Forward Genetics vinduene ved hjelp Makrofager å identifisere<em> Toxoplasma gondii</em> Gener Viktig for Resistance til IFN-γ-Dependent Cell Autonomous immunitet

Toxoplasma gondii (T. gondii) er en obligat intracellulær, protozo- patogen. Det er den utløsende agent for toksoplasmose, en helsefare i immunsupprimerte individer. Det er også modellsystemet for andre apicomplexan patogener som infiserer mennesker inkludert Cryptosporidium og Cyclospora. Toksoplasmose er oftest ervervet gjennom inntak av mat eller vann som er forurenset med bradyzoite eller oocyst stadiet av parasitten. Ved inntak, disse stadiene konvertere til tachyzoite stadiet av parasitten som reproduserer innenfor vertsceller og formidler systemisk. T-celler, IFN-γ og, i mindre grad, nitrogenoksid ^1-4, er viktige for kontroll av infeksjon, men er ikke i stand til å eliminere sykdommen, som en andel av tachyzoites konvertere til bradyzoite trinn som er beskyttet innenfor vev cyster resulterer i en langlivet kronisk infeksjon. Faktisk er det ingen therapeutics effektiv mot kronisk cyste stage av sykdommen. Alvorlig toksoplasmose er som oftest på grunn av reaktivering av vedvarende infeksjon, med bradyzoite stadium av parasitten omdannelse tilbake til den hurtig replikerende tachyzoite stadium karakteristisk for primær og akutt infeksjon.

Tidlig overlevelse i ansiktet på den medfødte immunrespons er viktig for å tillate at parasitten å nå tilstrekkelig parasitt tall, samt for å nå fjerntliggende områder, for å muliggjøre etablering av kronisk infeksjon. T. gondii har utviklet seg strategier for å motvirke vertsforsvarsmekanismer som sannsynligvis bidrar til dens evne til å replikere og spre tidlig i infeksjonen. Først, T. gondii danner et unikt PV under parasitt invasjon som i stor grad er adskilt fra de endocytiske og exocytic prosesser av vertscellen i forhold til andre intracellulære patogener ^5-9. Også, i likhet med all vellykket intracellulære patogener T. gondii modifiserer sin vertscelle for å skape en ettergivende miljø feller vekst. Dette inkluderer omprogrammering vertscelle genuttrykk ved å endre vertscelle transkripsjonsfaktorer, inkludert de viktige for å regulere celleaktivering ^10-15. ROP16 ^16-19, GRA15 ^20, GRA16 ²¹ og GRA24 ²² har alle blitt vist å være viktige i reguleringen av transkripsjonen respons og cellesignaleringskaskader vertsceller infisert med T. gondii. Nyere studier ved hjelp av genetiske krysser mellom parasitt stammer med forskjellige fenotyper har vært svært produktiv i å identifisere parasitt gener som ligger til grunn parasitt genotype avhengige egenskaper inkludert unndragelse av immunitetsrelaterte GTPases (IRGs) ^16,19,23-26. Hos mus, immunitetsrelaterte GTPases (IRGs) er kritisk for kontroll av type II og III genotyper av parasitten mens svært virulente type jeg genotyper har utviklet mekanismer for å unngå de murine IRGs. Men det er også klart at parasitten har utviklet mekanismer for å unngå antimikrobiell mediatorer i tillegg til de IRGs og at noen av disse mekanismene kan bevares på tvers parasitt genotyper ^27,28. I tillegg, er meget lite kjent om de kritiske mediatorer av celleautonome immunitet mot T. gondii under human toksoplasmose. Parasitt gener viktige for motstand mot meklere av celle autonome immunitet kan også være viktig for å overleve under tachyzoite å bradyzoite konvertering som også kan utløses av vertsimmunresponser. For eksempel kan nitrogenoksid ved høye nivåer undertrykke parasittreplikasjon i infiserte makrofager, men det kan også stimulere tachyzoite å bradyzoite omdannelse resulterer i produksjon cyste ^30-32.

ToxoDB er en funksjonell genomisk database for T. gondii som fungerer som en kritisk ressurs for feltet i form av å gi sekvensinformasjon for parasitten genomet og tilgang til publiserte og upubliserte genomisk skala data inkludert samfunnet merknader, genet exp ression og proteomikk data ^33. I likhet med mange protozo patogener, flertallet av genomet består av hypotetiske gener med ingen informasjon er tilgjengelig basert på genet homologi for å gi innsikt i deres potensielle funksjoner. Således er termin genetikk et kraftig verktøy for å identifisere nye parasitt gener som er viktige for immunsvik, cyste omdannelse og andre funksjoner kritiske for parasitt patogenesen samt for omdannelse mellom forskjellige utviklingsstadier. En ekstra styrke av termin genetikk er at den kan brukes som en relativt ikke-partisk tilnærming å avhøre parasitten som til de gener som er viktige for spesifikke oppgaver i patogenesen, inkludert immununndragelser og cyste formasjon. Nylige forbedringer i neste generasjons sekvensering for mutasjons profilering har gjort det en metode for valg for å identifisere de ansvarlige parasitt gener fra termin genetiske studier ved hjelp av både kjemisk og insertional mutagenese ^34-37.

ntent "> Det er viktig å identifisere sårbarheter i T. gondii som kan utnyttes for å forbedre effektiviteten av cellestyrte immunmekanismer mot parasitten spesielt de som kan også være aktiv mot resistente cyste scenen. Mot dette målet, en in vitro murine makrofag-infeksjon og aktivering modell ble utviklet for å identifisere mutasjoner i parasitten som spesifikt svekker T. gondii kondisjon etter aktivering av infiserte makrofager, men ikke i naive makrofager. Denne makrofag-skjermen ble brukt til å avhøre et bibliotek av T. gondii insertional mutanter for å til slutt T. gondii identifisere gener som er viktige for resistens mot nitrogenoksid ^27,28. Isoleringen av et panel av T. gondii-mutanter med redusert motstand mot aktivering av infiserte makrofager, spesielt en markert sensitivitet overfor nitrogenoksid, viste anvendeligheten av skjermen for å identifisere parasitt gener viktige for motstandtil meklere av celle autonome immunitet annet enn resistensmekanismer som er beskrevet for de murine IRGs ^28. Insertional mutagenese har fordeler fremfor kjemisk mutagenese når det gjelder å generere et begrenset antall tilfeldige mutasjoner i hver parasitt klone og i teorien enklere identifisering av stedet for mutasjon. Men å identifisere den genomiske sete av plasmid innsetting i T. gondii insertional mutanter, i praksis, har vært overraskende vanskelig i mange tilfeller ^37. Innsetting av et plasmid inn i et gen er også sannsynlig å forstyrre funksjonen av et gen i motsetning til kjemisk mutagenese, som vanligvis resulterer i enkle nukleotid-endringer. Imidlertid kjemisk mutagenese med enten N-etyl-N-nitrosourea (ENU) eller etylmetansulfonat (EMS) kan gi en øket evne til å analysere en større del av parasitten genomet, sammenlignet med insertional mutagenese, som det skaper flere enkelt-nukleotid polymorfismer ( anslått til 10 -100) per mutant ³⁴, 38. Dessuten har nylige fremskritt i hele genomet profilering gjort det mulig å bruke neste generasjon sekvensering for å identifisere de mest sannsynlige kandidat gener som er ansvarlige for den identifiserte fenotypen av en mutert parasitt ^34,38. Uavhengig av mutagenese tilnærming, bekreftelse av rollen til parasitten genet i motstand mot makrofagaktivering slutt krever genet delesjon og komplemente å oppfylle molekyl Koch postulater.

Evnen til å dissekere funksjonen av et gen ved genetisk manipulering av både parasitten og makrofag er viktig da mange av de gener som er identifisert via termingenetikk T. gondii, så vel som andre patogener, er fortsatt karakterisert som hypotetiske gener med liten eller ingen sekvenshomologi med andre proteiner med kjente funksjoner. Den nåværende papir skisserer en generell metode som kan brukes til å identifisere hvorvidt forstyrret genet i en mutant som er viktig for motstanden til en kjent ellerukjent formidler av celle autonome immunitet. Den første analyse av verts antimikrobielle faktorer utføres ved evaluering av overlevelsen av villtype og mutante parasitter i makrofager fra mus av villtype versus de med spesielle gendelesjoner i induserbar nitrogenoksid syntase (iNOS), gp-91 phox (NADPH oksidase), og spesifikk immunitet relatert GTPases (IRGs). Dette vil avgjøre om de identifiserte parasitt gener er viktige for motstand mot nitrogenoksid, reaktive oksygenmellom eller immunitetsrelaterte GTPases ²⁸ henholdsvis eller hvis en ukjent immunsystemet er involvert. Aktivering av infiserte makrofager med både IFN-γ og LPS, som er beskrevet i den aktuelle protokoll, resulterer primært i isolering av parasitt-gener som er viktige for motstand mot nitrogenoksid ^28. Bruken av farmakologiske midler som induserer nitrogenoksid i fravær av makrofagaktivering (nitrogenoksiddonorer) bekreftet at flertallet av de gener som er identifisert var viktig for gjenmotstandsevne til nitrogenoksid i stedet for nitrogenoksid i konsert med flere meglere tilknyttet makrofagaktivering ^28.

Trinn en og to beskrive en fremover genetikk skjermen er utformet for å isolere parasitt mutanter med trenings defekt som følge av aktivering av infiserte benmarg-avledede makrofager in vitro. Trinn man beskriver en dosetitrering analyse for å empirisk å bestemme en dose av IFN-γ og LPS til bruk for makrofagaktivering som reduserer parasittreplikasjon, men ikke fullt inhiberer replikasjon av villtype T. gondii foreldrestamme som brukes for opprettelse av biblioteket av parasitt-mutanter. Trinn to beskriver videre genetisk skjermen av de mutante kloner i makrofager i 96-brønners plater. Trinn tre skisserer en tilnærming for å bekrefte fenotype av hver mutant identifisert i skjermen av de 96 brønners plater og å vurdere om feilen i hver mutant påvirker parasitt overlevelse, replikering,eller cyste produksjon som respons makrofagaktivering. Trinn fire beskriver bruk av benmarg-avledede makrofager fra mus med delesjoner i bestemte antimikrobielle veier å identifisere de immunmediatorer som parasitten mutanten er spesielt utsatt. Trinn fem skisserer en tilnærming for å avgjøre om en parasitt mutant er også kompromittert for in vivo patogenesen som vurderes av cyste produksjon i hjernen hos infiserte mus.