalen Netzwerk für optische Aufzeichnungsverfahren, sondern auch für eine Mikroelektrodenanordnung geeignet. Most der im Handel erhältlichen Arrays werden mit ebenen oder flachen Elektroden hergestellt und kann die neuronale Aktivität in beiden Gewebeschnitten und kultivierten Neuronen 10-12 aufzeichnen. Das Signal-zu-Rausch-Verhältnis (SNR) verringert sich jedoch, wenn die Signale von einem intakten Gewebe erhalten werden, da das Soma der Neuronen befinden tiefer in das Gewebe. Mikroelektrodenanordnungen mit hohen Aspektverhältnissen erforderlich sind, um das SNR zu verbessern.
Zu diesem Zweck ist eine durchdringende Mikroelektroden-Anordnung (PMEA) in unserem Labor entwickelt worden sind, und bietet die Möglichkeit, direkt in die Gewebeprobe durch Einführen 64 Spitzen mit einem Durchmesser von 20 & mgr; m und einer Höhe von 200 um in der aufgeklappten Hippocampus 7,13 . Das Mikroelektrodenanordnung eine höhere SNR im Vergleich zu der spannungsempfindlichen Farbstoff-Bildgebung und die SNR bleibt während eines Experiments 7,13 stabil. Die Kombination des ungefalteten hippocampalen Präparat und PMEA bietet einen neuen Weg zu investierenIgate das neuronale Ausbreitung über einer zweidimensionalen Ebene. Experimente mit dieser Technik bereits erbrachte wichtige Ergebnisse über die Mechanismen der neuronalen Signalausbreitung im Hippocampus, wobei die neuronale Aktivität kann unabhängig von synaptischen oder elektrischen Synapsen 7 verbreiten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Entwicklung des ungefalteten Hippocampus Zubereitung, wobei die Längs- und Querachse des Hippocampus in Kombination mit einem durchdringenden Mikroelektrodenanordnung erhalten, stellt ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Anatomie Verbindungen oder neuronale Ausbreitung im Hippocampus 7 zu untersuchen. Diese sich entfaltenden Verfahren ist auch für das Studium Hippocampus in erwachsenen Mäusen. Jüngste Studien mit diesem Präparat zeigten, daß das 4-AP-induzierte epileptiforme Aktivität kann mit ei…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health (National Institute of Neurological Disorders and Stroke) Grant 1R01NS060757-01 and by the E.L. Lindseth endowed chair to Dominique M. Durand. We thank Dr. Andrew M. Rollins’ laboratory for the help on the OCT imaging.
Materials
| desiccator jar | LABRECYCLERS Inc. | 5410 | Place regular paper towels at the bottome of the jar for animal anesthesia use. |
| A blade and Custome made surgical stage for unfolding hippocampus | N/A | N/A | A petri dish is place upside down (in the center) in the ice with a wet filter paper place on top of it. |
| Custom made tissue recovery chamber | N/A | N/A | Plastic tubes were glued with plastic mesh at the bottom and bubbled with 95% O2/ 5% CO2 in the aCSF. |
| Straight Operating Scissors | Fisher Scientific | S17336B Medco Instruments No.:81995 | This scissors is used to decapitate the mice. |
| Integra Miltex Goldman-Fox Scissors | Fisher Scientific | 12-460-517 MILTEX INC No.:5-SC-320 | This scissors is used to cut the skull of the mice. |
| Miltex Hysterectomy Forceps |
Claflin Medical equipment | CESS-722033-00001 | This Forceps is used to peel the cut skull to expose the brain |
| Micro Spatula | Cardinal Health | This micro spatula is used to tranfer the whole brain of a semisphere into the recorering chamber. | |
| Frey Scientific Stainless Steel Semi-Micro Spatula | Cardinal Health | this semi micro spatula is used to tranfer the unfolded hippocampus into the glucose aCSF in the recovering chamber. | |
| small paint brush | Lowe's | tem #: 105657 Model #: 90219 | The one with the smallest size in a normal paint brush package |
| Fire polished glass help tool | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
| Custom made glass needle | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
| Custom made glass tool with a metal wire loop | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes with a reshaped metal wire loop. |
| Custom made glass solution dropper | N/A | N/A | This tool was made from the regular Pasteur glass pipettes with its tips cut and a rubber head attached with the cut end. |
| Custom made tissue anchor | N/A | N/A | Nylon fiber mesh was glued on a insulated copper wire ring. The tissue anchor was hold by an micromanipulator. |
| Custom fabricated microelectrode array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
| Custom made filter and amplifiers circuits for the array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
| Data acquisition processor 3400a | Microstar Laboratories | N/A | This is a complete data acquisition system with A/D converter. |
Referencias
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