JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biología

Bir Kolorimetrik Altın Nanopartikül Testi Uygulanan Yapı-anahtarlama aptamers seçilmesi için bir yöntem

Published: February 28, 2015
doi:
10.3791/52545
, , , , ,
1711th Human Performance Wing, Human Effectiveness Directorate, Air Force Research Laboratory,Wright-Patterson Air Force Base, 2The Henry M. Jackson Foundation, 3UES, Inc.

Summary

A protocol is provided to select structure-switching aptamers for small molecule targets based on a tunable stringency magnetic bead selection method. Aptamers selected with structure-switching properties are beneficial for assays that require a conformational change to signal the presence of a target, such as the described gold nanoparticle assay.

Abstract

Küçük moleküller nedeniyle insan sağlığı ve performansı çeşitli yönleriyle bir göstergesi olarak kendi fizyolojik etkileri için biyoalgı uygulamaları için zengin hedefler sunmak. Nükleik asit aptamerler giderek biyosensör platformlarda tanıma elemanları olarak uygulanan, ama küçük molekül hedeflerine yönelik aptamers seçerek özel tasarım konuları gerektirir edilmiştir. Bu çalışma modifikasyon ve küçük molekül hedeflerine yapı-anahtarlama aptamers seçmek için tasarlanmış bir yöntem kritik adımları açıklar. Manyetik boncuklar üzerinde tamamlayıcı DNA yakalama probuna hibridize olan bir DNA kütüphanesinden bağlama sekansları konformasyonda hedef kaynaklı değişikliği ile nonbinders ayrılır. Destek matrisi (boncuk) bağlanma dizileri, daha da büyür olmayacak, bu yöntem avantajlıdır, ve bu hedef molekülün immobilizasyon gerektirmez. Bununla birlikte, erime Yakalama sondasının sıcaklığı ve kütüphane, burada veya bunun biraz üstünde tutulur, oda sıcaklığında bu diziler T olduğuTermodinamik göre şapka dehybridize da süpernatan çözeltisi içinde mevcut olacaktır. Bu etkili bir (nonbinders gelen dizileri bağlayıcı ayrı hedefe yeteneği) bölümleme verimliliği sınırlar ve bu nedenle birçok seçim mermi arka plan dizileri kaldırmak için gerekli olacaktır. rapor yöntem nedeniyle negatif seçim adımlar uygulanması, basitleştirilmiş zenginleştirme izleme ve gelişmiş darlığı sağlamak için seçim zenginleştirme aşağıdaki yakalama probunun uzunluğu uzantısı önceki yapı-anahtarlama aptamer seçimleri farklıdır. Seçilen yapı anahtarlama aptamerler aptamer konformasyonel bir değişim ile hedef molekülün varlığı bildiren bir altın nano partıküler deney platformu avantajlıdır. Bir klinik veya dağıtılan ortamda yararlı basit, hızlı bir kolorimetrik okunmasını sağlar, çünkü altın nanoparçacık tahlil uygulandı. Tasarım ve optimizasyon hususlar proof-of-principl olarak tahlil için sunulmuşturtampon e çalışması fizyolojik sıvılarda küçük molekül biosensörleme doğru iş daha uzatılması için bir temel sağlamak için.

Introduction

Küçük moleküller uzun gibi fizyolojik toksisite veya beslenme, hücre sinyal, ve hastalık 1 olarak ilaç tedavileri gibi çeşitli biyolojik süreçlerde hayati rol oynamaya olarak kabul edilmiştir. Çeşitli küçük moleküller aynı zamanda stres 2,3, yorgunluk 4 ve hastalık 5 de dahil olmak üzere, fizyolojik koşullar gösteren biyolojik olarak önerilmiştir. Örneğin, yüksek kortizol seviyeleri azalmış fizyolojik performans ve diğer sağlık koşulları 6-8 neden olabilir stres ile ilişkili. Benzer şekilde, tükürük belirli peptitlerin oranla-nnda değişiklik fizyolojik belirtiler konsantrasyon eksikliği, bozulmuş reaksiyon süresi ve düşük idrak fonksiyonunu 4 içerir yorgunluk, korelasyon gösterir. Bu nedenle, küçük moleküllerin seviyesini izlemek için hedef spesifik biyosensör geliştirmenin Bireysel sağlığı ve performans özelliklerini değerlendirmek için çok değerli bir ölçüm sağlayabiliridual.

Tarihsel olarak, küçük molekül tespit emek-yoğun ayırma teknikleri ile ya da antikor ile algılar 6,7 ile gerçekleştirilmiştir. Daha yakın zamanda, nükleik asit aptamerler 9,10 özel uygulamalarda antikorların göre belirgin avantajlara sahiptir tanıma elemanları olarak ortaya çıkmıştır. 12 dokulan metal iyonları 11 büyüklüğü değişen bir hedef bağlanma yeteneğine sahip olan, aptamerler yaygın biyo-algılayıcı platformları 13,14 tanıma elemanları olarak uygulanmıştır. Antikorlar ile karşılaştırıldığında, aptamerler kimyasal olarak sentezlenmiş, ve yüzey immobilizasyon veya raporlama için tekrarlanabilir kimyasal değişiklikleri tanıtmak nedenle basit vardır. Antikorlar, fizyolojik koşullar 15,16 ile sınırlıdır, oysa Aptamerler, kullanılan seçim eden şartların değiştirilmesi suretiyle arzu edilen şartlar altında yüksek bir hedef spesifiklik ile seçilebilir. Buna ek olarak, aptamerler th nedeniyle yüksek bağ yoğunluğu edebilenBir biyosensör platform üzerinde verim sinyal yüksek bir hedef olarak ortaya çıkan, daha küçük boyut EIR ve aptamers geliştirilmiş stabilite tekrar kullanım ve uzun süreli depolama sensörü 16 sağlar.

Aptamerler dizilerinin başlangıç ​​kütüphane hedef molekülü bağlayabilen potansiyeline sahip çok sayıda (10 1 -10 2) dizileri ihtiva eden zenginleştirilmiş bir nihai havuzuna 10 ila 13 -10 15 benzersiz moleküllerden gelişti burada SELEX olarak bilinen bir prosedür kullanılarak oluşturulur. Nihai zenginleştirilmiş bir havuzu daha sonra dizisi olup, ayrılma sabitleri (Kd), hedef molekül ile en yüksek kopya sayısı dizilerinin bağlanma tahlilleri elde edilmiştir. Son zenginleştirilmiş nüfus havuz Evrim maksimum zenginleştirme elde edilinceye kadar, her turda hedef bağlayıcı havuz yüzdesi izleyerek izlenir. Bu bağlanma dizileri nonbinders ve büyütülen bölümlenir evrimsel tur bir dizi üzerinde yer alırpolimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanılarak esterlenmiş. etkin bir bağlayıcı bölümlemek ve korumak için yetenek seçimi ve doğrudan etkileri seçilen aptamers 15 özellikleri verimliliği temel belirleyicilerinden biridir. Onlar boyutu veya protein hedefleri 1,15 bölümleme işlemini yardımcı fonksiyonel grupların çeşitli sahip olmadığı SELEX bölümleme evre küçük moleküller için daha zordur. Örneğin, bir çok protein, bölümleme platformları ancak bağlı DNA küçük molekül, hedef komplekslerinin özellikleri etkisiz bölümleme 1'de elde edilen, genel olarak bağlayıcı olmayan dizilerin daha belirgin şekilde farklı değildir, boyut veya yük göre ayrılmasına dayanır. Alternatif SELEX bölümleme yöntemler potansiyel olarak küçük bir molekülün bağlanma özelliklerini değiştirebilir ki, immobilizasyon veya hedef etiketleme içerebilir. Küçük molekül r hedef için Sonuç, bir seçim prosedürü tasarım aptamers oluşturmak içinözel önem equires.

Modifikasyonlarının çeşitliliği usul bölümleme verimliliğini artırmak son havuzda dizilerin afinitesini veya spesifikliği arttırabilir ya da farklı uygulamalar 15,16 için daha müsait hale getirmek için, orijinal SELEX yöntem uygulanmıştır. Küçük moleküller için seçme yeteneğine sahip bir SELEX modifikasyonu hedef molekül 17,18 ile etkileşim üzerine uygun bir değişiklik geçiren bir yapı anahtarlama aptamers veya aptamerler üretmek için tasarlanmıştır. Bu yöntemin bir örneğinde, Kitaplık manyetik boncuklar üzerinde hareketsizleştirilmiş 17 bağlayıcı olmayan tamamlayıcı DNA kısa bir parça (cDNA) hibridize edilir. Hedef bağlanması üzerine nonbinders cDNA hibridize kalan ise, bağlayıcı dizilerinin uyum değişikliği / taneler, manyetik paylaştırıldı ve atılır, süpernatan çözeltisi içine bırakılması cDNA'dan dehybridize yardımcı olmaktadır. Bu yöntem, bir avantajımekanlar için uygundur küçük moleküller için bu ayrılmanın elde edilmesi için hedef molekülün hareketsizlik veya etiketleme gerektirmez, çünkü.

Yapı anahtarlama yeteneğine sahip Aptamerler, bir hedef molekül varlığını tespit etmek için aptamer yapısında bir değişiklik gerektiren herhangi bir potansiyel biyosensör platformu için değerli bir özelliği sahiptir. Özellikle, aptamerler tuzu cebine 19,20 sonra hedef molekülün mevcudiyetinde bir kolorimetrik bir cevap üretmek için yapı-değiştirme prensibine göre çalışmayabilir tahlilleri oluşturmak için altın nanopartiküllerinin (AuNPs) ile kombine edilebilir. Bir AuNP deneyde, tek kordonlu DNA (ssDNA) aptamer ilk AuNP yüzeyine adsorbe olmakta ve bu tuz meydan korur. hedefin mevcudiyeti tuzu ilave edildikten sonra, kırmızı-için-mavi bir renk değişimi ile sonuçlanarak, AuNP yüzeyi ortaya aptamer bir yapı değişikliklerini oluşturmaktadır. AuNP deneyler sinyali, mikromolar afinite aptamer yükseltmek için gösterilmiştirs ayrılma sabiti (Kd) 21 kat daha düşük seviyeleri emriyle hedefi tespit edebilir. Bu özellik, akrabalıklar genellikle düşük mikromolarlık gelen milimolar konsantrasyonlarda 1,15 aralığında küçük molekül hedefleri, özellikle çekici. Genellikle, tahlil biyosensör algılama platformları gibi aptamer-AuNP testlerin daha fazla çalışma teşvik gerçekleştirmek için de hızlı ve nispeten basittir.

Bu çalışmanın amacı, örnek bir molekül olarak stres markın kortizol kullanılarak biyo-algılayıcı uygulamalar için küçük moleküllere yapı anahtarlama aptamers belirlenmesi için evrensel bir protokol sağlamaktır. Bir AuNP biyosensör algılama düzeni nedeniyle operasyon ve kolorimetrik okuma sadeliği ilgi olduğunu, ancak yapı-anahtarlama aptamerler gibi de aptamer conformatio bir değişiklik yoluyla algılama sağlayan elektrokimyasal 22 veya floresan 23 gibi alternatif algılama platformu çıkışları, uygulanabilirhedef üzerine N bağlayıcı. Bir önceki yöntemlere kıyasla, birden fazla negatif seçim adımlar tasarım 17,18 dahil edildi ve basit bir UV bazlı zenginleştirme algılama düzeni (Şekil 1) uygulanmıştır. Bu protokol, eski yöntemler 17 kullanılan radyoligand zenginleştirme algılama düzeni ile tezat teşkil etmektedir. Önerilen yöntem, aynı zamanda maksimal zenginleştirme 24 gözlenmiştir sonra ayar etkili bir seçim sıkılığı bölümleme etkinlik artışı ve seçiminde kullanılan bir cDNA yakalama sondaları uzunluğunda bir artış dahil edilmiştir. ayarlanmış sıkılık son havuzda hedef ile elüte DNA daha düşük bir toplam yüzdesine kurşun, ancak bir önceki turda en yüksek kopya sayısı dizisi ile karşılaştırıldığında geliştirilmiş afinite ile bağlanan bir dizi yüksek kopya sayıları ile sonuçlanmıştır. Son havuzdan en yüksek kopya sayısı dizisi dizisi bir platform için uygun olduğunu göstermek için bir AuNP deneyi uygulandıBu bağlama hedefi belirtmek için yapısal bir değişikliği gerektirir. Bu tampon bazlı analiz AuNP deneyinin tepki yüzeyine uygulanan DNA'nın yoğunluğu değiştirilerek değiştirilebilir olduğunu gösterir ve kanıt ilke-çalışmalarında küçük molekül aptamer tabanlı AuNP biyosensörler geliştirilmesine yönelik gelecek araştırma çabaları ayırmaya olarak hizmet fizyolojik sıvılar.

Protocol

1. Kütüphane ve Primer Tasarım ve Sentezi İlk kütüphane ve primerler (bu konu daha önceki yayınlarda yaygın gözden geçirilmiş) 25,26 tasarlayın. Standart fosforamidit kimyası kullanılarak, bu çalışma için aşağıdaki dizileri sentez: Kütüphane: GAATGGATCCACATCCATGG-N 40 -TTCACTGCAGACTTGACGAAGCTTGACGAA İleri Astar: GGAATGGATCCACATCCATGG Ters Primer: Biyotin-AAGCTTCGTCAAGTCTGCAGTGAA Kütüphane 5 'bölgesine tamamlayıcı olacak şekilde cDNA yakalama sondaları tasarlama. Artan bir erime sıcaklığına temin sonraki her bir baz ile, biraz daha oda sıcaklığında üzerinde bir erime sıcaklığı sağlamak için çevrimiçi erime sıcaklığı, yazılım analizi ile başlangıç ​​uzunluğu seçin. mer Yakalama Ucu: CCATTCC-Biotin mer Yakalama Ucu: TCCATTCC-Biotin mer Yakalama Ucu: ATCCATTCC-Biotin Standart HPLC ile kütüphane arındırın. Tuzdan arındırma taşıdıkları risklerle olduğunuastar ve yakalama sondaları için katsayısıdır. Kadar birkaç aya kadar, -20 ° C'de, istenen konsantrasyon ve mağazada nükleaz içermeyen su içinde oligonükleotidleri sulandırın. 2. Tampon, Kütüphane, ve Numune Hazırlama Millipore veya 50 mM Tris, 137 mM NaCI, 5 mM MgCI2, pH 7.4 konsantrasyonu ile nükleaz içermeyen dereceli su içinde tampon 500 ml hazırlayın. Steril 0.2 um membrandan filtre tamponu; Depolama ay için çevre koşullarında mümkündür. Seçenek olarak ise, örneğin, vb PBS (fosfat tamponlu tuzlu su), HEPES (4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit) gibi diğer tamponlar İki Termomikserler kurmak; 95 ° C'ye kadar bir set olarak ve çevre koşulları (Bu çalışmada ~ 20 ° C), diğer tutun. Bir buz kovası hazırlayın. Isı / 100 ul kütüphane koyarak DNA kütüphanesinin soğutmak ek (~ 10 15 -10 16 dizileri için 2,5 nmol) Thermomixer set5 dakika boyunca T 95 ° C. Manyetik boncuk (bölümler 3,1-3,6) hazırlanır ise buz tüpü yerleştirin. Λ = 260 nm'de UV absorpsiyon yolu ile DNA kütüphanesi gerçek konsantrasyonunu belirlemek kütüphane için uygun dönüştürme faktörü uygulanması. Hedef çözünürlük için orta uygun hedef stok çözümleri hazırlayın. DMSO 100 mM analit stokları hazırlayın. Çevre şartlarında muhafaza, ancak farklı hedeflerin çeşitli çözünme profillerini gösteren zaman stokları yaklaşık 1 ay için geçerli değildir. Manyetik Boncuk ve Seçme Başlangıç ​​Round 3. Hazırlık Vorteks 6.7 x 10 8 boncuk / ml streptavidin-kaplı manyetik boncuklar ve yeni bir mikrosantrifüj tüpüne 400 ul çıkarın. 2 dakika için mıknatıs üzerinde tüp yerleştirin ve süpernatant kaldırmak. Bağlama tamponu, vorteks 400 ul ekleyerek, ve yerleştirdikten sonra süpernatant aspire boncuk yıkayınmıknatıs tüp boncuk ayırmak için. Bu işlemi üç kez tekrarlayın. 50 uM (nihai) yakalama sondası ile 400 ul bağlanma tamponu içinde yeniden süspansiyon haline getirilmesini boncuklar ve çevre koşullarında termomikser nazik çalkalama ile 10 dakika boyunca inkübe edilerek, manyetik boncuklar üzerinde yakalama sondası hareketsiz. Ücretsiz yakalama probu kaldırmak için bölüm 3.2 açıklanan yıkama adımları tekrarlayarak boncuk bağlama tamponu 400 ul üç kez yıkayın. Bağlama tamponu, 400 | il boncuk tekrar. Bir sonraki adım için boncuk çözeltisi 100 ul çıkarın ve üç haftalık bir süre için fazla seçim turu için kullanılacak, 4 ° C'de, kalan 300 ul tutar. Bölüm 3.2 de tarif edildiği gibi bağlama tamponu, 200 | il ile iki kez boncuk yıkayın. Yıkanan boncuklara Bölüm 2.3 çıtçıtın 100 ul DNA soğutuldu ekleyin ve çevre koşullarında termomikser kullanılarak hafif çalkalama ile 30 dakika süreyle inkübe edin. NNOT: ilk turda DNA konsantrasyonları benzersiz diziler teorik mevcut önceki turda dizisi kaybını en aza indirmek için sonraki turda daha yüksektir. Bölüm 2.3 UV emiliminin kullanarak süpernatant DNA ölçmek ve boncuk bağlı DNA miktarını değerlendirmek için bölüm 3.7 eklenen ilk miktarda bu çıkarma. 200 ul ortam koşullarında, 5 dakika için bir termomikser üzerinde hafif bir çalkalama ile bağlama tamponu ile iki yıkama ve ardından bağlanma tamponu 200 ul boncuk yıkayın. Bağlama tamponu içinde 100 uM hedefin 200 ul boncuk tekrar ve çevre koşullarında 30 dakika termomikser üzerinde döner. Hedef ve kontrol zamanla sulu çözelti dışarı agrega gözlendi çünkü öncesinde seçime her gün başında çalışan çözümler taze hazırlayın. Hedef elüt sekansı içeren süpernatan çözeltisi koruDaha ileri çalışma s. Bölüm 3.8.1 hazırlanan boncuk 1 mcM progesteron 200 ul ekleyerek 1-2 tur tamamlandıktan sonra negatif seçim yapın. Normal koşullar altında termomikser üzerinde 30 dakika boyunca yavaşça çalkalayın. Boncuklar çekmek ve Bölüm 3.9 de olduğu gibi önce kortizol ilave bağlama tamponu, 200 | il iki kez boncuk yıkama supernatant manyetik stand kullanın. 4. Zenginleştirme İzleme, PCR ve tek şeritli DNA üretimi Seçim zenginleştirme izlemek için bir diyaliz kasetine süpernatant çözüm ekleyin. Diyaliz kortizol mevcut olduğu için DNA daha yüksek konsantrasyonlarda elüt DNA'dan kortizol çıkarmak için gerekli olan, ve, aynı zamanda, standart DNA UV λ max = 260 nm üst üste binen bir UV absorpsiyon tepe noktasına sahiptir. Bu adımı seçimi ilk turda her turda (mermi 2, 4, 6, 8 ve) gerçekleştirin. Bu örnek los azaltırs Her dizinin potansiyel birkaç kopya sayıları mevcut (en yüksek çeşitlilik) olduğunda. Daha hızlı sonuç için, boyut dışlama sütununa gibi alternatif yöntemler de kullanılabilir. Iki çevre koşullarında 2 saat süre ile bağlama tamponu taze 250 ml numune ile kaseti Dialyze. Tampon değiştirin ve 4 ° CO / N inkübe. Hedef tarafından akıtılan DNA yüzdesini belirlemek için UV spektroskopi ile diyaliz havuz analiz (bölüm 3.8 sonuçlarına karşılaştırın). / Hac etidyum bromid ağ% 1 ile% 3 agaroz jel hazırlayın. Bu çalışmada, agaroz 1.5 g, TAE tamponunda (40 mM Tris asetat, 1 mM EDTA, pH = 8.0) içinde, 50 mi, ve etidiyum bromür 10 ul bir jel hazırlanır. ~ 5-15 döngüleri kullanılarak küçük bir ölçekte, PCR (5 x 50 ul tümbölenler) gerçekleştirerek diyaliz havuz Çevrim optimize eder. PCR bileşenleri için, 1 x PCR reaksiyon tamponu (tüm nihai konsantrasyon), 200 uM dNTP, DNA şablonu,% 10 reaksiyon hacmi, 500 nM her primer ve 2.5 kullanımıU polimeraz (2.5 U / ul stok). Çalışma, PCR, 2 dakika boyunca 95 ° C 'de koşulları optimize 95 ° C (30 saniye), 55 ° C (30 saniye) tekrar tekrar çevrimleri ile, ardından 72 ° C'de (1 dakika), daha sonra 72 ° C'de (10 kullanılarak dak) son uzatma, 4 ° C'de tutun. Karşılaştırma için 25 bp standart merdiven İstihdam ve bir jel görüntüleyici görselleştirmek. Istenmeyen yan ürünler olmaksızın doğru boyutta işaretleyici en yüksek yoğunluk bandı üreten döngü sayısını seçin. 6x Mavi / turuncu yükleme boyası 2 ul her bir PCR çevriminde, 10 ul birleştirilmesi ve adım 4.4 (45 dakika için 125 V) 'de hazırlanan% 3 agaroz jel, 5 ayrı oyuklarına yükleyerek çevrim optimizasyonu sonuçlarını analiz etmek. Bölüm 4.5 belirlenen koşulları ve uygun devir sayısı kullanan büyük ölçekli PCR gerçekleştirin. Tipik PCR reaksiyonlarının 6-8 ml bu seçimde her tur için kullanılan 1-2,5 nmol elde istendi. Basitleştirmek için 8-şerit tüpleri kullanınGerekli sayıda boruların ele PCR amplifikasyonu için bu hacim bölmeyin için. Bölüm 4.4 de tarif edildiği gibi, bir% 3 agaroz jel hazırlayın ve PCR ürün bandı bölümlerinde 4.5.2-4.5.3 aşamaları aşağıdaki doğru konumda görünür olduğunu doğrulamak. Aşağıda belirtilen aşamalarla tek sarmallı DNA'ya 4.7 kadar tüm çift bükümlü DNA ürün dönüştürme: Süzgeçler tarafından engellenen bir küçük sütuna streptavidin kaplı boncuklar (manyetik değil) 300 ul ekleyin. 5 ml luer-lock şırınga takılması ve pistonu hafif bir basınç uygulayarak bağlama tamponu ile boncuk yıkayın. Sütundan şırınga çıkarın ve boncuk piston aspirasyon rahatsız değil bu yüzden her malzemenin eklenmesinden sonra şırınga off-line pistonu çıkartın. PCR ürün ekleyin ve pistonu hafif basınç kullanarak sütun aracılığıyla geçmek. PCR ürününün fazla 1-1.2 daha mi her sütun ilave edilir, öyle ki birçok sütun kullanın. Son fl atınakış yoluyla DNA bu yana anti-sens şeridi üzerinde, biyotin parça ile kolon üzerinde muhafaza edilecektir. Bağlama tamponu, 5 ml ile kolon yıkayın. 0.2 M NaOH, 0.5 ml ilave etmek suretiyle DNA Dehybridize. O tek şeritli anlamda DNA içerdiği eluatın saklayın. Nükleaz içermeyen su ile yıkama ile hazırlanan bir tuz giderme kolonu 0.5 ml ilave 0.2 M NaOH içinde ssDNA tuzunun giderilmesi. Daha sonra 1 ml nükleaz ücretsiz su ekleyin ve bu tuzdan arındırılmış ssDNA örnek toplamak, ilk 0.5 ml sıvıyı atın. Çoklu tuz giderme sütun kullanılması, her 0.5 mi bölümü için gerekli olacaktır. Λ = 260 nm'de UV absorpsiyon yolu ile elüt DNA konsantrasyonunun belirlenmesi. Vakum örnek kurutun ve bağlama tamponu içinde, uygun bir hacim içinde sulandırın. Seçim sonraki tur için elde edilen yeterli DNA orada değildi, bölümler 4.6-4.9.2 tekrarlayın. Seçme ve sıralamaya 5. sonraki turlar Zenginleştirme izleme (bölüm 4.1) sonuçlarına bağlı olarak seçim koşullarının sıkılığını ayarlayın. Genellikle, havuzdan en yüksek afinite bağlayıcı seçmek için art arda seçim turlarında koşulları daha sıkı hale. Not: Bu, negatif seçim bileşiğinin konsantrasyonu, veya diğer yöntemlerle 27 çeşitli artan konsantrasyon, azalan DNA konsantrasyonunun arttırılması yıkama adım sayısı, zaman veya hacminin arttırılması için olan bir kombinasyonunu içerebilir. Hedef molekül için dizilerin özgünlüğünü sağlamak için uygun olarak uygun kontrolleri uygulayın. Bu çalışmada, sistem (Tablo 1) yuvarlak 3 başlayan ve seçimi boyunca konsantrasyon içinde artan bir negatif seçim molekül (projesteron) uygulanır. Yuvarlak 11'de başlayarak, 10-20 mcM progesteron önce (bölüm 3.7 öncesi) boncuk hareketsizliğe 30 dakika DNA havuzu ön-kuluçkaya yatmaktadır. </li> Maksimal zenginleştirme görülmektedir sonra yakalama sondası uzunluğunu artırın. Uyumlu astar ve bir yüksek sadakat polimeraz PCR amplifikasyonu ile sıralama için maksimum zenginleştirilmiş (yuvarlak 13) ve minimal zenginleştirilmiş (yuvarlak 6) koşullarını temsil eden nihai havuz (yuvarlak 15) ve diğer havuzları hazırlayın. 1x (reaksiyon tamponu) nihai konsantrasyonlarda kullanarak bir 50 ul reaksiyon hacmi, 200 uM (her dNTP), 400 nM (her bir primer) DNA havuzu, 0.5 ul ve polimeraz 0.5 ul ayarlayın. Döngü son uzantısı için 72 ° C'de 7 dakika tutun hariç aynı PCR koşulları kullanılarak bölümde 4.5 anlatılan adımları kullanarak yuvarlak her biri için optimize. Iyice yapışkan olmayan şal ile mühürlü kapakları mikrosantrifüj tüpler bir sıralama tesisine hazırlanan havuzlar 50 ul gönder. Bubble wrap ve gemi O / N sıralama tesisine buz paketleri ile dolu bir 15 ml konik tüp tüpler yerleştirin. </ol> Sıralı havuz (ler) zenginleştirme değerlendirmek için her bir dizinin kopya sayısı belirler. Sıralama tesisi tarafından sağlanan tüm havuzlarda için veri tekrarlanan her dizinin frekansı / kopyalama numaralarını belirlemek için FASTA formatında nesil dizileme veri adımlar (Ek Kod Dosyası bakınız) sıralama / kod yazma kullanın: En yüksek kopya sayısı dizilerinin özgünlüğüne ve çekimine analiz. etkileşim (protein veya küçük molekülü), bağlanma üzerine aptamer yapısal özellikleri ve beklenen afinite tipi uygun olan yöntemi belirleyecektir. Bu konu referans 1,28-30 bir dizi daha ayrıntılı olarak gözden geçirilmiştir. 6. AuNP sentezi ve algılama Sitrat indirgeme yöntemi kullanılarak 21 AuNPs sentez. Kaynama noktası 2, 50 mM HAuCl 4 ml ısı ile Millipore su 98 ml karıştırın. 38.8 mM sodyum sitrat, 10 ml ilave edilirreflü başlar kısa sürede. Renk birkaç dakika sonra kırmızı renge döner. Isı kapalı 20 dakika süre ile çözelti karıştırmaya devam edin. AuNP çözelti bir 0.2 um poliester zarından daha sonra oda sıcaklığına soğumaya filtre izin verin. Bir koyu kehribar şişe tüm AuNP süspansiyonlar saklayın. 2.4 x 10 8 L'lik bir mol-1 cm-1 31 sönüm katsayısı kullanarak UV absorpsiyon yolu ile AuNP konsantrasyonu hesaplanır. konsantrasyon, dinamik ışık saçılması ile belirlenmiştir 21 17 ± 0.6 nm arasında bir boyuta sahip, bu çalışmada 10 nM idi. Alüminyum folyo ile korunmaktadır oda sıcaklığında 1 saat süre ile 10 nM AuNP ile DNA inkübe edin. AuNP hacmi istenen tüm testler izin vermek için yeterli bir çözüm sağlamak için Vary (~ 1-2 ml). 73, 120, 200 ve D / NP (AuNP başına DNA moleküllerinin) yükleme yoğunlukları bu çalışmada incelendi ve hacim ve konsantrasyonları buna göre değişecektir. HEP 1: DNA seyreltin / AuNP çözelti 1ES tamponu (20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH = 7.4). Karışım, alüminyum folyo ile, oda sıcaklığında dengelenmeye bırakın. NOT: Bu aşama için gerekli zaman araştırmacı tarafından optimize edilmesi gerekir. Bu çalışmada, birkaç dakika ila O arasında kez / K araştırılmıştır. Analit (kortizol, kolik asit, 2-metoksinaftalen) DMSO 100 mM stok çözümler hazırlayın ve alüminyum folyo ile kaplayın. Kortizol bağlayıcı tampon (bölüm 2.1) 1/3 seyreltme 100 mcM stok seyreltilmesi ile her bir deney için taze başlangıç ​​çözümler önce yapın. Bundan başka 1/3 bağlama tamponu ile ilk çözelti seyreltik şekilde hedef sabit bir hacmi (10 ul), bir dizi konsantrasyonunu üretmek için ilave edilir. 03/01 bağlanma tamponu 10 ul DNA / AuNP çözeltisi 80 ul ekleyerek gerekli tuz konsantrasyonu optimize ("boş" olarak anılacaktır). RT sonra NaCI solut farklı hacimleri ilave 20 dakika boyunca inkübe ediniyonu temsil etmektedir. Tuz ilavesiyle (Bu çalışmada kullanılan 1 M NaCl 13-40 ul) daha sonra mavi bir renk tonu doğru ancak gözle değişim olmaktadır tuzu hacmi için bak. Bu iyi bir başlangıç ​​noktası sağlar, ancak hedef ek dahil olmak üzere sonuçlarını izleyen başka ayarlanması gerekebilir. Hedef çözeltisi 10 ul DNA / AuNP çözeltisi 80 ul birleştirin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir. Her bir boşluk (Bölüm 6.8) de dahil olmak üzere, eş zamanlı olarak birden fazla hedef konsantrasyonlarını analiz etmek için bir 96 oyuklu plaka ve çok kanallı pipet kullanmaktadır. NaCI çözeltisinin uygun bir hacmi (1 M NaCl 13 ul Bu çalışmada uygulanmıştır) ilave edilir ve hemen, bir plaka okuyucu kullanılarak 650 ve 530 nm'de absorbans analiz eder. Boş ölçümü, hedef konsantrasyonu normalize akrabası karşı absorbans değerlerinin oranı (E 650 / E 530) olarak sonuçları çizilir.

Representative Results

koşulları darlığı başlangıçta ilk birkaç turda düşük kopya numaraları mevcut bağlayıcıların korumak için düşük tutuldu. İlk tur, özellikle, tipik olarak yüksek kortizol ve DNA konsantrasyonları ve negatif seçim adımları eksikliği ile gösterilir, eşsiz dizilerin olarak sunulan bağlayıcılar korumak için düşük bir katılığa uygulamaya koymuştur. Bu aptamer seçimi başarılı mermi 12-13 (Tablo 1) göre sabit kalır hedef ile elüte daha yüksek bir fraksiyonuna hedef (yuvarlak 2) ile elüte düşük bir yüzde ile havuzlar evrimi ile ortaya konmuştur. Hedef tarafından akıtılan DNA Bu plato geleneksel seçimi ("zenginleştirme") bir uç noktasıdır. Bununla birlikte, bu yöntem, bundan başka, cDNA yakalama probunun uzunluğu (Şekil 1) giderek artan ile zenginleştirmeden sonra seçim sıkılığını kaldırdı. Bu prob Uzatma CDN arasındaki melezleme gücünü arttırırA ve havuz kompleksinin erime sıcaklığına (Tm) artırmak, ve solüsyon içine bağlayıcı dizileri serbest bırakmak için hedef ve dizi arasında daha güçlü bir etkileşim gerektirir. Seçimin başlangıç ​​yuvarlak nedeniyle kütüphane 5'ucunda bir daha G tabanına zayıf cDNA etkileşimi hayata. Bu ilk turda genel olarak daha düşük sertlik koşulları ile uyumlu olan ve önemli ölçüde bir sonraki seçim turu geçmek için daha fazla potansiyel bağlayıcı ve ayrıca (dehybridize termodinamik göre) arka dizileri izin vererek başka seçimi etki beklenmemektedir. Seçim sonraki seçim turlarında yüksek sıkılık koşulları uygulayarak zenginleştirme doğru devam Bunlar arka plan dizileri minimize edildi. CDNA, yuvarlak 14 bir 8-mer bir 7-mer ile ilgili uzatılmış zaman, hedef ile elüt DNA yüzdesi Tm 11.1% 15.3% düşürülür 26.7 ° C ile 19.2 ° C artmıştır. cDNA wolarak daha% 3,3 yıkanarak toplam bırakarak, 31.3 ° C, T m turda 15 9-mer uzatıldı. Zenginleştirme hakkında daha fazla bilgi, her turda havuzları ilerlemesini izlemek üzere, çok sayıda havuz, hem zenginleştirilmiş olmayan zenginleştirilmiş örnekleri dizilenmesi ile elde edilebilir. Yeni nesil sekanslama (NGS) yüksek sıra, Sanger sekanslanması ile karşılaştırıldığında (dizilerin toplam sayısı hesaplanır) elde edilir okur, çünkü esas olarak bir seçim, sıralama için güçlü bir yöntem ortaya çıkmıştır. Bu yüksek dizisi, havuzda dizilerin toplam sayısı bir fazla kapsama alanı sunmak dizilerin çeşitliliği daha kapsamlı bir resmini veren okur. NGS da klonlama önyargı 32 kaldırır ve barkodları 24,33 ilavesi ile tek bir toplu birden havuzlarının sıralama için izin verir. NGS Bu örnek seçimi üç ayrı havuzları (Şekil 2) zenginleştirme ilerlemesini analiz etmek için kullanıldı. Havuzlar6, yuvarlak 13 (en yüksek zenginleştirme) ve yuvarlak 15 (en yüksek sertlik) (hafif zenginleştirme yıkandı göre% yuvarlak 2 ile karşılaştırıldığında) yuvarlak seçimden temsili noktaları olarak seçildi. dizisinin toplam sayısının bir yüzdesi, her bir havuz için okur benzersiz her dizinin kopya sayısı çizilmiştir. sırada üst (en yüksek kopya sayısı) dizisi sadece tüm turda 6 dizilerin (33.435 toplam dizileri, 22.463 benzersiz dizileri) 0.1% oluşturmuştur. Havuz maksimum yuvarlak 13 zenginleştirilmiş hale geldikçe, üst sıradaki dizi artar UV tarafından gözlemlenen zenginleştirme sadece bir ~ 5x artışa rağmen turda 6 daha yüksek 150x tüm havuz 15.4% (17.681 toplam dizileri, 2,987 benzersiz dizileri), ihtiva etmek . Yuvarlak 15 (28.919 toplam dizisi 2.980, okur benzersiz dizileri), UV zenginleştirme izleme hedef tarafından akıtılan miktar yuvarlak 13 daha ~ 5x düşük olduğunu gösterdi rağmen tek üst sıradaki dizisi ile temsil edilen tüm dizilerin 44.9% 'e fırladı ( Tablo 1 </strong>). Zenginleştirme Ayrıca havuz potansiyel hedef bağlama birkaç dizilerinden birçok gelişir benzersiz dizilerin alt yüzdesi (yuvarlak 15'te% 10 turda 6 67%) tarafından gösterilmiştir. CDNA uzunluğu uzatıldı ve yuvarlak 13'ünde ikinci sırada dizisi yuvarlak 15 en yüksek kopya sayısı dizisi olduktan sonra Ayrıca, yuvarlak 13 (15-3) üst sırada dizisi yuvarlak 15'te üçüncü en yüksek kopya sayısı dizisi oldu (15 1): 15-1 GGAATGGATCCACATCCATGGATGGGCAATGCGGGGTGGAGAATGGTTGCCGCACTTCGGCTT CACTGCAGACTTGACGAAGCTT 15-3 GGAATGGATCCACATCCATGGGAGGGTTGGAAGGGAGGGGCCCGGGGTGGGCCATCGTTCGTT CACTGCAGACTTGACGAAGCTT Önceki çalışmalarda mikro Termoforosis ve denge diyalizi 24 bu iki dizinin bağlama incelenmiştir. Sonuçlar 6.9 ± 2.8 mcM denge diyalizi ile = dizisi 15-1 (K d bağlayıcı anlamlı kortizol gösterdi; 16.177; Mikro Termoforosis 0.6 mcM) minimal bağlanma sırasında kortizol ve dizisi 15-3 arasında gözlenmiştir. Bu yuvarlak 15'te yakalama probu artan uzunluğu daha yüksek afinite bağlayıcı ayrıştırmak için yüksek sertlik koşulları sağlayan destekli olduğunu göstermektedir. Buna ek olarak, hiçbir sekans negatif seçim adımları eklenmesinin gösteren negatif seçim molekülü, progesteron için bağlanma gözlemlenebilir gösterilen prosedüre faydalı oldu. Daha yüksek çekimli bağlayıcı yüksek sıkılık koşulları tekrar seçim turlarına uygulanmıştır sonra (hedef ile elüte DNA yüzdesi analizi geleneksel yöntem ile saptanan) maksimal zenginleştirme ardından ortaya çıkan bu durum bir cDNA yakalama uzunluğu boyunca uzanan yöntemini doğrular sonrası zenginleştirme prob. Hedef için bir sıralı havuz ve afinite numarayı kopyalamak Bu sonuç gösterir yalnızca con, belirli koşullar altında 24,34 ilişkili olabilirdoğrudan bir ilişki 35 ima bir önceki rapor ile kontrast. Aynı zamanda oldukça yüksek sertlik koşulları yalnızca uygulandığı gibi sonraki bir turda doğal olarak değişebilir çoğu seçimleri ortak% yıkandı strateji ile daha NGS tarafından izlenmesi zenginleştirme yarar vurgulamaktadır. Benzer koşullar birkaç tur boyunca uygulanır, ancak elüt% denetim zenginleştirilmesi için yararlıdır. Örneğin, zenginleştirme anlamlı bir değişiklik (Tablo 1) ile, 6-10 katılan tüm benzer koşullar yuvarlar. Bu birkaç tur üzerinden bakıldığında, şartlar olasılıkla zenginleştirme teşvik için çok sıkıdır, ve araştırmacı bir sonraki turda sıkılığını azaltmak gerekir. , Ayarlamak için bir rehber olarak hizmet verebilir yıkandı,% Örneğin, kortizol konsantrasyonu turlarında 11-13 100 mcM 35 uM çıkarılmış ve% nedenle turda 12 14,5% yuvarlak 10'da% 2.5 yükseldi Seçılen bir seçim sırasında darlığı similar koşullar tur için karşılaştırıldığında, ve bir seçim son nokta belirlemek için NGS tamamlayıcı bilgiler verebilir. Sekans 15-1 şekilde seçilen bir sekansı, bir yapı anahtarlama aptamer bir yanıt elde etmek için bağlama hedef bir yapısal değişiklik dayanan bir deneyde işlev görecek üretilmesi için olup olmadığını belirlemek için, bir AuNP deneyi uygulanmıştır. Önceki ilk çalışmalar 15-1 ile AuNP tahlil stres biyolojik belirteç kortizol cevap, ancak stres, epinefrin ve norepinefrin, ya da kolik asit değil diğer iki belirteçler, yapısal olarak benzer karaciğer hastalığının bir göstergesi 24 kortizonun gösterdi. tepki kortizol bağlanması üzerine, yapısal bir değişiklik için seçilir aptamer AuNP deneyinde bir yanıt oluşturan doğrulayarak insan serumu (~ 150-600 nM) 6, bildirilen serbest kortizol normal aralığı içinde gözlenmiştir. Bu akım çalışmada, sistemin karakterizasyonu ayarlayarak bir adım daha ileri alındıAuNP yüzeyinde 15-1 kapsama (yoğunluk). Koşullar aynı seti kullanarak, DNA kapsama 120 D / NP 200 D / NP (Şekil 3), 73 D / NP (DNA molekülleri / AuNP) çıkarılmıştır. Kolik asit 200 D / NP 10 uM haricinde en az bir yanıtı üretilebilir. algılama sınırlarını (LOD) yaptığı gibi kapsama olarak azaldığı testin cevabı artmıştır. LOD 73 D / NP, 120 D / NP için 145.2 nM ve 200 D / NP için 27.3 mcM için 29.5 nM idi. Bu sonuç, aptamer kapsama 300 D / NP 36 60 D / NP yükselmiştir zaman kokain aptameri kullanan bir AuNP testinin cevap azaldığını gösterilen Smith ve ark. Çalışmalarıyla katılıyor. Bu ilgili hedef için algılama aralığı ayarlanabilir AuNP tahlilinde DNA yüzey kaplama optimize göre edilebileceğini gösterir. Örneğin, karşılaştırırken bu yararlı olabilir, insan serumu insan tükürük karşı (~ 150-600 nM) (~ 5-25 nM) serbest kortizol aralığı <sup> 6,37. Fizyolojik sıvılar bu tampon tahlil çok daha karmaşık olsa da, sonuçları uygulamaya bağlı AuNP koşulları ayarlanabilir gösteren kanıt-prensibi çalışmaları bir uzantısı ve biyolojik sıvılarda orta genişletilmesi olacağını doğru olduğunu daha fazla iş sağlamak biyosensör topluluğun ilgileneceği. Şekil yapısı anahtarlama seçim yönteminin 1. Genel Bakış. Küçük bir biyotinlenmiş cDNA yakalama sistemi streptavidin kaplı manyetik boncuklar üzerinde immobilize edilir. cDNA boncuk kütüphane hibridize, kütüphanenin 5'bölgeye tamamlayıcıdır. Hedef eklendiğinde, bir uyum değişikliği bir mıknatıs uygulanarak kolaylaştırılabilir bölümleme sağlayan topuk bağlayıcı dizileri serbest bırakmak için indüklenir. Süpernatan (%, DNA th ile elüte zenginleştirme izlemek için korunurDNA hedef diyaliz sonra UV e hedef). Hedef molekülü, DNA ile aynı UV aralığında emer, bu adım gereklidir. Diziler sonra PCR ile çoğaltılan ve seçim aşağıdaki turu için hazırlanır. Seçim ilerledikçe, negatif seçim negatif seçim molekülü ile elüt dizileri atılır burada, uygulanır ve potansiyel hedef bağlayıcılarla yapılan boncuklar daha sonra hedef ile inkübe edilir. cDNA probu uzunluğu seçimi sertliği arttırmak için maksimum zenginleşmesi (elüte%), aşağıdaki artar. Bu rakam 24 izniyle olmuştur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Yuvarlak [Kortizol] (uM) [Progesteron] (uM) Bağlanmış DNA, (pmol) % Hedef tarafından yıkanan cDNA Uzunluğu 1 100 0 357,57 N / A 7-mer 2 50 0 145,49 1.4 7-mer 3 50 1 188,74 N / A 7-mer 4 50 5 336,4 2.3 7-mer 5 35 5 88,05 N / A 7-mer 6 35 10 303,89 3.1 7-mer 7 35 10 255,01 N / A 7-mer 8 35 10 236,81 <td> 2.1 7-mer 9 35 10 318,95 2.6 7-mer 10 35 10 297,18 2.5 7-mer 11 100 10 147,61 N / A 7-mer 12 100 10 154,36 14.5 7-mer 13 100 10 150,39 15.3 7-mer 14 75 20 247,71 11.1 8-mer 15 50 40 409,63 3.3 9-mer % Elüsyon 24 <tablo 1. seçim ilerlemesi ve zenginleştirme (uygulanamaz) strong>. Yok / A diyaliz / UV zenginleştirme izleme, düşük kopya sayısı dizilerinin kaybını azaltmak için erken seçim turlarında yapılmadı tur için bildirilmiştir. Bu tablo 24 izniyle olmuştur. Gelecek nesil dizileme tarafından belirlenen Şekil 2. Seçim zenginleştirme (A) Yuvarlak 6.; (B) Yuvarlak 13; (C) Yuvarlak 15. Diziler numarasını kopyalamak göre sıralanmıştır. En yüksek kopya sayısı dizisi havuz kortizol bağlayıcı dizileri için zenginleştirilmiş gibi yuvarlak 15 (44.9%) yüksek yüzdesi turda 6 (% 0.1) bütün sıralandı havuz düşük bir yüzdesini oluşturan yükselmiştir. Bu rakam 24 izniyle olmuştur.et = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız. Aptameri 15-1 kapsama değişen gelen Şekil 3. AuNP tahlil yanıtı. AuNPs ile kuluçkaya aptamer yoğunluğu 120 D / NP (yeşil kare) ve 200 D / NP (için, 73 D / NP (kırmızı üçgen) yükseltilmiştir mavi daire). Kortizol yanıtları cesur renkler, kolik asit tepki açık renklerde olduğunu. Tahlil tepkisi böylece LOD ve hedef içinde tespit edilebilir aralığı düşürücü, düşük yoğunluklarda kortizol için geliştirilmiş. En yüksek kortizol yanıtı (73 D / NP) ile şartlar nM 5-25 (insan serumu (~ 150-500 nM) ve tükürük bildirilen serbest kortizol beklenen normal sınırlarda daha fazla puan sağlamak için lineer aralıkta daha karakterize edilmiştir ) 6,37. Aynı 73 D / NP koşulları uygulamak kolik asit minimum tepki olması vardırtr önceki çalışmalarında 24 ayrıntılı. Tüm araziler yinelenen veya üçlü ölçümleri için SEM ± ortalamasını temsil etmektedir. . PCR döngüsü optimizasyonu Şekil 4. Temsilcisi sonuçları itibaren kuyu sağa sola temsil: 4 döngüleri, 6 kür, 8 döngüleri, 10 döngü, 12 döngüleri, negatif (hiçbir DNA şablon), 25 bp DNA merdiveni standardı. Optimal koşullar tek bir ürün grubu yüksek döngü mevcut aşırı büyütme ürünleri olmadan yüksek yoğunlukta 8 döngü, gözlenir. Şekil 5. AuNP deney kuluçkalama süresi optimizasyonu. 73 D AuNP / DNA aşamasının inkübasyon süresi / NP O düşürülmüştür / H (Şekil 3), 30 dakika ve hedef inculenme hemen tuz ilavesiyle yerine 20 dakika (Şekil 3) daha sonra takip edildi. (A) yanıt kortizol (mavi elmas) için gözlemlenen ama değil kolik asit (yeşil daireler) veya 2MNP (2-metoksinaftalen; kırmızı kareler) için. Tüm araziler yinelenen veya üçlü ölçümleri için SEM ± ortalamasını temsil etmektedir. Soldan sağa (B): Boş, 10 uM kortizol, 10 uM kolik asit, 10 uM 2MNP. Görsel değişiklik kortizol için çıplak gözle görülebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Küçük moleküller, biyolojik açıdan ilgi çeken, fakat sadece rapor edilen tüm aptamers% 19'unu oluşturur olması büyük önem küçük moleküller için de geçerlidir aptamers seçilmesi için tasarlanmış yöntemler hale getirir. Küçük moleküllerin SELEX protein 1 ile karşılaştırıldığında dizileri ile etkileşim için uygun olan, daha az işlevsel grup, yapısal motif ve yüzey alanı gibi, özellikle zordur ve bu teşebbüs bütün hedefler için seçimleri arasında% 30'dan daha az bir aptamer neden olduğu tahmin edilmiştir 38. Bu nedenle, bir başarılı bir küçük molekül hedefine bir aptamer seçmek için deneysel tasarım ve yürütme derece farkında olmalıdır.

Bu bağlanma özelliklerini değiştirebilir herhangi bir kimyasal değişiklik gerekmeksizin küçük moleküller için de geçerlidir, çünkü, bu çalışmada tarif aptamer seçim yöntemi, avantajlı olmaktadır. Aynı zamanda, T yana anlamına gelir göre elüsyon, birilgi konusu moleküle bağlayıcı yüzer arabelleğe serbest olduğundan, DNA, daha çok hedefe göre, ilk olarak kordon matris etkileşim DNA seçimi bir sonraki tur için büyütülmüş olmayacak, daha sonra hedef manyetik boncuklardan ayrıştırılmıştır bağlı ve spesifik olmayan matris bağlayıcı bağlı kalır. Bunun tersine, matriks karşı bir negatif seçim yöntemi matris etkileşim DNA hedef bağlayıcı 1 ek olarak amplifiye edilebilir, çünkü katı desteğe her turda hedef hareketsiz yöntemleri için gereklidir. Geçerli yöntem Tm sınırlı seçim stratejisi olarak tasarlanmıştır. Bu cDNA / havuz hibritleme Tm oda sıcaklığına yakın tutulması anlamına gelir. Morse benzer bir strateji kullanılır, ancak, 4 ° C'de 17 seçilim koşulları ile bir T m <10 ° C olan bir 6-mer cDNA probu uygulanır. Başvurumuz, oda sıcaklığında yapılan bir biyo-algılayıcı analiz için, yani cDNA uzunluğu göre ayarlandıly. Hedef bağlanma etkileşimi bağlayıcı cDNA bozabildiklerini yapısal bir değişikliğe neden olmayan bir uzak bir konumda gerçekleşir, çünkü potansiyel bağlayıcı kaybolmaz şekilde bu kadar düşük bir seçim sıkılığını devam eder. Bazı diziler yalnızca termodinamik dayalı dehybridize çünkü Ancak, önerilen yöntemin bölümleme verimliliği düşüktür. 15-mer Tm küçük bir molekül hedef ile boşaltılması için çok yüksek olduğundan farklı olarak, Nutiu ve ark., Bir 15-mer cDNA uygulanır, ve muhtemelen sadece dört hedeflerin iki aptamers tespit etmişlerdir 18. Bu nedenle, mevcut seçim stratejisi seçimi darlığı kontrol ve başarı olasılığı artacaktır potansiyel bağlayıcı kaybını en aza indirerek, arka plan dizileri kaldırmak için çok sayıda mermi gerektirir iken.

Aptamer seçimi yeni Birçok araştırmacı PCR ile ilgili önemli yönlerinden habersizpotansiyel bağlayıcı maddeleri içermektedir. DNA kütüphanelerinin fazla amplifikasyon yan ürünlerin yüksek devir sayılarında (boyut tipik olarak daha büyük) istenmeyen üretir, ve istenen ürün tamamen sadece 5 döngü 39 fazlası ile kaybolabilir için döngü optimizasyonu (Bölüm 4.5) gereklidir. Aşırı büyütmesi durumunda, PCR ürünleri artık hedef ile elüte olan sekansları temsil eder ve seçim başarı olasılığı önemli ölçüde azalır. 4 Bu çalışma içinde 5 hafta arasında, döngü optimizasyonu bir örneğini göstermektedir Şekil. düşük döngüsü en az bir ürün grubu, 8 döngü aracılığıyla miktarda bant artışı üretir; 10 döngü de bant daha yüksek bir boyut boyunca amplifikasyon ürününe geçiş başlar ve neredeyse bütünüyle 12 döngü içerisinde aşırı amplifiye edilmiş ürün oluşur. Birçok araştırmacı ardı edebilir SELEX deneyimsiz bir diğer detay, tüm havuz, büyük ölçekli PCR amplifikasyonu amplifiye gerektiğini köknar (bölüm 4.6) 'dirst yuvarlak bağlayıcı kaybını azaltmak için. oligonükleotitlerin mümkün eşsiz dizilerin sayısını 4 dört nükleik asit bazları temsil 4 N, ve N kütüphane rasgele bölgesinde bazların sayısıdır. 1.2 x 10, 24 olası eşsiz dizilerin bir sekansları alanı ile sonuçlanan, bu iş, N = 40 için. Seçiminin birinci turda kitaplığın kullanılan 2.5 nmol karşılık gelir ~ 10 15 moleküller, her bir DNA kopyası muhtemelen tek bir dizi olarak ilk havuzunda temsil olduğu anlamına gelir. Bu nedenle, hedef tarafından boncuklardan yıkandı DNA, tüm hacim seçimi bir sonraki tur için her potansiyel bağlayıcı bir kopyasını korumak için güçlendirilmiş olmalıdır. Bu ilk amplifikasyon meydana geldikten sonra, birden çok kopya homojen bir çözelti örneği almak için kabul aşağıdaki tur seçim için kullanılabilir.

hedef konsantrasyonu da dikkatli bir şekilde her turda dikkate alınmalıdır. Nutiu ve ark. Kullanımıda seçim süreci boyunca, 1 mM hedef konsantrasyonu, ve Kd = 600 uM 18 ile bir ATP aptamer seçilir. Mevcut iş ve Morse 17 araştırma Hem seçim boyunca azalan, 100 mcM hedefi ile başladı, ve düşük mikromolar afinitelerle ile aptamers sonuçlandı. Tam sıkılık yuvarlak (alt hedef konsantrasyonu) zenginleştirme gözlendiğinde bağlıdır artmış gereken. Diğer önemli adım aptamerler hedef moleküle spesifite gösteren, böylece doğru negatif seçim adımları uygulamaktır. Kontrolleri kullanıldığı seçilen aptamer amaçlanan başvurusu üzerine şarta olduğunu. Örneğin, aptamer 15-1 kortizol için bir biyo-algılayıcı tahlilinde bir tanıma elemanı olarak çalışmak üzere tasarlanmış olan, bu nedenle fizyolojik sıvılar 40 bulunan kortizol bir metabolik ön-madde, çünkü projesteron bir negatif seçim molekülü gibi kullanılmıştır. Nutiu ve arkadaşları tarafından seçilen ATP aptamer. </ Em> negatif seçim adımı içerir, ADP, AMP, adenozin, ve dATP 18 de dahil olmak üzere yapısal olarak benzer moleküllerle etkileşim yoktu.

Göz için son bir not AuNP tahlil genellikle her aptamer / hedef çifti için önemli optimizasyon gerektirir. Tuz eklendikten sonra mavi bir renk tonu doğru bir zorlukla gözle değişiklik yaratıp tuz hacmi arıyorsunuz iyi bir başlangıç ​​noktasıdır, ama başlangıç ​​noktası ayarı bir yanıt gözlemlemek için gerekli olabilir. Ayrıca deney (tampon konsantrasyonu (tampon yüksek tuz konsantrasyonu, genellikle çekiş neden olduğundan, seçim tampon seyreltme olabilir) ve bileşim, DNA içerisinde derecesi (Şekil 3), numune hazırlama bazı organik göre büyük ölçüde farklı tepkiler üretir bulmuşlardır hedef çözmek için kullanılan çözücüler, yüksek maskeleri yanıt hedef arka plan), sıcaklık, tuz tipi ve konsantrasyonu ve doğmuş iyileşmesini neden olabilir(AuNP ve hedef DNA / AuNP her iki DNA) yon süresi. Tam olarak optimize edilmiş koşullar altında, sonuçlar, tipik olarak AuNP biyo-algılayıcı bir platform hızlı bir hedef yanıtın bir yarar gösteren, bir hedef inkübasyon süresi <5 dakika ile gözlenir. Örneğin, Şekil 5 aptamer inkübasyon süresi içinde / AuNP aşama, 30 dakika için O'dan / N (Şekil 3) indirgenerek ve tuz anında (<10 saniye) bir hedef ilave edildikten sonra yerine 20 dakika sonra (Şekil 3 ilave edildi ) 73 D / NP bir yükleme yoğunluğunda. Bu, daha önceki koşullar (Şekil 3) kullanılarak% 40 ~ karşı 10 uM hedef konsantrasyonda kortizol yanıtı için ~ boş (Şekil 5A) göre% 82 daha fazla artış göstermiştir. Bu yanıt çıplak gözle (Şekil 5B) ile ayırt edilebilir. Kortizol algılama lineer mertebeli bir önceki koşullar kullanılarak, bu koşullar istenen için optimize edilebileceğini göstermektedir farklı olduğuna dikkat edinizalgılama aralığı. Kolik asit ve 2-metoksinaftalen (2MNP) kontrol oluşturulduğunda anlamlı bir yanıtı (Şekil 5A-B) üretmemiştir. Araştırmacılar bu inkübasyon sürelerini azaltarak genel gelişmiş sinyal (hedef) veya arka (hedef olmayan moleküller) katkıda bulunabilir AuNP yüzeyi ile analit, artan yanıtını kolaylaştırabilir farkında olmalıdır. Bu nedenle, dikkatli AuNP tahlil tasarım ve performans karakterizasyonu her aptamer / hedef çifti için gereklidir.

Bu prosedür, hedef varlığını tespit etmek için DNA uygun bir değişiklik gerektiren, tarif AuNP deneyi gibi bir biyo-algılayıcı bir platform işlev küçük molekül yapısı anahtarlama aptamers seçilmesi için bir protokol açıklamaktadır. Bununla birlikte, bu yöntem, hemen hemen herhangi bir boyut hedef için aynı tesis çalışması gibi elektrokimyasal veya floresan gibi diğer biyosensör sistemlere uygulanabilir. protokol gücü daha da deneysel olarak geliştirilebilirçeşitli yaklaşımlar. İlk olarak, bir seçim kendisi potansiyel olarak azaltmak için yeterince güçlü ve küçük bir molekül hedef ile etkileşim için yeterince zayıf bir etkileşim sağlar / cDNA kütüphanesi hibridizasyon doğru Tm belirlenmesi gibi optimizasyon yöntemleri araştırılması ile geliştirilebilir arka sekansları termodinamiklerinden sadece dehybridized. Bu emek zaman tasarrufu ve reaktif tüketimini azaltarak, seçim için gerekli döngü sayısını yoğunlaşacaktır. Seçime değişiklikleri içine daha ileri araştırmalar dizilerinin çeşitli nüfus özellikle ilk turda hedef maruz şekilde boncuklar ve DNA'nın en uygun konsantrasyonları belirlemek olacaktır. Bu kanıt-prensibi deneylerin başarısı optimize ve fizyolojik sıvılarına AuNP tampon tahlil adapte yönelik daha fazla kaynak yatırım için temel sağlar. Hızlı, sağlam biyoalgı platformu için meşru bir ihtiyaç fu can vardırnction insan serumunda AuNP tahlilinde bir bireyin fizyolojik durumu ve tanı aracı, ve daha da geliştirilmesi gibi, ter veya tükürük bir bu mevcut boşluğu karşılar.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was performed while the author (JAM) held a National Research Council Research Associateship Award at Air Force Research Laboratories. Co-author MW held a Wright Scholar Fellowship supported by the Air Force Office of Scientific Research. This work was supported by Air Force Office of Scientific Research, Air Force Research Laboratory, and Bio-X Strategic Technology Thrust.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Dynabeads M280 Streptavidin Invitrogen 112.06D Compatible with DynaMag-2 Magnet
DynaMag-2 Magnet Invitrogen 12321D Compatible with Dynabeads M280 Streptavidin
Streptavidin Sepharose High Performance GE Healthcare 17-5113-01 This is a high density streptavidin product for ssDNA preparation
Hydrocortisone Sigma H4001 ≥98%
Progesterone Sigma P0130 ≥99%
Cholic Acid Sigma C1129 ≥98%
NanoDrop ND-1000 NanoDrop ND-1000 Replaced by ND-2000 model
Tris Base Promega H5135 ≥99.9%
Sodium Chloride Sigma S9888 ≥99.5%
Magnesium Chloride Hexahydrate Fluka 63068 ≥98%
500 mL Filter System Corning 430769 0.22 µm cellulose acetate membrane
DNA Library Operon Custom HPLC purified
All other DNA IDT Custom Capture probes and primers- desalted; Aptamers- HPLC
Thermomixer  Eppendorf R Any model with  temperature and mixing speed control will work
PfuUltra II Fusion HotStart DNA Polymerase, 400 rxn Agilent 600674 Taq polymerase can be used as well
Deoxynucleotide Mix, PCR-Grade  Agilent 200415 Other brands will work here
10x Cloned Pfu DNA Polymerase Buffer Agilent 200532 This buffer was optimized for PfuUltra II polymerase
GeneAmp PCR System Applied Biosystems 9700 Any model that allows researcher to open lid for cycle optimization will work
Agarose-LE Ambion AM9040 ≥99.9%
Ethidium Bromide Sigma E-1510 Acute toxicity, inhalation; suspected carcinogen
Empty Synthesis Columns, 1 µm Expedite Style Glen Research 20-0021-01 This model is ideal because of the Luer-Lok fitting to couple with syringe
Replacement Filters Expedite Glen Research 20-0021-0F 1 µm size
Illustra NAP-25 Columns GE Healthcare 17-0852-01 Any brand with DNA grade resin gel filtration column will work
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette ThermoFisher Scientific 66205 2k MWCO used
Gold(III) chloride hydrate Sigma 254169 99.999% purity is important
Sodium Citrate Dihydrate SAFC W302600 We have found that the compound produced from different manufacturers greatly affects AuNP assays
SpectraMax  Molecular Devices M5 Results were similar to Bio-TEK system
Synergy Bio-TEK HT Results were similar to Molecular Devices system
HEPES Buffer Amresco J848 Any brand that makes a sterilized product will work
250 mL Filter System Corning 430767 0.22 µm cellulose acetate membrane
UV Spectrophophotometer Varian Cary 300  Other brands will work here
5 mL Syringe Becton-Dickinson 309646 This model is ideal because of the Luer-Lok fitting to couple with Expedite column
ThermoEC Minicell Primo ThermoFisher Scientific EC320 Compatible with Power Supply
Power Supply Fisher Scientific FB300 Compatible with ThermoEC Minicell Primo
Dimethyl Sulfoxide Sigma D8418 Flammable liquid
2 Methoxynaphthalene Sigma 148245 99%
Assay Plate Corning 3370 96-well Flat Bottom, Sterile
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. McKeague, M., DeRosa, M. C. Challenges and opportunities for small molecule aptamer development. J. Nucleic Acids. 2012, 1-20 (2012).
  2. Gatti, R., Antonelli, G., Prearo, M., Spinella, P., Cappellin, E., De Palo, E. F. Cortisol assays and diagnostic laboratory procedures in human biological fluids. Clin. Biochem. 42, 1205-1217 (2009).
  3. Morgan, C. A., Wang, S., Rasmusson, A., Hazlett, G., Anderson, G., Charney, D. S. Relationship among plasma cortisol, catecholamines, neuropeptide Y, and human performance during exposure to uncontrollable stress. Psychosom. Med. 63 (3), 412-422 (2001).
  4. Michael, D. J., Valle, B., Cox, J., Lalns, J. E., Fogt, D. L. Salivary Biomarkers of Physical Fatigue as Markers of Sleep Deprivation. J. Clin. Sleep Med. 9 (12), 1325-1331 (2013).
  5. Kwak, J., et al. Volatile biomarkers from human melanoma cells. J. Chrom. B. 931, 90-96 (2013).
  6. Stevens, R. C., Soelberg, S. D., Near, S., Furlong, C. E. Detection of Cortisol in Saliva with a Flow-Filtered, Portable Surface Plasmon Resonance Biosensor System. Anal. Chem. 80 (17), 6747-6751 (2008).
  7. Arya, S. K., Ghornokur, G., Venugopal, M., Bhansali, S. Antibody functionalized interdigitated μ-electrode (IDμE) based impedimetric cortisol biosensor. Analyst. 135 (8), 1941-1946 (2010).
  8. Kapczinski, F., et al. Allostatic load in bipolar disorder: Implications for pathophysiology and treatment. Neurosci. Biobehav. Rev. 32 (4), 675-692 (2008).
  9. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
  10. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
  11. Ciesiolka, J., Gorski, J., Yarus, M. Selection of an RNA domain that binds Zn2. RNA. 1 (5), 538-550 (1995).
  12. Liu, J., et al. Selection of Aptamers Specific for Adipose Tissue. PlosOne. 7, e37789 (2012).
  13. McCauley, T. G., Hamaguchi, N., Stanton, M. Aptamer-based biosensor arrays for detection and quantification of biological macromolecules. Anal. Biochem. 319 (2), 244-250 (2003).
  14. Huang, L., et al. A label-free electrochemical biosensor based on a DNA aptamer against codeine. Anal. Chim. Acta. 787, 203-210 (2013).
  15. Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX—A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomol. Eng. 24 (4), 381-403 (2007).
  16. Jayasena, S. D. Aptamers: An Emerging Class of Molecules That Rival Antibodies in Diagnostics. Clin Chem. 45 (9), 1628-1650 (1999).
  17. Morse, D. P. Direct selection of RNA beacon aptamers. Biochem. Biophys. Res. Commun. 359, 94-101 (2007).
  18. Nutiu, R., Li, Y. Structure-Switching Signaling Aptamers. J. Am. Chem. Soc. 125 (16), 4771-4778 (2003).
  19. Luo, F., Zheng, L., Chen, S., Cai, Q., Lin, Z., Qiu, B., Chen, G. An aptamer-based fluorescence biosensor for multiplex detection using unmodified gold nanoparticles Chem. Commun. 48 (51), 6387-6389 (2012).
  20. Li, H., Rothberg, L. J. Label-Free Colorimetric Detection of Specific Sequences in Genomic DNA Amplified by the Polymerase Chain Reaction. J. Am. Chem. Soc. 126 (35), 10958-10961 (2004).
  21. Chávez, J. L., MacCuspie, R. I., Stone, M. O., Kelley-Loughnane, N. Colorimetric detection with aptamer–gold nanoparticle conjugates: effect of aptamer length on response. J. Nanopart. Res. 14 (9), 1166-1177 (2012).
  22. Hagen, J. A., et al. Biofunctionalized Zinc Oxide Field Effect Transistors for Selective Sensing of Riboflavin with Current Modulation. Sensors. 11 (7), 6645-6655 (2011).
  23. Han, K., Liang, Z., Zhou, N. Design Strategies for Aptamer-Based Biosensors. Sensors. 10 (5), 4541-4557 (2010).
  24. Martin, J. A., Chávez, J. L., Chushak, Y., Chapleau, R. R., Hagen, J., Kelley-Loughnane, N. Tunable stringency aptamer selection and gold nanoparticle assay for detection of cortisol. Anal. Bioanal. Chem. 406 (19), 4637-4647 (2014).
  25. Hall, B., et al. Synthesis, and Amplification of DNA Pools for In Vitro Selection. Curr. Protoc. Nucleic Acid Chem. 39, 9.2.1-9.2.28 (2009).
  26. Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O’Donoghue, M. B., Tan, W. Development of DNA aptamers using Cell-SELEX. Nat. Protoc. 5 (6), 1169-1185 (2010).
  27. Djordjevic, M. SELEX experiments: New prospects, applications and data analysis in inferring regulatory pathways. Biomol. Eng. 24 (2), 179-189 (2007).
  28. Thomas, J. R., Hergenrother, P. J. Targeting RNA with Small Molecules. Chem. Rev. 108 (4), 1171-1224 (2008).
  29. Jing, M., Boswer, M. T. A Review of Methods for Measuring Aptamer-Protein Equilibria. Anal. Chim. Acta. 686 (1-2), 9-12 (2011).
  30. Sachs, E. -. F., Diederichsen, U. . Binding of Triostin Analogues to DNA. , (2011).
  31. Liu, J., Lu, Y. Preparation of aptamer-linked gold nanoparticle purple aggregates for colorimetric sensing of analytes. Nat. Protoc. 1 (1), 246-252 (2006).
  32. Cho, M., et al. Quantitative selection of DNA aptamers through microfluidic selection and high-throughput sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (35), 15373-15378 (2010).
  33. Martin, J. A., et al. Selection of an Aptamer Antidote to the Anticoagulant Drug Bivalirudin. Plos One. 8 (3), e57341 (2013).
  34. Schütze, T., et al. Probing the SELEX Process with Next-Generation Sequencing. Plos One. 6 (12), e29604 (2011).
  35. Kupakuwana, G. V., Crill, J. E., McPike, M. P., Borer, P. N. Acyclic identification of aptamers for human alpha-thrombin using over-represented libraries and deep sequencing. Plos One. 6 (5), (2011).
  36. Smith, J. E., Griffin, D. K., Leny, J. K., Hagen, J. A., Chávez, J. L., Kelley-Loughnane, N. Colorimetric detection with aptamer-gold nanoparticle conjugates coupled to an android-based color analysis application for use in the field. Talanta. 121, 247-255 (2014).
  37. Chatterton Jr, R. T., Vogelsong, K. M., Lu, Y. -. C., Hudgens, G. A. Hormonal Responses to Psychological Stress in Men Preparing for Skydiving. J. Clin. Endocrinol. Metab. 82 (8), 2503-2509 (1997).
  38. Gold, L., et al. Aptamer-Based Multiplexed Proteomic Technology for Biomarker Discovery. Plos One. 5 (12), (2010).
  39. Musheev, M. U., Krylov, S. N. Selection of aptamers by systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Addressing the polymerase chain reaction issue. Anal. Chim. Acta. 564 (1), 91-96 (2006).
  40. Wiebe, J. P. Progesterone metabolites in breast cancer. Endocr.-Relat. Cancer. 13 (3), 717-738 (2006).

Tags

Structure-switching AptamersSmall Molecule TargetsBiosensingGold Nanoparticle AssayNucleic Acid AptamersTarget-induced Conformational ChangeNegative SelectionColorimetric ReadoutPhysiological Fluids

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Martin, J. A., Smith, J. E., Warren, M., Chávez, J. L., Hagen, J. A., Kelley-Loughnane, N. A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay. J. Vis. Exp. (96), e52545, doi:10.3791/52545 (2015).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image