文化和共同培养小鼠的卵巢和卵巢卵泡

按照机构的指引下，通过许可证英国内政部（项目许可证号PPL一千七百二十六分之六十零和四千零二十六分之六十）进行所有动物的工作。 注：房屋动物按照一个14小时的光英国法律要求和10小时黑暗的光周期。使用野生型C57BL6J小鼠中，具有绿色荧光蛋白（GFP）8，和大鼠Thy1-YFP的小鼠与黄色荧光蛋白（YFP）的神经元细胞9的子集偶尔表达无处不表达头-GFP小鼠的动物进行实验：两个转基因品系饲养在C57BL6J背景。 1.工作条件和仪器的研制执行所有的媒体的准备，组织解剖，并在层流罩培养工作，以保证无菌：这避免了在加入抗生素媒体的要求。 总是允许媒体/培养板/胚美食平衡至少1小时，在37℃的烘箱（夹层介质/胚菜），或37℃，5％CO 2培养箱（培养基和板），在使用之前。 浸泡玻璃吸管中的牛血清白蛋白（BSA）的0.1％溶液约一小时，然后离开干燥。在本生灯火焰拉移液管，弯曲的玻璃为你这样做，生产精拉弯玻璃吸管。之后，吸管被拉到，做一个干净的切割用玻璃刀。烘箱消毒在160℃下进行约45分钟。 注意：这些玻璃吸管的商店将需要转移卵巢滤泡和。 2.准备解剖和文化传媒准备夹层介质。 溶于雷伯维茨L15介质和过滤器3毫克/毫升BSA的消毒用0.2μm细孔，直径为25mm的过滤器。 新生儿卵巢文化。 准备中的新生儿子房培养，使1ml培养基中的EACħ卵巢将培养。溶解3毫克/毫升BSA的α-最低必需培养基（αMEM）和过滤通过0.2微米的细孔，直径为13毫米过滤消毒到无菌管中。 为了制备板新生儿子房培养，添加一个24孔板1毫升新生儿子房培养基到每个孔中（每孔一个卵巢）。使用无菌镊子钟表制造商，放置一个聚碳酸酯膜在每个孔中，有光泽的表面向上介质的顶部。使用紫外线消毒前膜。 卵泡文化。 以制备培养基卵泡培养，补充α-最小用1单位/ ml的重组人促卵泡激素，5微克/毫升抗坏血酸和5％体积/体积的血清挥发介质从成年雌性小鼠获得。通过0.2微米的细孔，直径为13毫米过滤器过滤除菌到无菌管中。 过滤通过0.45微米孔径，25mm直径的过滤器消毒硅油，到无菌管中。 为了准备解放军TES，放置卵泡培养基的30微升液滴进入非组织培养的各孔处理的96孔微量滴定轮孔板中，使用每块板只在顶行（允许卵泡每天要超过搬进新的行该文化时期）。小心覆盖介质，用70微升灭菌硅油，以防止培养基的蒸发。 卵泡卵巢共培养。 准备中的卵泡卵巢共培养作为卵泡文化上面的步骤2.3.1，弥补1ml培养基中的每一个卵泡卵巢共培养正在建立。 为了制备板，加入1毫升培养基中在24孔板的每个孔中。使用无菌镊子钟表制造商，将一个核孔滤膜上在各孔中，有光泽的表面向上介质的顶部。使用紫外线消毒前膜。 3.新生儿卵巢解剖和文化将1毫升夹层介质到每个无菌玻璃胚盘。 <0岁的日龄和5之间LI>卡尔新生小鼠的幼崽，根据英国内政部规定断头扑杀。 把握皮肤覆盖使用一对细解剖钳腹壁，使一个大的切口在皮肤和体壁。拉开切口，使整个腹部被暴露。膀胱充盈通常在此阶段，可刺破以使清扫容易。 移动胆量出使用钟表匠钳的方式。按照从膀胱到肾脏每侧子宫角。卵巢位于正下方的肾脏在子宫的顶部，并将显示为在解剖显微镜下云状结构。 与制表师镊子轻轻抓住卵巢，并用剪刀割断其附着到子宫。这对卵巢转移到含预热夹层中胚美食。 解剖显微镜下进行卵巢解剖精在加热站GE（37°C）。使用胰岛素针修剪掉囊囊和任何多余的材料，包括输卵管，直到只剩下卵巢仍然存在。 传送每个卵巢成在上面的步骤2.2.2制备的培养板的孔，用一个精拉弯玻璃吸管，一个卵巢上各膜的顶部（ 见图1A）。培养在37℃，5％CO 2的培养箱中培养。 每隔一天改变介质。使用移液管在每个交换介质的50％以及用于预脱气新鲜培养基：代替枪头在介质的孔的边缘，以避免干扰膜。 维持培养长达6天。 在培养结束时，冷冻介质和修复或在PBS中短暂洗涤后冷冻卵巢，根据需要。 固定在Bouin氏固定液卵巢90分钟用于组织学分析，或在10％的中性缓冲的福尔马林90分钟进行免疫组织学分析。扣放置组织冷冻卵巢的聚丙烯管，放置在管在干冰5-10分钟在-70℃用于随后的蛋白或mRNA的提取冷冻前。 4.卵泡解剖和文化剔除19-23天龄的雌性小鼠和隔离卵巢。做任何切口之前，湿用70％乙醇的皮毛。使用钝端镊子夹住皮肤，使一个大的切口在与清扫剪刀腹部，同时通过皮肤和体壁穿透。 将肠出使用更细的一系列清扫工具的方式，找到子宫。按照子宫高达其位于每一侧肾脏下方卵巢。 轻轻地用手抓一对制表师镊子卵巢，切断卵巢附件用细清扫剪刀子宫。避免收集过多的卵巢脂肪垫。收集卵巢和转移到含预热夹层介质胚胎菜肴。 回复移动使用胰岛素针修剪掉法氏囊囊和任何多余的材料，包括输卵管卵巢囊，直到只有卵巢仍然存在。大约一半使用胰岛素针每个卵巢。 每个子房半认真转移到含1ml夹层介质的个人手表的玻璃。覆盖每个表玻璃用载玻片，以防止介质的蒸发，并确保无菌。 商店钟表眼镜包含卵巢半在37℃烘箱中，直到需要的，但进行下一步解剖一步尽快。丢弃的组织存储在该方式为一个多小时。 转移表玻璃含有卵巢半至37℃下加热显微镜阶段在层流罩。大致解剖卵巢成使用两个胰岛素针大块，以鉴定后期预窦状卵泡如下：这些将包含2-3层颗粒细胞，其直径约为180-200微米。 手动剖析出任意i使用一种胰岛素针，一个30×0.25毫米针灸针已固定在一个持针器dentified毛囊。要小心，以除去大部分周围基质的，但避免损坏卵泡的基底层（ 见图1B）。 用精细绘制弧形玻璃吸管解剖卵泡仔细转移到含预热夹层介质的收集手表的玻璃。小心将毛囊吸管细口径部分中，以避免丢失的毛囊。 使用测量卵泡准确安装到解剖显微镜目镜校正刻度。 对于培养选择卵泡，只有当他们测量190±10微米的直径。而且只选择健康的，球形的毛囊进行培养;这些都将是半透明的，无暗区闭锁，并有一个完整的基底层，以及一些附加卵泡内膜组织：丢弃不符合这一描述的任何毛囊。 1之间的收益率每个卵巢的卵泡0-15是不错的。 使用精拉弯玻璃吸管到单个毛囊转移到由一板的孔如上述步骤2.3.3。小心地将卵泡在井的底部（而不是在上部油层）。培养在37℃，5％CO 2的培养箱中培养。 培养卵泡长达6天，移动卵泡成孔含有新鲜培养基的每一天。 准备在96孔板中的下一行作为板制备在上面的步骤2.3.3。返回板的孵化器，至少一个小时，以允许平衡。转移卵泡到介质的新鲜井，用精拉玻璃吸管。 如果在培养的任何点卵泡移动到新鲜培养基中之前被放置2天后，将每个毛囊中最小60微升（而不是30微升）卵泡培养基液滴。 收集关于卵泡生长数据，每天测量卵泡，使用EYepiece刻度配合到解剖显微镜。油层会扭曲卵泡直径测量，因此制定出校准系数的设置了。 在培养结束时，冷冻介质和固定或冷冻组织用于随后的分析，如在上述步骤3.10。 卵泡的卵泡共培养。 文化2卵泡在一起，探讨毛囊之间的相互作用。培养如上述，但将两个卵泡侧由端，在接触时，在一个井。 放置卵泡培养基的100微升小滴进入非组织培养的各孔处理的96孔微量滴定平板孔平板，覆盖介质用100μl无菌硅油。不转移卵泡到新鲜的孔如​​在上述步骤4.13，而是使用一个细尖凝胶来改变介质的50％隔日1次。 为了鉴定共培养在组织​​内的起源，共培养从一个不同的遗传来源卵泡每个，例如ÓNE从野生型小鼠的卵巢，而另一个从小鼠用GFP的表达无处不在的卵巢。如果使用GFP或YFP的组织，减低组织暴露于光尽可能，在培养过程中，以及通过其后的定影/处理步骤。 注：这是正常的两个卵泡一起成长成一个单一的，“两个卵泡'单元（ 见图1C）。 5.卵泡卵巢共培养解剖卵巢和卵泡出如上述4第3和。 放置在膜的顶部的一个新生卵巢，在其制备如上述步骤2.4.2的板。小心地接触一个单一的毛囊与新生儿卵巢的一极，使用精细绘制弧形玻璃吸管。培养在37℃，5％CO 2的培养箱中培养5天。 为了在组织来源的共培养中进行区分，使用卵巢和卵泡从两个不同的，以便urces，例如一种从野生型小鼠，和一个从一小鼠用GFP的表达无处不在。 替换500μl的培养基每天的如上面的步骤3.8，但使用卵泡培养基。在共培养，卵泡往往变得由卵巢（ 图1D）包封。 在培养结束时，冷冻介质和固定或冷冻组织用于随后的分析，如在上述步骤3.10。 6.固定，免疫细胞化学和培养组织的成像在培养结束时，在PBS中洗涤组织并转移到100微升（卵泡）或1毫升10％的中性缓冲的福尔马林（卵巢），并固定为1小时在冰上。移动通过的1×PBS的3次洗涤，在4℃。 对于免疫细胞化学上的毛囊，96孔微量滴定圆形孔平板使用精拉弯玻璃吸管，每孔含有不同的洗涤或处理的井之间传输。 对于免疫细胞化学上ovariES（或卵巢卵泡共培养），在50微米嵌入在4％的琼脂糖凝胶和部分用vibrotome。在一个24孔板的孔中浮动部分施加洗涤或处理，除去用吸管。 对于影像学检查：琼脂糖部分转移到平坦的载玻片，并与安装中安装;或转让的卵泡（或卵泡卵泡复合物），以腔玻片和安装非硬化封固剂。使用共聚焦显微镜图像标本。