Генерация мышиный кардиостимулятор клеточных агрегатов на основе ES-Cell-программирования в комбинации с Myh6-промоутер-Selection
Summary
Этот протокол описывает, как производить функциональную пазухи узловой ткани из мышиных плюрипотентных стволовых клеток (ЭСК). T-Box3 (Tbx3) избыточная экспрессия плюс сердца Миозин-тяжелых цепей (Myh6), промотор выбор антибиотика приводит к высокой чистоты кардиостимулятор клеточных агрегатов. Эти "наведенных синусового-тела" ("iSABs") содержат более 80% клеток водителя ритма, обнаруживают сильно повышенные показатели избиение и способны ходить миокарда Экс Vivo.
Abstract
Лечение "синдром слабости синусового узла" основывается на искусственных кардиостимуляторов. Они несут опасностей, таких как отказ и инфекций батареи. Кроме того, им не хватает гормона реагирования и в целом процедура дорогостоящим. "Биологические водители ритма", полученные от ЧОК может стать альтернативой, но типично содержание клеток водителя ритма в эмбриональные тельца (ЭТ) является крайне низким. Описанный протокол соединяет "вперед программирование" мышиных ЭСК через синусового узла индуктора Tbx3 с Myh6-промоутер основе выбора антибиотиков. Это дает кардиомиоцитов агрегатов в соответствии> 80% физиологически функциональных клеток водителя ритма. Эти "наведенных синусового-органы" ("iSABs") спонтанно сокращается с еще неохваченных частот (400-500 BPM), соответствующих узловых клеток, выделенных из мышиных сердцах и в состоянии ходить мышиный миокарда Экс Vivo. Использование описанного протокола высокой чистоты синусовогоузловые отдельные клетки могут быть получены, которые используются, например, для экстракорпорального тестирования на наркотики. Кроме того, iSABs, полученные в соответствии с настоящим Протоколом, может стать важным шагом на пути сердца тканевой инженерии.
Introduction
Термин "синдром слабости синусового узла" суммирует несколько заболевания, приведшие к ухудшению системы кардиостимулятор. Она включает в себя патологический, симптоматическая синусовая брадикардия, синоатриальной блок, синус арест, а также синдром тахикардия, брадикардия. Таким образом, "больной синдром пазухи" часто сопровождается общими сердечных заболеваний, таких как ишемическая болезнь сердца, кардиомиопатии или миокардита. В настоящее время, терапевтические подходы основаны на имплантации кардиостимуляторов электрических. Однако, это идет вместе с рядом рисков, таких как инфекции и неисправности аккумулятора. В целом, частота осложнений прежнему очень высок у пациентов, имеющие имплантированные искусственного водителя ритма. Кроме того, в отличие от эндогенного стимулятора, эти устройства не отвечают на стимуляцию гормонов.
Будущее альтернативой может рассчитывать на наличие "биологических кардиостимуляторов", для которых ЧОК может служитьв качестве подходящего клеточного источника и которые также весьма ценным для экстракорпорального тестирования на наркотики. Тем не менее, основная проблема заключается в очень редких появления пазухи узловых клеток в эмбриональных органов (EBS) – это, как правило, не превышает ~ 0,5% 1.
Ранее было показано, что "вперед программирование" на конкретные кардиомиоцитов подтипов осуществимо с помощью сверхэкспрессии различных ранних сердечно-сосудистых факторов транскрипции, таких как мезодермы конкретных-задней 1 (MesP1) и NK2 транскрипции фактора связаны, локус 5 (Nkx2.5) 2, 3. Для обычного размера и функции синусового узла (SAN), Т-поле транскрипционный фактор Tbx3 имеет решающее значение, которое, как было показано, чтобы инициировать программу гена стимулятором и контролировать дифференциации SAN 4. Хотя это расширение появление функциональных клеток водителя ритма, содержание еще не превышает ~ 40% в течение всей популяции клеток кардиомиоцитов.
Таким образом, дополнительный Myh6-промоутер на основе антибиотиков выбора шага 5 была введена нами. В конечном итоге это приводит к еще незаметно кардиомиоцитов агрегаты ("индуцированные синоатриального органов;" iSABs »), которые обладают существенно увеличена избиение частоты (> 400 ударов в минуту) в пробирке, впервые аппроксимирующей тех, мышиного сердца и сопоставимы в пробирке выращивают синус узловые клетки, выделенные из мышиного сердца 6. Под администрации Изопреналин опередив даже частоты 550 уд будут достигнуты. Примечательно, что iSABs состоят из более чем 80% функциональных узловых клеток Как видно из обширного физиологического анализа 7. В последнее время несколько подходов для создания пазухи узловые клетки с помощью прямого перепрограммирования 19, поверхностных маркеров 14 или медикаментозное лечение с малых молекул 16,17 описанных. Тем не менее, ни один из этих методов не привело к такой высокой чистоты клеток водителя ритма и бить частотах, близких к мышиным онискусство как это наблюдается в iSABs.
Кроме того, в Экс Vivo модели культивируемых взрослых мышей ломтиками желудочковой которые потеряли их самопроизвольное биение деятельности, iSABs способны интегрироваться в ломтик ткани, тем самым оставаясь спонтанно активны и энергично ходить ломтики сердца к сокращений 7. Подробный протокол для генерации этих iSABs описано в этой статье.
Protocol
Representative Results
Discussion
Способность производить стволовых клеток, полученных кардиостимулятор клетки может позволить воссоздания надлежащего сердечного ритма в смысле «биологических кардиостимуляторов". Кроме того, тестирование на наркотики в пробирке будет извлечь пользу из их наличия. ЧОК может прив?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number |
| Iscove's liquid medium with stable glutamine | Biochrom AG | FG 0465 |
| DMEM liquid medium without Na-pyruvate, with stable glutamine | Biochrom AG | FG 0435 |
| CLS type IV, CLS IV | Biochrom AG | C4-22 |
| Non-essential amino acids | Biochrom AG | K 0293 |
| FBS Superior | Biochrom AG | S 0615 |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Biochrom AG | L 0473 |
| G 418-BC liquid (ready-to-use solution), sterile | Biochrom AG | A 2912 |
| Reagent reservoir PP f.multichannel pip. 60ml,sterile | Brand | 703409 |
| Accutase | eBioscience,Inc. | 00-4555-56 |
| Eppendorf Xplorer/Xplorer plus, electronic pipette | Eppendorf | 4861000155 |
| Falcon Cell Strainer 40µm | Falcon | 352340 |
| Penicillin/Streptomycin | GE Healthcare | P11-010 |
| Petri Dishes | Greiner BioOne | 663102 |
| DPBS without Ca and Mg | PAN-Biotech | P04-36500 |
| Fetal bovine serum | PAN-Biotech | P30-3302 |
| Leukemia inhibitory factor | Phoenix Europe GmbH | LIF-250 |
| Quadratic petri dishes | Roth | PX67.1 |
| Gelatin from cold water fish skin | SigmaAldrich | G7765 |
| 2-Mercaptoethanol | SigmaAldrich | M3148 |
| 1-Thioglycerol | SigmaAldrich | M6145 |
| Tissue culture dishes | TPP | 93100 |
| Tissue culture flask | TPP | 90076 |
| Tissue culture test plates (24 well) | TPP | 92424 |
Referencias
- Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation. 48 (3), 173-182 (1991).
- David, R., et al. MesP1 drives vertebrate cardiovascular differentiation through Dkk-1-mediated blockade of Wnt-signalling. Nat Cell Biol. 10, 338-345 (2008).
- David, R., et al. Forward programming of pluripotent stem cells towards distinct cardiovascular cell types. Cardiovasc Res. 84 (2), 263-272 (2009).
- Hoogaars, W. M., et al. Tbx3 controls the sinoatrial node gene program and imposes pacemaker function on the atria. Genes Dev. 21 (9), 1098-1112 (2007).
- Klug, M. G., Soonpaa, M. H., Koh, G. Y., Field, L. J. Genetically selected cardiomyocytes from differentiating embronic stem cells form stable intracardiac grafts. J Clin Invest. 98 (1), 216-224 (1996).
- Marger, L., et al. Pacemaker activity and ionic currents in mouse atrioventricular node cells. Channels (Austin). 5 (3), 241-250 (2011).
- Jung, J. J., et al. Programming and isolation of highly pure physiologically and pharmacologically functional sinus-nodal bodies from pluripotent stem cells). Stem cell reports. 2 (5), 592-605 (2014).
- Maltsev, V. A., Wobus, A. M., Rohwedel, J., Bader, M., Hescheler, J. Cardiomyocytes differentiated in vitro from embryonic stem cells developmentally express cardiac-specific genes and ionic currents. Circulation research. 75 (2), 233-244 (1994).
- He, J. Q., Ma, Y., Lee, Y., Thomson, J. A., Kamp, T. J. Human embryonic stem cells develop into multiple types of cardiac myocytes: action potential characterization. Circ Res. 93 (1), 32-39 (2003).
- Yanagi, K., et al. Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels and T-type calcium channels confer automaticity of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem cells. 25 (11), 2712-2719 (2007).
- Barbuti, A., et al. Molecular composition and functional properties of f-channels in murine embryonic stem cell-derived pacemaker cells. J Mol Cell Cardiol. 46 (3), 343-351 (2009).
- Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American journal of physiology. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (5), H2006-H2017 (2011).
- David, R., Franz, W. M. From pluripotency to distinct cardiomyocyte subtypes. Physiology (Bethesda). 27 (3), 119-129 (2012).
- Scavone, A., et al. Embryonic stem cell-derived CD166+ precursors develop into fully functional sinoatrial-like cells). Circ Res. 113 (4), 389-398 (2013).
- Morikawa, K., et al. Identification, isolation and characterization of HCN4-positive pacemaking cells derived from murine embryonic stem cells during cardiac differentiation. Pacing Clin Electrophysiol. 33 (33), 290-303 (2010).
- Wiese, C., et al. Formation of the sinus node head and differentiation of sinus node myocardium are independently regulated by Tbx18 and Tbx3. Circ Res. 104 (3), 388-397 (2009).
- Kleger, A., et al. Modulation of calcium-activated potassium channels induces cardiogenesis of pluripotent stem cells and enrichment of pacemaker-like cells. Circulation. 122 (18), 1823-1836 (2010).
- Bakker, M. L., et al. T-box transcription factor TBX3 reprogrammes mature cardiac myocytes into pacemaker-like cells. Cardiovasc Res. 94 (3), 439-449 (2012).
- Kapoor, N., Liang, W., Marban, E., Cho, H. C. Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18. Nat Biotechnol. 31 (1), 54-62 (2013).
- Johns, D. C., et al. Adenovirus-mediated expression of a voltage-gated potassium channel in vitro (rat cardiac myocytes) and in vivo (rat liver). A novel strategy for modifying excitability. J Clin Invest. 96 (2), 1152-1158 (1995).
- Nuss, H. B., Marban, E., Johns, D. C. Overexpression of a human potassium channel suppresses cardiac hyperexcitability in rabbit ventricular myocytes. J Clin Invest. 103 (6), 889-896 (1999).
