İleri Genetik tanımak makrofajlar kullanılarak Ekranlar<em> Toxoplasma gondii</em> Genler önemli direnç için IFN-γ-bağımlı hücre otonom bağışıklık

Toxoplasma gondii (T. gondii) zorunlu hücre içi, protozoa patojendir. Bu toksoplazmozis etkeni, bağışıklık sistemi baskılanmış kişilerde bir sağlık tehlikesi olduğunu. Ayrıca Cryptosporidium ve Cyclospora dahil insanları enfekte diğer apicomplexan patojenlerin model sistemidir. Toksoplazmozis en yaygın parazit bradyzoite veya Ookist sahne ile kontamine yiyecek veya su yenmesi yoluyla elde edilir. Yemeye bağlı olarak bu aşamalar konakçı hücreler içinde replike ve sistematik olarak yaymaktadır parazitin tachyzoite aşamasına dönüştürün. T-hücreleri, IFN-γ ve daha az bir ölçüde, nitrik oksit ^1-4'e, enfeksiyonun kontrol edilmesi için önemlidir, ancak takizoit bir bölümü olarak, hastalık yok etme yeteneğine sahip değildir doku kistlerinin içinde korunur bradyzoite aşamasına dönüştürmek Uzun ömürlü bir kronik enfeksiyon ile sonuçlanır. Aslında, hiçbir terapötik kronik kist s karşı etkili vardırHastalığın tage. Şiddetli toksoplazmozis birincil ve akut enfeksiyon hızla kopyalayan tachyzoite sahne özelliğine geri dönüştürme parazitin bradyzoite aşamasına nedeniyle kalıcı enfeksiyon reaktivasyonuna en sık olduğunu.

Doğuştan gelen bağışıklık yanıtının karşısında Erken yaşam parazit yeterli parazit numaralarını ulaşmak için, yanı sıra kronik enfeksiyon kurulmasını sağlamak için, uzak sitelere ulaşmak için izin önemlidir. T. gondii olasılıkla çoğaltmak ve enfeksiyon erken yaymak için onun yeteneğine katkıda konak savunma mekanizmaları ile mücadele stratejilerini gelişti. İlk olarak, T. gondii diğer hücre içi patojenlere ^5-9 kıyasla konak hücrenin endositik ve ekzositik süreçler büyük ölçüde ayrılmış olan parazit işgali sırasında benzersiz bir PV oluşturur. Ayrıca, tüm başarılı hücre içi patojenler T. gibi gondii f hoşgörülü bir ortam yaratmak için konak hücreye değiştirirya da büyüme. Bu hücre aktivasyonunu ^10-15 düzenleme için önemli olanlar da dahil olmak üzere, konakçı hücre transkripsiyon faktörlerinin değiştirerek yeniden programlama konakçı hücre gen ekspresyonunu içerir. ROP16 ^16-19 GRA15 ²⁰ GRA16 ²¹ ve GRA24 ²² tüm T ile enfekte olmuş konakçı hücrelerin kaskadlar transkripsiyon yanıtı düzenlemek ve hücre sinyal önemli olduğu gösterilmiştir gondii. Farklı fenotip ile parazit suşları arasındaki genetik haçlar kullanarak Son çalışmalar bağışıklıkla ilgili GTPases (IRGS) ^16,19,23-26 kaçırma da dahil olmak üzere parazit genotip-bağımlı özellikleri altında yatan parazit genlerin belirlenmesi oldukça verimli olmuştur. Çok virulent Tip I genotip sıçangil IRGS kaçınmak için mekanizmalar geliştirmiştir ise farelerde, bağışıklıkla ilgili GTPazlar (IRGS) Tip II ve kontrol parazit III genotip için önemlidir. Ancak, parazit antimikrobiyal medya kaçmasına mekanizmaları gelişti olduğu da açıktırbu mekanizmaların bazıları IRGS ve buna ek olarak ları parazit genotipleri ^27,28 boyunca muhafaza edilebilir. Buna ek olarak, çok az T. karşı hücre otonom bağışıklık kritik aracılarının hakkında bilinen İnsan toksoplazmozis sırasında gondii. Tachyzoite konukçu bağışıklık yanıtları ile tetiklenebilir dönüşüm bradyzoite için sırasında hücre otonom bağışıklık aracılarının direnç için önemli bir Parazit genler de hayatta kalmak için önemli olabilir. Örneğin, yüksek düzeyde nitrik oksit edilen enfekte olmuş makrofaj parazit kopyalanmasını bastırdığı, ancak, aynı zamanda kist üretimi ^30-32 sonuçlanan dönüşüm bradyzoite için tachyzoite uyarabilir.

ToxoDB T. için fonksiyonel bir genomik veritabanı gondii o topluluk açıklamaları da dahil olmak üzere yayınlanmış ve yayınlanmamış genomik ölçekli veri dizisi parazit genomunun için bilgi ve erişim sağlanması açısından alan için kritik bir kaynak olarak işlev, gen exp ression ve proteomik verileri ^33. Birçok Protozoal patojenlere benzer, genomun çoğunluğu potansiyel fonksiyonları içgörü sağlamak için gen homoloji dayalı hiçbir bilgi varsayımsal genlerin oluşur. Böylece, ileri genetik bağışıklık kaçırma, kist dönüşüm ve parazit patogenezinde yanı sıra farklı gelişim evreleri arasındaki dönüşüm için kritik diğer işlevler için önemli yeni parazit genleri tanımlamak için güçlü bir araçtır. Ileri genetik ek kuvveti bağışıklık kaçırma ve kist oluşumuna sahip patojenezindeki özgül görevler için önemli olan genler için bir parazit sorgulamak için göreceli olarak önyargılı bir yaklaşım olarak kullanılabilir olmasıdır. Mutasyon profil için yeni nesil dizileme son gelişmeler kimyasal ve sokma hem mutajenezin ^34-37 kullanarak ileri genetik çalışmalar sorumlu parazit genlerin belirlenmesi için seçim yöntemi yaptık.

ntent "> Özellikle de dirençli kist aşamasında karşı aktif olabilir bu. Bu amaçla doğru, in vitro kemirgen parazite karşı hücre özerk bağışıklık mekanizmalarının etkinliğini artırmak için kullanılabilir T. gondii güvenlik açıklarını tespit etmek önemlidir makrofaj enfeksiyonu ve aktivasyon modeli, özellikle saf makrofajlarda edilen enfekte olmuş makrofaj aktivasyonu, ancak şu T. gondii, uygunluk olumsuz parazit mutasyonlara tanımlamak amacıyla geliştirilmiştir. Bu makrofaj ekran için T. gondii, sokma mutantlan bir kütüphane sorgulamak için kullanılmıştır, sonuçta nitrik oksit ^27,28 direnç için önemli bir T. gondii, genlerin belirlenmesi. enfekte makrofajlar, nitrik oksit, özellikle belirgin bir duyarlılık aktivasyonuna bozulmuş dirençli T. gondii, mutantlarının bir panelinin izolasyon, tespit için ekranın yardımcı oldu direnç için önemli parazit genlerkemirgen IRGS ²⁸ için açıklanan direnç mekanizmaları dışında diğer hücre özerk bağışıklığın arabulucular için. Araya sokulan mutajenez teorik olarak rastgele her paraziti klonu mutasyonlar ve mutasyon site daha kolay tanımlama sınırlı sayıda üretilmesi açısından kimyasal mutagenez fazla avantajlara sahiptir. Bununla birlikte, T plasmid ekleme genomik yerinin tanımlama gondii sokma mutantlan, uygulamada, bir çok durumda ³⁷ şaşırtıcı bir şekilde zor olmuştur. Bir genin bir plasmid yerleştirilmesi aynı zamanda, tipik olarak, tek nükleotid değişiklikleri ile sonuçlanan kimyasal mutagenez aksine bir genin işlevini bozması muhtemeldir. Birden fazla tek nükleotid polimorfizmini oluşturur Ancak, kimyasal mutagenez, N-etil-N-nitroso üre (TRK) ya da etilmetan sülfonat (EMS) ya sahip (araya sokulan mutajenez ile karşılaştırıldığında, parazit genomunun büyük bir kısmının, daha yüksek bir yetenek sunabilir mutant ³⁴ başına 10 -100) tahmin, 38. Ayrıca, tüm genom profili son gelişmeler mümkün mutasyona uğramış bir parazitin ^34,38 tanımlanmış fenotip sorumlu en olası aday genleri tanımlamak için yeni nesil sıralama kullanmaya yaptı. Ne olursa olsun mutagenez yaklaşımı, makrofaj aktivasyonu direnç parazit geninin rolü onay sonuçta moleküler Koch önermeleri yerine getirmek için gen silme ve tamamlanmasını gerektirir.

parazit ve makrofaj hem genetik manipülasyonu vasıtasıyla bir genin işlevini incelemek yeteneği T. ileri genetik ile tanımlanan genlerin çoğu önemlidir gondii, hem de diğer patojenler halen bilinen fonksiyonlar ile başka proteinler için bir dizi homolojisi için çok az varsayımsal genler olarak karakterize edilir. Bu yazı, bir mutant içinde kesintiye uğramış gen, bir bilinen ya da direnç için önemli olup olmadığını tespit etmek için kullanılabilir, genel bir yaklaşımın ana hatlarıHücre özerk dokunulmazlık bilinmeyen aracısı. Ev sahibi antimikrobik faktörler ilk analiz, vahşi tip ve uyarılabilir nitrik oksit sintaz (iNOS), gp-91 pHOx (NADPH oksidaz) özel gen silme olanlara karşı vahşi tip farelerden makrofajlar mutant parazitlerin yaşam değerlendirilerek yapılır ve Belirli bağışıklıkla ilgili GTPases (IRGS). Belirlenen parazit genler nitrik oksit, reaktif oksijen ara veya bağışıklıkla ilgili GTPases ²⁸ sırasıyla veya bilinmeyen bağışıklık mekanizması dahil olup olmadığını direnç için önemli olmadığını gösterecektir. Mevcut protokolde tarif edildiği, IFN-γ ve LPS, her iki ile enfekte makrofajlar, aktivasyonu, öncelikle nitrik oksidin ²⁸ direnç için önemli parazit genin izolasyonu ile sonuçlanır. makrofaj aktivasyonunun yokluğunda nitrik oksit neden farmakolojik ajan (nitrik oksit donörleri) tarafından tanımlanan genlerin çoğu yeniden önemli olduğunu gösterdinitrik oksit yerine makrofaj aktivasyonu ²⁸ ile ilişkili ek arabulucular ile uyum içinde nitrik oksit direncin.

Bir ve iki in vitro enfekte olmuş kemik iliğinden türetilmiş makrofaj aktivasyonu takiben spor defektli parazit mutantlarını izole etmek için tasarlanmış bir ön genetik ekran tarif Adım. Bir parazit, çoğaltma azaltır, ancak tam olarak vahşi tip T replikasyonunu inhibe etmez makrofaj aktivasyonu için kullanımı deneysel olarak IFN-γ ve LPS'nin dozu belirlemek için bir doz titrasyon analizi tarif Adım Parazit mutantların kütüphanenin oluşturulması için kullanılan gondii ebeveyn suşu. İkinci adım 96 oyuklu plakalar içinde makrofajlar mutant klonların ileri genetik ekran tarif etmektedir. Üçüncü adım, her mutant kusur parazit yaşam etkileyip etkilemediğini, çoğaltma değerlendirmek ve 96 gözlü levhalar bir taramada tespit edilen her bir mutantın fenotipi teyit etmek için bir yaklaşım anahatlarımakrofaj aktivasyonuna karşılık olarak ya da kist üretimi. Dördüncü adım, parazit mutan özellikle hassas olan bağışıklık mediatörleri tanımlamak üzere, belirli antimikrobiyal yollarındaki delesyonu olan farelerin kemik iliği türevli makrofajlar kullanımını tarif eder. Adım beş enfekte farelerin beyinlerinde kist üretiminin tarafından değerlendirilir gibi bir parazit mutant da in vivo patogenezinde tehlikeye olup olmadığını belirlemek için bir yaklaşım özetlemektedir.