Forward Genetica Schermen Met behulp van macrofagen te identificeren<em> Toxoplasma gondii</em> Genen Belangrijk voor Weerstand tegen IFN-γ-Dependent Cell Autonome Immuniteit

Toxoplasma gondii (T. gondii) is een obligaat intracellulaire, protozoaal ziekteverwekker. Het is de verwekker van toxoplasmose, een gevaar voor de gezondheid in immuungecompromitteerde personen. Ook is het modelsysteem voor andere apicomplexa pathogenen die personen zoals Cryptosporidium en Cyclospora infecteren. Toxoplasmose wordt meestal verkregen door het eten van voedsel of water besmet met de bradyzoite of oocyst stadium van de parasiet. Bij inname, deze stadia te zetten naar de tachyzoite stadium van de parasiet die repliceert binnen gastheercellen en verspreidt systemisch. T-cellen, IFN-γ en, in mindere mate, stikstofmonoxide ^1-4, zijn belangrijk voor de controle van de infectie, maar zijn niet in staat elimineren van de ziekte, als percentage van tachyzoïeten converteren naar het bradyzoite fase die beschermd in weefsel cysten resulterend in een langlevende chronische infectie. In feite zijn er geen therapieën effectief tegen chronische cyste stage van de ziekte. Ernstige toxoplasmose is meestal te wijten aan de reactivering van persisterende infectie, met de bradyzoite stadium van de parasiet het omzetten terug naar de snel repliceren tachyzoite stadium kenmerk van primaire en acute infectie.

Overleving in gezicht van de aangeboren immuunrespons is belangrijk dat de parasiet voldoende aantal parasieten te bereiken, alsook distale plaatsen te bereiken, de vestiging van chronische infectie mogelijk. T. gondii geëvolueerd strategieën gastheer afweermechanismen die waarschijnlijk bijdragen aan het vermogen tot replicatie en verspreiding vroeg in infectie tegengaan. Ten eerste, T. gondii vormt een unieke PV tijdens parasiet invasie die grotendeels gescheiden van de endocytische en exocytose proces van de gastheercel in vergelijking met andere intracellulaire pathogenen ^5-9. Ook, net als alle succesvolle intracellulaire pathogenen T. gondii wijzigt haar gastheercel om een tolerante omgeving te creëren fof groei. Dit omvat herprogrammering gastheercel genexpressie door het veranderen gastheercel transcriptiefactoren waaronder die belangrijk voor het reguleren celactivering ^10-15. ROP16 ^16-19 GRA15 ^20, GRA16 ²¹ en GRA24 ²² zijn allemaal aangetoond belangrijk te zijn bij het ​​reguleren van de transcriptionele respons en signaaltransductie cascades gastheercellen geïnfecteerd met T. gondii. Recente studies met behulp van genetische kruisingen tussen parasiet stammen met verschillende fenotypes zijn uiterst productief op het identificeren van de parasiet genen die parasiet genotype-afhankelijke eigenschappen, waaronder ontduiking van de immuniteit gerelateerde GTPasen (IRGs) ^16,19,23-26 grondslag liggen geweest. Bij muizen immuniteits- GTPases (IRGs) cruciaal zijn voor de bestrijding van type II en III genotypen van de parasiet, terwijl het virulente type I genotypen mechanismen hebben ontwikkeld om de murine IRGs onttrekken. Het is echter ook duidelijk dat de parasiet mechanismen geëvolueerd antimicrobiële media onttrekkentors naast de IRGs en sommige van deze mechanismen kunnen worden bewaard in parasiet genotypen ^27,28. Daarnaast, zeer weinig bekend over de kritische mediatoren van cel autonome immuniteit tegen T. gondii tijdens menselijk toxoplasmose. Parasite genen betrokken resistentie tegen bemiddelaars van cel- autonome immuniteit kunnen ook belangrijk zijn voor overleving gedurende tachyzoite conversie die ook kan worden veroorzaakt door gastheer immuunreacties bradyzoite. Zo kan stikstofmonoxide hoog niveau parasiet replicatie in geïnfecteerde macrofagen onderdrukken maar kan ook tachyzoite stimuleren omzetting resulteert in cystenproduktie ^30-32 bradyzoite.

ToxoDB is een functionele genomische databank voor T. gondii, dat functioneert als een belangrijk hulpmiddel voor het gebied in termen van het verstrekken van sequentie-informatie voor de parasiet genoom en de toegang tot gepubliceerde en ongepubliceerde genomische schaal gegevens inclusief gemeenschap annotaties, gen exp ression en proteomics data ^33. Net als vele protozoaire pathogenen, het merendeel van het genoom bestaat hypothetische genen zonder informatie gebaseerd op gen homologie inzicht verschaffen in de mogelijke functies. Dus vooruit genetica is een krachtig instrument om nieuwe parasiet genen belangrijk zijn voor het immuunsysteem fraude, cyste conversie en andere functies van cruciaal belang voor parasiet pathogenese, alsook voor de omrekening tussen verschillende ontwikkelingsstadia te identificeren. Een extra sterke forward genetics is dat het kan worden gebruikt als een relatief niet-voorgespannen benadering van de parasiet ondervragen om de genen die belangrijk zijn voor specifieke taken in pathogenese, waaronder immuun fraude en vorming van cysten zijn. Recente verbeteringen in next generation sequencing voor mutatie-profilering hebben het tot een methode van keuze voor de identificatie van de verantwoordelijke parasiet genen van forward genetics studies met behulp van zowel chemische als insertiemutagenese ^34-37 gemaakt.

ntent "> Het is belangrijk om kwetsbaarheden T. gondii die kunnen worden benut om de doeltreffendheid van cel autonome afweermechanismen tegen de parasiet name die ook actief tegen de resistente cyste fase zijn. Tegen dit doel een in vitro muizen kan worden verbeterd macrofaag infectie en activering model ontwikkeld om mutaties in de parasiet die specifiek beïnvloeden T. gondii conditie na activering van geïnfecteerde macrofagen maar niet in naïeve macrofagen herkennen. Deze macrofaag scherm werd toegepast om een bibliotheek van T. gondii insertie mutanten ondervragen om uiteindelijk identificeren T. gondii genen betrokken resistentie tegen stikstofoxide ^27,28. De isolatie van een panel van T. gondii mutanten met verminderde weerstand activering van geïnfecteerde macrofagen, in het bijzonder een duidelijke gevoeligheid voor stikstofoxide, bleek het nut van het scherm te identificeren parasiet genen die belangrijk zijn voor de weerstandbemiddelaars van cel- autonome immuniteit dan de resistentiemechanismen beschreven voor muizen IRGs ^28. Mutagenese heeft voordelen boven chemische mutagenese in termen van het genereren van een beperkt aantal willekeurige mutaties in elke kloon en parasieten, in theorie, snellere identificatie van de plaats van mutatie. Het identificeren van de genomische plaats van plasmide invoeging in T. gondii insertie mutanten, in de praktijk is verrassenderwijs moeilijk in veel gevallen ^37. Het inbrengen van een plasmide in een gen waarschijnlijk ook de functie van een gen te verstoren in tegenstelling tot chemische mutagenese die resulteert gewoonlijk in enkele nucleotide veranderingen. Echter, chemische mutagenese met ofwel N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) of ethylmethaansulfonaat (EMS) een versterkt vermogen om een ​​groter deel van de parasiet genoom analyse bieden, vergeleken mutagenese, zoals maakt meerdere single nucleotide polymorphisms ( geschat op 10 -100) per mutant ³⁴, 38. Bovendien recente vooruitgang geheel genoom profilering heeft het mogelijk gemaakt de volgende generatie sequencing gebruiken om de meest waarschijnlijke kandidaat genen voor de geïdentificeerde fenotype van een gemuteerde parasiet ^34,38 identificeren. Ongeacht de mutagenesebenadering bevestiging van de rol van de parasiet gen resistentie tegen macrofaag activatie uiteindelijk vereist gendeletie en complementatie moleculaire Koch's postulaten voldoen.

De mogelijkheid om de functie van een gen door genetische manipulatie van zowel de parasiet en de macrofaag ontleden is belangrijk omdat vele genen geïdentificeerd via forward genetics T. gondii, evenals andere pathogenen, nog steeds sprake als hypothetisch genen met weinig tot geen sequentie homologie met andere eiwitten met bekende functies. Het huidige document wordt een algemene aanpak die kan worden gebruikt voor het identificeren of het verstoorde gen in een mutant is belangrijk voor resistentie tegen bekende ofonbekend mediator van cel autonome immuniteit. De eerste analyse van gastheer antimicrobiële factoren wordt uitgevoerd door het evalueren van de overleving van wild-type en mutante parasieten in macrofagen van wild-type muizen versus die met een specifiek gen deleties in induceerbare stikstofmonoxide synthase (iNOS), gp-91 phox (NADPH oxidase), en specifieke immuniteit gerelateerde GTPasen (IRGs). Dit bepaalt of de geïdentificeerde parasiet genen belangrijk voor resistentie stikstofoxide, reactieve zuurstofintermediairen respectievelijk of een onbekend immuun mechanisme betrokken immuniteit gerelateerde GTPases ^28. Activering van geïnfecteerde macrofagen zowel IFN-γ en LPS in het huidige protocol beschreven, resulteert voornamelijk in de isolatie van genen betrokken parasiet resistentie tegen stikstofmonoxide ^28. Het gebruik van farmacologische middelen die stikstofoxide induceren in de afwezigheid van activering van macrofagen (stikstofoxide donoren) bevestigden dat de meerderheid van de genen die belangrijk waren voor hergebruikresistentie tegen stikstofoxide in plaats van stikstofmonoxide in overleg met extra mediators in verband met macrofaagactivering ^28.

Stap één en twee beschrijven een forward genetics scherm ontworpen om parasiet mutanten te isoleren met een fitness defect na activering van geïnfecteerde beenmerg-afgeleide macrofagen in vitro. Stap één beschrijft een dosistitratie analyse een dosis van IFN-γ en LPS empirisch bepaald moet worden voor macrofaag activatie parasiet replicatie vermindert maar niet volledig replicatie van de wildtype T. remmen gondii ouderlijke stam die wordt gebruikt voor het maken van de bibliotheek van mutanten parasiet. Stap twee beschrijft de voorwaartse genetische screen van de mutante klonen in macrofagen in 96-well platen. Stap drie schetst een aanpak die het fenotype van elke mutant die in het scherm van de 96 putjes en beoordelen of het defect in elke mutant beïnvloedt parasiet overleving, replicatie bevestigenof cyste productie in respons op macrofaag activatie. Stap vier beschrijft het gebruik van beenmerg afgeleide macrofagen van muizen met deleties specifieke antimicrobiële routes naar de immuunmediatoren waarop het parasiet mutant specifiek gevoelig identificeren. Stap vijf schetst een benadering te bepalen of een parasiet mutant ook gecompromitteerd in vivo pathogenese geëvalueerd door cystenproduktie in de hersenen van geïnfecteerde muizen.