Vi har udviklet en in vitro udfoldet hippocampus som bevarer CA1-CA3 vifte af neuroner. Kombineret med gennemtrængende mikroelektrode array, kan neurale aktivitet overvåges i både langsgående og tværgående retninger. Denne metode giver fordele i forhold til hippocampus skive præparater som spredning i hele hippocampus kan registreres samtidigt.
Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til fremstilling af en ny in vitro flad hippocampus præparat kombineres med en mikro-bearbejdet matrix til kort neurale aktivitet i hippocampus. Den tværgående hippocampale skive forberedelse er den mest almindelige vævspræparat at studere hippocampus elektrofysiologi. En langsgående hippocampus skive blev også udviklet for at undersøge langsgående forbindelser i hippocampus. De intakte musehippocampus kan også holdes in vitro, fordi dens tykkelse giver tilstrækkelig ilt diffusion. Men disse tre præparater ikke giver direkte adgang til neurale formering, da nogle af vævet enten mangler eller er foldet. Udfoldet intakt hippocampus giver både tværgående og langsgående forbindelser i en flad konfiguration for direkte adgang til vævet til at analysere det fulde omfang af signaludbredelse i hippocampus in vitro. For effektivt at overvåge den neurale aktivitet fra than cellelag, en skræddersyet gennemtrængende mikroelektrode array (PMEA) blev fremstillet og anvendt til den udfoldede hippocampus. Den PMEA med 64 elektroder på 200 um i højden kunne optage neurale aktivitet dybt inde i musen hippocampus. Den unikke kombination af en udfoldet hippocampus forberedelse og PMEA giver en ny in vitro-værktøj til at studere hastighed og retning for spredning af neurale aktivitet i den todimensionale CA1-CA3 regioner i hippocampus med et højt signal-støj-forholdet.
Forståelse af neurale ledning eller formering af neurale signaler er afgørende for bestemmelse af mekanismen for neurale kommunikation i både den normale funktion og patologiske tilstande i hjernen 1-3. Hippocampus er en af de mest omfattende undersøgt strukturer i hjernen, da det spiller afgørende rolle i flere hjernefunktioner såsom hukommelse, og rumlig sporing og er involveret i flere patologiske ændringer, der dramatisk indflydelse adfærd og 1,6. Selv hippocampus udviser en kompleks organisation, kan de forskellige elementer i strukturen let identificeres og tilgås i skive forberedelse 4-6. I den tværgående retning af hippocampus, er neurale aktivitet vides at udbrede sig gennem tri-synaptisk pathway som omfatter gyrus dentatus (GD), CA3, CA1 andsubiculum 4,5. Det menes, at synaptisk transmission og axonal ledning spiller en stor rolle for communicatipå i denne tværgående kredsløb 4,6. Men udbredelsen af neural signal foregår i både tværgående og langsgående retning 4,6. Dette indebærer, at hippocampus ikke kan undersøges fuldt ud ved hjælp af slice præparater, der begrænser observation til en bestemt retning af formering 4. Den langsgående skive blev udviklet for at undersøge axonale veje langs den langsgående akse 5. Forskere har observeret adfærd-specifikke gamma og theta svingninger hovedsageligt langs den tværgående og langsgående akser henholdsvis 6. Disse adfærdsmønstre er blevet undersøgt separat, men samtidig adgang til begge retninger er afgørende at forstå disse adfærdsmønstre. Selv med udviklingen af det intakte hippocampus forberedelse, er det vanskeligt at overvåge udbredelsen hele væv på grund af den foldede struktur af hippocampus 4. Den udfoldede hippocampus giver adgang til de pakkede neuroneri form af en flad todimensional cellelag 7,8.
Ved udfoldning af gyrus dentatus (GD) (figur 1), hippocampus vedtager en udfladet form med en rektangulær konfiguration, hvor både tværgående og langsgående forbindelser forbliver intakt med det pyramideformede cellelag anbragt i et todimensionalt ark, der indeholder både CA3 og CA1, efterlader et fladt stykke af neuralt væv, der kan anvendes til at undersøge neural formering (figur 2) 8. Neural aktivitet kan derefter overvåges med individuelle glas pipetter, mikroelektrode-arrays, stimulerende elektroder, samt spænding følsomme farvestoffer (VSD) 3,7,8. Desuden kan genetisk kodet spænding indikator fra transgene mus anvendes til at spore formering mønster 9.
Den flade udformning af den udfoldede hippocampus netværk er velegnet til optisk metode optagelse, men også for en mikroelektrode array. Most af de kommercielt tilgængelige arrays er fremstillet med flade eller lavprofil elektroder og kan optage neurale aktivitet i både vævssnit og dyrkede neuroner 10-12. , Signal-til-støj-forhold (SNR) formindskes imidlertid når signalerne opnås fra en intakt væv siden soma af neuroner er placeret dybere ind i vævet. Mikroelektrode elektrode arrays med høje formatforhold er forpligtet til at forbedre SNR.
Til dette formål har en gennemtrængende mikroelektrode array (PMEA) blevet udviklet i vores laboratorium, og giver mulighed for direkte at sondere i vævet ved at indsætte 64 spikes med en diameter på 20 um og højde på 200 um i udfoldede hippocampus 7,13 . Denne mikroelektrode array er højere SNR forhold til spændingen farvestof billedbehandling og SNR forbliver stabil under et eksperiment 7,13. Kombinationen af den udfoldede hippocampale forberedelsen og PMEA tilvejebringer en ny måde at investereIgate neurale formering i et todimensionalt plan. Eksperimenter med denne teknik har allerede givet betydelige resultater om mekanismerne i neurale signaludbredelse i hippocampus, hvorved neurale aktivitet kan udbrede uafhængigt af synaptiske eller elektriske synapser 7.
Udviklingen af den udfoldede hippocampus forberedelse, hvor de langsgående og tværgående akser hippocampus er bevaret i kombination med en gennemtrængende mikroelektrode array, giver et stærkt værktøj til at undersøge anatomi forbindelser eller neurale formering i hippocampus 7. Dette udfolder procedure gælder også for at studere hippocampus i voksne mus. Nylige undersøgelser med dette præparat viste, at 4-AP-induceret epileptiform aktivitet kunne forplanter sig med en diagonal bølgefront over he…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by National Institutes of Health (National Institute of Neurological Disorders and Stroke) Grant 1R01NS060757-01 and by the E.L. Lindseth endowed chair to Dominique M. Durand. We thank Dr. Andrew M. Rollins’ laboratory for the help on the OCT imaging.
desiccator jar | LABRECYCLERS Inc. | 5410 | Place regular paper towels at the bottome of the jar for animal anesthesia use. |
A blade and Custome made surgical stage for unfolding hippocampus | N/A | N/A | A petri dish is place upside down (in the center) in the ice with a wet filter paper place on top of it. |
Custom made tissue recovery chamber | N/A | N/A | Plastic tubes were glued with plastic mesh at the bottom and bubbled with 95% O2/ 5% CO2 in the aCSF. |
Straight Operating Scissors | Fisher Scientific | S17336B Medco Instruments No.:81995 | This scissors is used to decapitate the mice. |
Integra Miltex Goldman-Fox Scissors | Fisher Scientific | 12-460-517 MILTEX INC No.:5-SC-320 | This scissors is used to cut the skull of the mice. |
Miltex Hysterectomy Forceps |
Claflin Medical equipment | CESS-722033-00001 | This Forceps is used to peel the cut skull to expose the brain |
Micro Spatula | Cardinal Health | This micro spatula is used to tranfer the whole brain of a semisphere into the recorering chamber. | |
Frey Scientific Stainless Steel Semi-Micro Spatula | Cardinal Health | this semi micro spatula is used to tranfer the unfolded hippocampus into the glucose aCSF in the recovering chamber. | |
small paint brush | Lowe's | tem #: 105657 Model #: 90219 | The one with the smallest size in a normal paint brush package |
Fire polished glass help tool | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
Custom made glass needle | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
Custom made glass tool with a metal wire loop | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes with a reshaped metal wire loop. |
Custom made glass solution dropper | N/A | N/A | This tool was made from the regular Pasteur glass pipettes with its tips cut and a rubber head attached with the cut end. |
Custom made tissue anchor | N/A | N/A | Nylon fiber mesh was glued on a insulated copper wire ring. The tissue anchor was hold by an micromanipulator. |
Custom fabricated microelectrode array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
Custom made filter and amplifiers circuits for the array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
Data acquisition processor 3400a | Microstar Laboratories | N/A | This is a complete data acquisition system with A/D converter. |