Lymfocyt Isolering fra menneskehud for Fænotypisk Analyse og<em> Ex vivo</em> Cell Culture

Huden, som den primære grænseflade mellem kroppen og miljøet, giver den første linje i forsvaret mod ydre fysiske, kemiske og biologiske fornærmelser såsom såret, ultraviolet stråling og mikroorganismer. Hud omfatter to hovedrum, epidermis og dermis, og indeholder en række af immunceller, herunder Langerhans celler, makrofager, dendritiske celler (DC'er), og omkring 20 milliarder hukommelses-T-celler, næsten dobbelt så mange til stede i hele blodvolumen ^{1 , to.} En voksende mængde af data støtter den opfattelse, at huden har væsentlige immunologiske funktioner, både under vævshomeostase og i forskellige patologiske tilstande. Immunceller hjemmehørende i normal hud menes at gennemføre immunosurveillance ³ og er blevet vist at spille en rolle i udviklingen af inflammatoriske lidelser, såsom psoriasis ^4. I psoriatisk læsionale hud, både CD4 ⁺ og CD8 ⁺ T-celler infiltreret var observed og det blev vist, at forholdet mellem CD4 og CD8 varierer afhængigt af sygdomsstatus ^5. Men disse populationer af celler er vanskelige at undersøge, fordi eksisterende teknikker tillader isolering af kun få celler.

De for tiden udbredte teknikker til T-celle-isolation fra menneskehud kombinere mekanisk hud dissociation med enzymatisk behandling. Human hud biopsier er udførligt hakket og inkuberet med enzymer såsom trypsin, collagenase og / eller EDTA ^6-8. I betragtning af at huden er en barriere væv, som er meget modstandsdygtigt over for trækkræfter og mekanisk opdeling, de etablerede fremgangsmåder til T-celle-isolation produceret meget få celler, og endda lavere antal af levedygtige celler, hvilket gør ex vivo celledyrkning af disse cellepopulationer vanskelig og udfordrende.

Her rapporterer vi en modificeret metode til at isolere lymfocytter fra både sundt og involverede psoriasis menneskelig hud ved at kombinere mechanical dissociation af huden ved hjælp af en automatiseret væv dissociator stedet for den etablerede metode ekstensivt hakning, sammen med enzymatisk fordøjelse ved hjælp af collagenase. Forskellige levedygtige immuncelleundergrupper herunder DC'er og T-celler blev observeret efter fremstilling af en enkelt-cellesuspension. Vigtigere ekspressionen af ​​overflademarkører CD3, CD4 og CD8 blev godt bevaret. Således fremstillede celler, er klar til brug i ex vivo cellekulturer eller flowcytometrisk analyse. Denne protokol er blevet anvendt med held til analyse af enkelte hudbiopsier (4 mm) afledt fra læsionale hud med psoriasis. Resultaterne viste, at huden resident patient T-celler produceret mere inflammatoriske cytokiner såsom IL-17 og IFNy sammenlignet med raske frivillige ^9.