Neurale activiteit Voortplanting in een Uitgeklapt hippocampus Voorbereiding met een doordringende micro elektrode-array
Summary
We hebben een in vitro ongevouwen hippocampus die CA1-CA3 reeks van neuronen behoudt ontwikkeld. Gecombineerd met de penetrerende micro elektrode-array, kunnen neurale activiteit worden gevolgd in zowel de longitudinale als transversale richtingen. Deze werkwijze verschaft voordelen boven hippocampus slice preparaat als voortplanting in de gehele hippocampus gelijktijdig kunnen worden opgenomen.
Abstract
Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het bereiden van een nieuw in vitro flat hippocampus preparaat in combinatie met een micro-bewerkte array neurale activiteit in kaart in de hippocampus. De dwarse hippocampus slice voorbereiding is de meest voorkomende voorbereiding weefsel om hippocampus elektrofysiologie studeren. Een longitudinale hippocampus plak werd ontwikkeld om longitudinale verbindingen in de hippocampus onderzoeken. De intacte muis hippocampus kan ook worden gehandhaafd in vitro vanwege zijn dikte maakt voldoende zuurstof diffusie. Echter, deze drie bereidingen geen directe toegang tot neurale voortplanting omdat sommige van het weefsel ontbreekt of gevouwen. Ongevouwen intacte hippocampus levert zowel transversale als longitudinale verbindingen in een vlakke configuratie voor directe toegang tot het weefsel analyseren de volle omvang van signaalvoortplanting in de hippocampus in vitro. Om effectief toezicht op de neurale activiteit van tHij cellaag, een maat penetrerende micro-elektrode array (PMEA) werd vervaardigd en toegepast op de ongevouwen hippocampus. De PMEA met 64 elektroden van 200 micrometer in de hoogte kon neurale activiteit diep binnenin de muis hippocampus opnemen. De unieke combinatie van een ongevouwen hippocampus opstellen en PMEA verschaft een nieuwe in vitro hulpmiddel om de snelheid en de voortplantingsrichting van de neurale activiteit in de tweedimensionale CA1-CA3 gebieden van de hippocampus studie met een hoge signaal-ruisverhouding.
Introduction
Inzicht in de neurale geleiding of voortplanting van neurale signalen is cruciaal voor het bepalen van het mechanisme van neuronale communicatie in zowel de normale functie en pathologie hersenen 1-3. De hippocampus is een van de meest uitgebreid bestudeerde structuren in de hersenen omdat speelt fundamentele rol in diverse hersenfuncties zoals geheugen en ruimtelijk volgen en is betrokken bij verscheidene pathologische veranderingen dramatisch effect functie en 1,6. Hoewel, de hippocampus vertoont een complexe organisatie, kunnen de verschillende elementen van de structuur gemakkelijk worden geïdentificeerd en toegankelijk in de slice voorbereiding 4-6. In de dwarsrichting van de hippocampus, is neurale activiteit bekend voortplanten door de tri-synaptische traject dat de gyrus dentatus (DG), CA3, CA1 andsubiculum 4,5 omvatten. Er wordt aangenomen dat de synaptische transmissie en axonale geleiding spelen een belangrijke rol voor de plaatselijke communicatiein deze dwarse circuit 4,6. Echter, vermeerdering van neurale signaal vindt plaats in zowel dwars- als lengterichting 4,6. Dit betekent dat de hippocampus niet volledig kan worden onderzocht door gebruik slice preparaten die de waarneming van een bepaalde voortplantingsrichting 4 beperken. De longitudinale plak werd ontwikkeld om de axonale paden langs de langsas 5 onderzoeken. Onderzoekers hebben het gedrag van specifieke gamma en theta-oscillaties waargenomen voornamelijk langs de transversale en longitudinale assen respectievelijk 6. Deze gedragingen zijn afzonderlijk onderzocht, maar toch gelijktijdige toegang tot beide richtingen is cruciaal om dit gedrag te begrijpen. Zelfs met de ontwikkeling van de intacte hippocampus preparaat, is het moeilijk om de propagatie in het gehele weefsel toezicht door de gevouwen structuur van de hippocampus 4. Ongevouwen hippocampus geeft toegang tot de verpakte neuronenin de vorm van een platte tweedimensionale cellaag 7,8.
Door het uitvouwen van de dentate gyrus (DG) (figuur 1), de hippocampus neemt een afgeplatte vorm met een rechthoekige configuratie waarin zowel transversale als longitudinale verbindingen intact met de piramidale cellaag gerangschikt in een tweedimensionale plaat die zowel CA3 en CA1 blijven, waardoor een plat stuk neuraal weefsel dat kan worden gebruikt om neurale vermeerdering onderzoeken (figuur 2) 8. Neurale activiteit kan vervolgens worden gevolgd met afzonderlijke glazen pipetten, micro-elektrode arrays, prikkelelektroden, evenals spanningsgevoelige kleurstoffen (VSD) 3,7,8. Bovendien kunnen genetisch gecodeerde voltageindicator uit transgene muizen worden gebruikt voor de vermeerdering patroon 9 te volgen.
De vlakke configuratie van het ongevouwen hippocampus netwerk geschikt voor optische registratie werkwijze, maar ook in een micro-elektrode array. Most van de commercieel beschikbare arrays worden gefabriceerd met een vlakke of low profile elektroden en kan neurale activiteit opnemen in zowel weefsel plakjes en gekweekte neuronen 10-12. De signaal-ruisverhouding (SNR) afneemt wanneer de signalen worden verkregen van een intact weefsel, aangezien de soma van de neuronen worden dieper in het weefsel bevindt. Micro-elektrode elektrode arrays met een hoge aspect ratio's zijn nodig om de SNR te verbeteren.
Daartoe heeft een indringende micro-elektrode array (PMEA) ontwikkeld in ons laboratorium, en biedt de mogelijkheid om direct sonde in het weefsel door het invoegen van 64 spikes met een diameter van 20 urn en hoogte van 200 urn in de ongevouwen hippocampus 7,13 . Deze micro-elektrode array hogere SNR vergeleken met de spanningsgevoelige kleurstof beeldvorming en de SNR blijft gedurende een experiment 7,13. De combinatie van het ongevouwen hippocampus opstellen en PMEA verschaft een nieuwe manier om te investereniGate de neurale propagatie over een tweedimensionaal vlak. Experimenten met deze techniek hebben al belangrijke resultaten over de mechanismen van neurale signaalvoortplanting in de hippocampus, waarbij neurale activiteit onafhankelijk van synaptische of elektrische synapsen 7 kunnen voortplanten opgeleverd.
Protocol
Representative Results
Discussion
De ontwikkeling van het ongevouwen hippocampus preparaat, waarbij de longitudinale en transversale assen van de hippocampus worden bewaard in combinatie met een penetrerende micro-elektrode array, een krachtig hulpmiddel om de anatomie aansluitingen of neurale propagatie in de hippocampus 7 onderzoeken. Dit ontvouwen procedure ook voor het bestuderen van de hippocampus bij volwassen muizen. Recente studies met dit preparaat bleek dat de 4-AP-geïnduceerde epileptische activiteit kan voortplanten met een diago…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health (National Institute of Neurological Disorders and Stroke) Grant 1R01NS060757-01 and by the E.L. Lindseth endowed chair to Dominique M. Durand. We thank Dr. Andrew M. Rollins’ laboratory for the help on the OCT imaging.
Materials
| desiccator jar | LABRECYCLERS Inc. | 5410 | Place regular paper towels at the bottome of the jar for animal anesthesia use. |
| A blade and Custome made surgical stage for unfolding hippocampus | N/A | N/A | A petri dish is place upside down (in the center) in the ice with a wet filter paper place on top of it. |
| Custom made tissue recovery chamber | N/A | N/A | Plastic tubes were glued with plastic mesh at the bottom and bubbled with 95% O2/ 5% CO2 in the aCSF. |
| Straight Operating Scissors | Fisher Scientific | S17336B Medco Instruments No.:81995 | This scissors is used to decapitate the mice. |
| Integra Miltex Goldman-Fox Scissors | Fisher Scientific | 12-460-517 MILTEX INC No.:5-SC-320 | This scissors is used to cut the skull of the mice. |
| Miltex Hysterectomy Forceps |
Claflin Medical equipment | CESS-722033-00001 | This Forceps is used to peel the cut skull to expose the brain |
| Micro Spatula | Cardinal Health | This micro spatula is used to tranfer the whole brain of a semisphere into the recorering chamber. | |
| Frey Scientific Stainless Steel Semi-Micro Spatula | Cardinal Health | this semi micro spatula is used to tranfer the unfolded hippocampus into the glucose aCSF in the recovering chamber. | |
| small paint brush | Lowe's | tem #: 105657 Model #: 90219 | The one with the smallest size in a normal paint brush package |
| Fire polished glass help tool | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
| Custom made glass needle | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
| Custom made glass tool with a metal wire loop | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes with a reshaped metal wire loop. |
| Custom made glass solution dropper | N/A | N/A | This tool was made from the regular Pasteur glass pipettes with its tips cut and a rubber head attached with the cut end. |
| Custom made tissue anchor | N/A | N/A | Nylon fiber mesh was glued on a insulated copper wire ring. The tissue anchor was hold by an micromanipulator. |
| Custom fabricated microelectrode array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
| Custom made filter and amplifiers circuits for the array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
| Data acquisition processor 3400a | Microstar Laboratories | N/A | This is a complete data acquisition system with A/D converter. |
Referencias
- Richardson, K. A., Schiff, S. J., Gluckman, B. J. Control of traveling waves in the Mammalian cortex. Phys Rev Lett. 94 (2), 028103-028112 (2005).
- Luhmann, H. J., Dzhala, V. I., Ben-Ari, Y. Generation and propagation of 4-AP-induced epileptiform activity in neonatal intact limbic structures in vitro. Eur J Neurosci. 12 (8), 2757-2768 (2000).
- Grinvald, A., Manker, A., Segal, M. Visualization of the spread of electrical activity in rat hippocampal slices by voltage-sensitive optical probes. J Physiol. 333, 269-291 (1982).
- Gloveli, T., et al. Orthogonal arrangement of rhythm-generating microcircuits in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (37), 13295-13300 (2005).
- Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neurociencias. 31 (3), 571-591 (1989).
- Albani, S. H., McHail, D. G., Dumas, T. C. Developmental studies of the hippocampus and hippocampal-dependent behaviors: insights from interdisciplinary studies and tips for new investigators. Neurosci Biobehav Rev. 43, 183-190 (2014).
- Zhang, M., et al. Propagation of Epileptiform Activity Can Be Independent of Synaptic Transmission, Gap Junctions, or Diffusion and Is Consistent with Electrical Field Transmission. J Neurosci. 34 (4), 1409-1419 (2014).
- Kibler, A. B., Durand, D. M. Orthogonal wave propagation of epileptiform activity in the planar mouse hippocampus in vitro. Epilepsia. 52 (9), 1590-1600 (2011).
- Wang, D., McMahon, S., Zhang, Z., Jackson, M. B. Hybrid voltage sensor imaging of electrical activity from neurons in hippocampal slices from transgenic mice. J Neurophysiol. 108 (11), 3147-3160 (2012).
- Wingenfeld, K., Wolf, O. T. Stress , memory, the hippocampus. Front Neurol Neurosci. 34, 109-121 (2014).
- Liu, J. S., et al. Spatiotemporal dynamics of high-K+-induced epileptiform discharges in hippocampal slice and the effects of valproate. Neurosci Bull. 29 (1), 28-36 (2013).
- Oka, H., Shimono, K., Ogawa, R., Sugihara, H., Taketani, M. A new planar multielectrode array for extracellular recording: application to hippocampal acute slice. J Neurosci Methods. 93, 61-68 (1999).
- Kibler, A. B., Jamieson, B. G., Durand, D. M. A high aspect ratio microelectrode array for mapping neural activity in vitro. J Neurosci Methods. 204 (2), 296-305 (2012).
- Schechter, L. E. The potassium channel blockers 4-aminopyridine and tetraethylammonium increase the spontaneous basal release of [3H]5-hydroxytryptamine in rat hippocampal slices. J Pharmacol Exp Ther. 282 (1), 262-270 (1997).
- Perreault, P., Avoli, M. 4-aminopyridine-induced epileptiform activity and a GABA-mediated long-lasting depolarization in the rat hippocampus. J Neurosci. 12 (1), 104-115 (1992).
- Chesnut, T. J., Swann, J. W. Epileptiform activity induced by 4-aminopyridine in immature hippocampus. Epilepsy Res. 2 (3), 187-195 (1988).
- Nam, Y., Wheeler, B. C. In Vitro Microelectrode Array Technology and Neural Recordings. Crit Rev Biomed Eng. 39 (1), 45-62 (2011).
- Gonzalez-Sulser, A., et al. Hippocampal neuron firing and local field potentials in the in vitro 4-aminopyridine epilepsy model. J Neurophysiol. 108 (9), 2568-2580 (2012).
