الى الامام علم الوراثة شاشات طريق الضامة لتحديد<em> التوكسوبلازما</em> الجينات هامة الحصانة الذاتية للمقاومة إلى الإنترفيرون γ التي تعتمد على خلية

الغوندية التوكسوبلازما (T. الغوندية) هو داخل الخلايا تلزم، الممرض طفيلي. هذا هو العامل المسبب لداء المقوسات، يشكل خطرا على الصحة في الأفراد المناعة. بل هو أيضا في النظام النموذجي لمسببات الأمراض apicomplexan الأخرى التي تصيب البشر بما في ذلك الكريبتوسبوريديوم وCyclospora. ويكتسب داء المقوسات الأكثر شيوعا من خلال تناول طعام أو ماء ملوث المتباطئة أو البيوض المتكيسة مرحلة من مراحل الطفيلي. على ابتلاع، هذه المراحل تحويل إلى مرحلة tachyzoite للطفيل أن يعيد داخل الخلايا المضيفة وتنشر بشكل منتظم. خلايا T، IFN-γ، وإلى حد أقل، وأكسيد النيتريك ^1-4، تعتبر مهمة للسيطرة على العدوى ولكنها ليست قادرة على القضاء على المرض، كنسبة من tachyzoites تحويل إلى مرحلة المتباطئة التي يتم حمايتها ضمن الخراجات الأنسجة مما أدى إلى عدوى مزمنة عمرا طويلا. في الواقع، لا توجد علاجات فعالة ضد الكيس الصورة المزمنالمئوية للمرض. داء المقوسات الحاد هو في معظم الأحيان بسبب إعادة تنشيط العدوى المستمرة، مع المرحلة المتباطئة للطفيل تحويل الى تكرار بسرعة tachyzoite مرحلة مميزة من العدوى الأولية والحاد.

البقاء على قيد الحياة في وقت مبكر في مواجهة الاستجابة المناعية الفطرية مهم للسماح الطفيلي للوصول إلى أعداد الطفيل كافية، وكذلك للوصول إلى المواقع البعيدة، لتمكين المؤسسة من عدوى مزمنة. T. وقد تطورت الغوندية استراتيجيات لمواجهة آليات دفاع المضيف التي تساهم المرجح أن قدرته على تكرار ونشر في وقت مبكر من العدوى. أولا، T. الغوندية يشكل PV فريدة من نوعها خلال الغزو الطفيلي الذي هو الفصل بين الجنسين إلى حد كبير من عمليات التقامي وexocytic من الخلية المضيفة مقارنة لمسببات الأمراض داخل الخلايا الأخرى ^5-9. أيضا، مثل كل ناجح داخل الخلايا مسببات الأمراض T. الغوندية يعدل الخلية المضيفة لخلق بيئة متساهلة وأو النمو. ويشمل هذا المضيف إعادة برمجة الخلايا التعبير الجيني عن طريق تغيير عوامل النسخ الخلية المضيفة بما في ذلك تلك الأهمية لتنظيم تنشيط الخلايا ^10-15. ROP16 ^16-19، GRA15 ^20، GRA16 ²¹ و ²² GRA24 كلها قد ثبت أن تكون مهمة في تنظيم استجابة النسخي وخلية يشير شلالات من الخلايا المضيفة المصابين T. الغوندية. وكانت الدراسات التي أجريت مؤخرا باستخدام الصلبان الوراثية بين سلالات طفيلي مع الظواهر متميزة مثمرة للغاية في تحديد الجينات الطفيليات التي تكمن وراء الصفات التي تعتمد على التركيب الوراثي الطفيليات بما في ذلك التهرب من GTPases الحصانة ذات الصلة (IRGs) ^{16،19،23-26.} في الفئران، GTPases الحصانة ذات الصلة (IRGs) هي الحاسمة من أجل السيطرة على النوع الثاني والثالث التراكيب الوراثية للطفيل في حين تطورت خبيث جدا من النوع الأول المورثات آليات للتهرب من IRGs الفئران. ومع ذلك، فمن الواضح أيضا أن الطفيليات قد تطورت آليات للتهرب من وسائل الإعلام المضادة للجراثيميمكن الحفاظ الاختصاصات بالإضافة إلى IRGs وأن بعض هذه الآليات عبر المورثات الطفيلي ^27،28. وبالإضافة إلى ذلك، فإن القليل جدا هو المعروف عن الوسطاء الحرجة من خلايا مناعة ذاتية الحكم ضد T. الغوندية خلال داء المقوسات البشري. الجينات الطفيليات مهمة لمقاومة وسطاء من خلية مناعة ذاتية الحكم قد يكون من المهم أيضا للبقاء على قيد الحياة خلال tachyzoite إلى المتباطئة التحويل والتي يمكن أيضا أن يكون سببها المضيف الاستجابات المناعية. على سبيل المثال، يمكن أن أكسيد النيتريك عند مستويات مرتفعة قمع تكرار الطفيلي في الضامة المصابة ولكن يمكن أيضا تحفيز tachyzoite لتحويل المتباطئة مما أدى إلى إنتاج الكيس ^30-32.

ToxoDB هي قاعدة بيانات الجينوم وظيفية للT. الغوندية الذي يعمل كمورد حاسم للحقل من حيث توفير المعلومات عن تسلسل جينوم طفيلي والوصول إلى المنشورة وغير المنشورة البيانات على نطاق والجيني بما في ذلك الشروح المجتمع، إكسب الجين ression والبروتيوميات البيانات ^33. وعلى غرار العديد من مسببات الأمراض الطفيلية، والغالبية العظمى من الجينوم يتكون من جينات افتراضية مع أية معلومات متاحة على أساس التماثل الجيني لتوفير نظرة ثاقبة وظائفها المحتملة. وهكذا، وعلم الوراثة إلى الأمام هو أداة قوية لتحديد الجينات الطفيليات جديدة مهمة للتهرب من المناعة، وتحويل الكيس وغيرها من المهام الحرجة للطفيلي المرضية فضلا عن التحويل بين مراحل نمو متميزة. وقوة إضافية من علم الوراثة إلى الأمام هو أنه يمكن استخدامها كنهج نسبيا غير منحازة لاستجواب الطفيلي لالجينات التي تعتبر مهمة لأداء مهام محددة في المرضية، بما في ذلك التهرب المناعة، وتشكيل الكيس. جعلت من طريقة الاختيار لتحديد الجينات المسؤولة عن الطفيليات علم الوراثة الدراسات إلى الأمام باستخدام الطفرات سواء الكيميائية وإقحامي ^34-37 التحسينات الأخيرة في الجيل القادم التسلسل لالتنميط التحولي.

ntent "> ومن المهم تحديد نقاط الضعف في T. الغوندية التي يمكن استغلالها لتعزيز فعالية الخلايا آليات مناعية ذاتية الحكم ضد الطفيليات وخاصة تلك التي قد تكون أيضا فعال ضد مرحلة الكيس مقاومة. وتحقيقا لهذا الهدف، وهو في المختبر الفئران وقد وضعت العدوى البلاعم ونموذج التشغيل لتحديد الطفرات في الطفيليات التي تضر تحديدا T. الغوندية اللياقة البدنية بعد تفعيل الضامة المصابة ولكن ليس في الضامة ساذجة. تم استخدام هذه الشاشة البلاعم لاستجواب مكتبة من T. الغوندية المسوخ إقحامي من أجل نهاية المطاف تحديد الجينات T. الغوندية مهمة لمقاومة أكسيد النيتريك ^27،28. وعزلة لجنة من المسوخ T. الغوندية مع المقاومة ضعف لتفعيل الضامة المصابة، وخاصة حساسية ملحوظة إلى أكسيد النيتريك، وثبت فائدة الشاشة لتحديد الجينات الطفيليات هامة للمقاومةالى وسطاء من خلية مناعة ذاتية الحكم أخرى من آليات المقاومة وصفه لIRGs الفئران ^28. الطفرات إقحامي لها مزايا أكثر من الطفرات الكيميائية من حيث توليد عدد محدود من الطفرات العشوائية في كل استنساخ طفيلي و، من الناحية النظرية، وتحديد أسهل للموقع من الطفرة. ومع ذلك، وتحديد الموقع الجيني البلازميد الإدراج في T. المسوخ إقحامي الغوندية، في الممارسة العملية، كان من الصعب المستغرب في كثير من الحالات ^37. إدخال البلازميد إلى الجين ربما سيؤدي الى تعطيل وظيفة الجين على النقيض من الطفرات الكيميائية التي تنتج عادة في التغيرات النوكليوتيدات واحدة أيضا. ومع ذلك، الطفرات الكيميائية إما N-إيثيل-N-نتروزويوريا (ENU) أو سلفونات ethylmethane (EMS) قد تقدم زيادة القدرة على تحليل جزء أكبر من الجينوم طفيلي، بالمقارنة مع الطفرات إقحامي، كما أنه يخلق متعددة الأشكال النوكليوتيدات واحدة ( تقدر 10 -100) في متحولة ³⁴(38 عاما). وعلاوة على ذلك، جعلت التطورات الحديثة في التنميط الجينوم كله من الممكن استخدام الجيل القادم التسلسل للتعرف على الجينات المرشحة الأكثر احتمالا المسؤولة عن النمط الظاهري المحددة للطفيلي تحور ^34،38. بغض النظر عن النهج الطفرات، تأكيدا لدور هذا الجين الطفيلي في المقاومة لتفعيل بلعم يتطلب في نهاية المطاف حذف الجينات وتكامل للوفاء المسلمات الجزيئي كوخ.

القدرة على تشريح وظيفة الجين عن طريق التلاعب الجيني لكل من الطفيليات والبلاعم لا يقل أهمية عن العديد من الجينات التي تم تحديدها عن طريق الوراثة قدما في T. الغوندية، فضلا عن مسببات الأمراض الأخرى، لا يزال يوصف الجينات افتراضية مع قليل من دون التماثل تسلسل لبروتينات أخرى ذات وظائف معروفة. وتحدد الورقة الحالية نهجا عاما يمكن استخدامه لتحديد ما إذا كانت الجينات تعطلت في متحولة مهم لمقاومة معروفة أووسيط غير معروف من خلية المناعة الذاتية الحكم. أجريت التحاليل الأولي من المضيف العوامل المضادة للجراثيم من خلال تقييم بقاء النوع البري والطفيليات متحولة في الضامة من نوع الفئران البرية مقابل تلك مع الحذف الجينات المحددة في محرض أكسيد النيتريك سينسيز (iNOS)، GP-91 phox (NADPH أوكسيديز)، و GTPases الحصانة المرتبطة محددة (IRGs). وهذا تحديد ما إذا كانت الجينات الطفيليات التي تم تحديدها هي مهمة لمقاومة أكسيد النيتريك، وسيطة الاكسجين التفاعلية أو حصانة المتعلقة GTPases ²⁸ على التوالي أو إذا آلية مناعية غير معروفة هي المعنية. تفعيل الضامة المصابة مع كل من IFN-γ وLPS، وصفت في البروتوكول الحالي، النتائج في المقام الأول في عزل جينات الطفيلي مهمة لمقاومة أكسيد النيتريك ^28. استخدام وكلاء الدوائية التي تحفز على أكسيد النيتريك في غياب تفعيل البلاعم (المانحين أكسيد النيتريك) وأكد أن غالبية الجينات التي جرى تحديدها هامة لإعادةاملساعدات إلى أكسيد النيتريك بدلا من أكسيد النيتريك في الحفل مع وسطاء الإضافية المرتبطة تنشيط البلاعم ^28.

خطوة واحدة واثنين من وصف شاشة الوراثة إلى الأمام تهدف إلى عزل المسوخ طفيلي مع وجود خلل اللياقة البدنية بعد تفعيل الضامة المشتقة من نخاع العظم المصاب في المختبر. خطوة واحدة تصف تحليل جرعة المعايرة لتحديد تجريبيا جرعة من γ IFN- وLPS لاستخدامها لتنشيط البلاعم التي تقلل من تكرار الطفيلي ولكن لا تمنع تماما تكرار نوع T. البرية سلالة الأبوية الغوندية التي يتم استخدامها لإنشاء مكتبة من المسوخ طفيلي. تصف الخطوة الثانية الشاشة الوراثية إلى الأمام من الحيوانات المستنسخة طافرة في الضامة في لوحات 96-جيدا. وتحدد الخطوة الثالثة نهجا لتأكيد النمط الظاهري من كل متحولة المحددة في الشاشة لوحات جيدا 96 وتقييم ما إذا كان الخلل في كل متحولة يؤثر بقاء الطفيلي، والنسخ،أو إنتاج الكيس ردا على تنشيط البلاعم. الخطوة الرابعة تصف استخدام الضامة المشتقة من نخاع العظام من الفئران مع الحذف في مسارات المضادة للميكروبات معينة للتعرف على وسطاء المناعية التي متحولة الطفيلي هو عرضة على وجه التحديد. وتحدد الخطوة الخامسة نهجا لتحديد ما إذا كان خطر المسخ الطفيلي أيضا لفي الجسم الحي المرضية حسب تقييم إنتاج الكيس في أدمغة الفئران المصابة.