القناة الصفراوية ربط في الفئران: تحريض التهاب الكبد والتليف الإصابات التي كتبها الانسدادي ركود صفراوي
Summary
Disruption of bile flow results in severe inflammatory cholestatic liver injury with a characteristic time-dependent sequence of morphological alterations. Here we present a protocol for the surgical ligation of the common bile duct in mice that allows to induce a strong fibrotic response after 21 to 28 days.
Abstract
في معظم الفقاريات، فإن الكبد ينتج الصفراء ما هو ضروري لاستحلب الدهون الممتصة وتمكين هضم الدهون في الأمعاء الدقيقة وكذلك على إفراز البيليروبين والمنتجات الأيضية الأخرى. في الكبد، وانسداد التجريبي للنظام الصفراوي خارج الكبد يبدأ سلسلة معقدة من الأحداث المرضية التي تؤدي إلى ركود صفراوي والتهاب مما أدى إلى رد فعل قوي متليفة منشؤها من حقول حول الأوعية البابية. ولذلك، أصبح الربط الجراحي من القناة الصفراوية المشتركة نموذج الأكثر شيوعا للحث على إصابة الركودي معرقلة في القوارض ودراسة الأحداث الجزيئية والخلوية التي تكمن وراء هذه الآليات الفيزيولوجية المرضية التي تحدثها غير مناسب تدفق الصفراء. في السنوات الأخيرة، وقد وصفت التقنيات الجراحية المختلفة التي إما السماح إعادة الاتصال أو إعادة المفاغرة بعد ربط القناة الصفراوية (BDL)، على سبيل المثال، جزئي BDL، أو أساليب المجهرية الأخرى للأسئلة بحثية محددة. ومع ذلك، فإن النموذج الأكثر استخداما هو إعاقة كاملة من القناة الصفراوية المشتركة أن يؤدي الى استجابة التليف قوية بعد 21 إلى 28 يوما. معدل وفيات يمكن أن تكون عالية بسبب مضاعفات معدية أو أخطاء فنية. هنا نقدم إجراء العمليات الجراحية مفصل لنموذج BDL في الفئران التي تحفز استجابة تليفي استنساخه للغاية وفقا لحكم 3R لرعاية الحيوان المفترضة التي كتبها رسل وبورتش في عام 1959.
Introduction
يتم تعريف تليف الكبد مثل الإنتاج المفرط وتراكم المصفوفة خارج الخلية (ECM) التي تنبع من شبكة معقدة من التفاعلات بين الخلايا النجمية الكبدية المنتجة للمصفوفة ومجموعة متنوعة واسعة من خلايا الدم في الكبد المقيمين والخلايا التسلل 1،2. وعلى الرغم من التليف الكبدي يمكن أن تسببها العديد من المحفزات المختلفة الآليات الجزيئية الكامنة التليف عادة ما تكون مشابهة جدا. وبعد الضرر الكبدي، يتم بدء برنامج مدبرة للغاية من التغيرات الجزيئية والخلوية. في هذا البرنامج التفاعل الوثيق بين الإشارات التهابات، وحيدات / الضامة والخلايا النجمية الكبدية يحدث ذلك في النتائج النهائية في تنشيط الخلايا النجمية وtransdifferentiation إلى myofibroblasts، ترسب ECM والتعديلات التشريحية والوظيفية متتالية من الكبد الأنسجة سلامة 3. هو الدافع وراء تنشيط الخلايا النجمية الكبدية خاصة من جانب إشارات التهابات والتفاعل مع الكبدالضامة السكنية (أي خلايا كوبفر). يتم التعرف على العوامل المسببة للأمراض أنماط الجزيئية يرتبط بها مستقبلات التعرف على نمط المتخصصة مثل مستقبلات تول مثل التي عند تفعيلها إشارة من خلال شبكة معقدة من الممرات المختلفة التي تؤدي الى التعبير وإفراز العديد من السيتوكينات و chemokines التهابات التي تدفع العملية الالتهابية 3. الاستجابة الالتهابية وإهانة الكبد شكلت مؤقتة فقط عند إزالة عامل المنتجة للمرض. في المقابل، إذا استمرت الإصابة، يتطور التهاب مزمن في الكبد والتعبير وتراكم الحشود ECM في المقدمة مما أدى إلى إحلال التدريجي لحمة الكبد طبيعية عن طريق تشكيل ندبا.
منذ تكون الألياف الكبد لدى البشر هي مشكلة سريرية في جميع أنحاء العالم، تم إنشاء العديد من النماذج القوارض التجريبية من الفشل الكبدي الحاد والمزمن خلال العقود الماضية. في مونظام rine على سبيل المثال، والنماذج شيوعا هي إدارة مجموعة متنوعة من hepatotoxins مختلفة، وربط من القناة الصفراوية المشتركة، تحريض اصابة الكبد بوساطة جهاز المناعة، وإدخال المستهدفة من عيوب جينية أو العكس وoverexpression من الجينات المحورة التي تؤثر حرجة مسارات إشارات تشارك في التسبب في التليف في الكبد 4.
وقد تم تنفيذ ربط من القناة الصفراوية المشتركة في القوارض خارج باعتباره الإجراء التجريبي في البحث لسنوات عديدة 5-8. وقد قدم أول بروتوكول استنساخه للغاية لقناة الصفراء طويلة ربط (BDL) في القوارض بالفعل الآن أكثر من ثلاثة عقود مضت 9. في هذا البروتوكول كل من القسطرة / إعاقة وربط يسببها ارتفاع العائد من تليف الكبد في الفئران مع التغيرات المورفولوجية التي كانت مماثلة لتلك التي لوحظت في التشمع الصفراوي البشري 9. بروتوكول منها هو بسيط، وإجراء العمليات الجراحية ينطبق بسرعة نسبيا، ومعدلات البقاء على قيد الحياة من الحيوانات عالية مع أكثر من 95٪. في الكلاسيكية بروتوكول الفئران القسطرة / إعاقة، يتم إجراء شق قصيرة من 2 سم فقط تحت عملية الخنجري. بعد ذلك، يتم إدخال قنية في الجزء القريب من القناة الصفراوية وثابتة في موقفها مع خيوط الحرير. في الخطوة التالية، وقطعت الطريق على الجزء الأعلى من قنية مع 3 عقدة، وطرح من خلال الطرف الأدنى من شق خط الوسط ودفن تحت الجلد في الربع السفلي الأيمن 9. في النهاية، يتم إغلاق البطن ويسمح الحيوانات في التعافي. في بروتوكول ربط، تتعرض الفئران لربط مزدوج من القناة الصفراوية المشتركة سواء مع أو بدون تشريح القناة الصفراوية بين الحروف المركبة 9.
ومن المقبول أيضا هذا النموذج التجريبي وتستخدم في جميع أنحاء العالم في مئات من المختبرات للحث على ركود صفراوي الكبد والتليف. أنه يدفع الصفراوية داخل الكبد تكاثر الخلايا الظهارية، التمايز myofibroblasticن من الخلايا الليفية بوابة حول تكاثر الخلايا الظهارية الصفراوية، مما أدى إلى والتعبير الهائل تكرار للغاية وترسب ECM 10،11. ولذلك، فإن تطبيق هذا النموذج في الجرذان والفئران ويجري شعبية بين العلماء التي تهدف إلى فهم التسبب في التهاب الكبد والتليف.
في المختبر لدينا، وقد استخدمنا هذا البروتوكول على نطاق واسع في الماضي في الفئران في العديد من الدراسات التجريبية التي تهدف إلى تحقيق الجوانب الجزيئية والخلوية الخاصة لتكون الألياف الكبدي واختبار المفاهيم والمخدرات 12-15 antifibrotic الرواية.
مؤخرا، ونحن تتكيف هذه المنهجية لنظام الفئران وجدت أن جراحة ربط القناة الصفراوية هي أيضا يعني جاذبية للإقامة التليف تعتمد على الوقت مع انخفاض التباين وفيات في الفئران 16-18. نظرا لحجم أصغر من الحيوانات، ومع ذلك، بعض التعديلات الهامة فيما يتعلق التخدير، interv الجراحيةention والمراقبة بعد المعالجة ضرورية للحصول على نتائج موثوقة وقابلة للتكرار في هذا النموذج. ولخص التكيف الكامل في البروتوكول التالي في وثائق والفيديو المرفقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
اصابة الكبد الركودي هي واحدة من العوامل المسببة الرئيسية لتطوير تليف الكبد وتليف الكبد في المرضى الذين يعانون من مرض الكبد المزمن. استنادا إلى حقيقة أن هذه الأمراض تنتج تكاليف الرعاية الصحية لا يمكن التكهن بعواقبها، فمن مفهومة أن العديد من الباحثين يحاولون فهم الآليات المسببة للأمراض التليف الكبدي مستمر. ولذلك، تم إنشاء نماذج تجريبية تحاكي جوانب مختلفة من الآليات المعقدة التي تؤدي إلى التهاب الكبد، والتليف والتشمع 1.
الجراحية BDL هي واحدة من النماذج التجريبية الأكثر انتشارا التي تستخدم للحث على إصابة الركودي معرقلة في الفئران والجرذان 4،23،24. في معظم البروتوكولات، يتم تخدير الحيوانات ويتم تنفيذ عملية فتح البطن القسم الوسطي. وفي وقت لاحق، وكشفت القناة الصفراوية من تجويف البطن وو ligated مرتين باستخدام خيوط جراحية. ونتيجة لذلك، فإن الفئران والجرذان التي تلقت هذه الجراحة دevelop رد فعل متليفة قوية على أن تنشأ في البداية من حقول حول الأوعية البابية 25. خلال السنوات وقد وصفت العديد من التقنيات والتعديلات الجراحية المختلفة. حتى تسمح الإجراءات الخاصة لإعادة الاتصال أو إعادة المفاغرة بعد BDL 23. وتعتمد تقنيات أخرى على BDL جزئي مما أدى إلى تشكيل نخر أقل بكثير، وبالتالي انتشار الكبدية 24. BDL جزئي في تركيبة مع إزالة لاحقة من المرارة (استئصال المرارة) الذي يمنع تشكيل التهاب المرارة أيضا يمثل نموذج تجريبي ممتاز للركود صفراوي الحاد. واقترح أن تكون نموذجا أقرب إلى الوضع البشري 24. وبالفعل، أثناء إنشاء هذا النموذج، وقد تجلى ذلك بالفعل أنه يتسبب بتكاثر ركود صفراوي مع الحد الأدنى من إصابة الأنسجة النسيجية فقط ولا تشرع في ركود صفراوي المزمن 25. ولذلك، اقترح أن هذا النموذج هو المثالي لدراسة خطوط الطول(ه) من آثار ركود صفراوي عكس 24. وتستند حتى أساليب أكثر تطورا على المجهرية وتسمح طريقة سريعة وقابلة للتكرار لإيقاع إصابات الكبد الركودي فقط في أجزاء مختارة من الكبد 26.
على الرغم من أن هذه التعديلات متطورة من بروتوكول BDL الأصلي وقد ثبت مفيدة جدا في التحقيق الأسئلة بحثية محددة، العديد من المختبرات في جميع أنحاء العالم تهدف أساسا في توظيف نموذج BDL نموذجا استنساخه للغاية ويمكن الاعتماد عليها لتليف الكبد الصفراوي. ومع ذلك، يمكن أن تحدث العديد من المضاعفات التي يمكن أن يغير بشكل كبير من استنساخ وموثوقية النتائج التي حصل عليها هذا النموذج، إذا لم يتم تجنب أخطاء فنية. على سبيل المثال، والنزيف مضاعفات تتعلق إصابة الأوعية الدموية المصاحبة القناة الصفراوية (أنظر الشكلين 3-4) قد تحدث أثناء أو بسرعة بعد الجراحة. جرعة زائدة من التخدير مع cardiodepression أو ص لاحقافشل espiratory أيضا مضاعفات يمكن تجنبها من الإجراء. التهابات شديدة، بدءا من التهاب الصفاق إلى تعفن الدم، قد تحدث طوال فترة التجربة، إن لم يكن يتم تنفيذ الغرز بدقة وتسرب العصارة الصفراوية في التجويف البريتوني. الإصابات العرضية إلى الأمعاء أثناء الجراحة يمكن أن يؤدي أيضا إلى التهاب الصفاق. ولذلك، فمن الواضح أن بروتوكولات موحدة والتي هي في الامتثال لمبادئ توجيهية صارمة معالجة مطلوبة بشدة. كما كان يطالب هذا النص مؤخرا داخل دول الاتحاد الأوروبي، والتي تنفذ قواعد الرفق بالحيوان جديدة في عام 2013 1، ومتطلبات كل منها التي ترتبط مع هذه اللائحة ليست جديدة واقترحت بالفعل في عام 1959، عندما اقترح راسل وبورتش أخلاقية إطار لإجراء التجارب العلمية مع الحيوانات التي تقوم أساسا على بديل، والصقل والحد من (3R) المبدأ 27.
عند اتباع outlinبروتوكول إد لا يوجد سوى عدد قليل من المضاعفات التي قد تنشأ عن أخطاء فنية. قد تحدث ثلاث قضايا محددة في التردد المنخفض إلى حد ما.
كما هو الحال مع جميع العمليات الجراحية، وجرعة زائدة من مخدر هي مصدر محتمل للخطر على الحيوانات وخاصة في تركيبة مع انخفاض حرارة الجسم. إذا أثناء الجراحة تحدث مضاعفات القلب والأوعية الدموية، يجب أن تتوقف إمدادات التخدير فورا والمشغل يجب أن تحاول لتوفير اكبر قدر ممكن من الأكسجين إلى الماوس. ويمكن القيام بذلك عن طريق حقنة بلاستيكية صغيرة ومملوءة بالهواء وضخها في فم الحيوان ضعاف. بدلا من ذلك، استخدام Peleusball صغيرة للتهوية من الحيوان المصاب هو مفيد في كثير من الأحيان لعملية التنشيط.
مشاكل في التئام الجروح
بعد الجراحة BDL، قد الفئران دغة طبقات من قرحة الخاصة أو مصالح غيرها من الحيوانات. إذا حدث هذا، وينبغي أن تكون الفئران كل منها على حدةفي قفص. يجب تخدير الحيوانات مع الجروح المفتوحة، منطقة حول الجرح تعقيم بلطف مع معيار مطهر، وينبغي مخيط الجرح من جديد. خلال 3 أيام المقبلة، يجب أن يتم فحص الجرح من هذه الحيوانات بشكل منتظم (مرتين إلى ثلاث مرات في اليوم).
الإنتفاخات من البطن أو تشكيل استسقاء تدل على الالتهابات البكتيرية. قد تحدث هذه نتيجة لعمل غير معقمة أثناء الجراحة. وينبغي التعامل مع كل نوع من العدوى دون استثناء باعتبارها نقطة النهاية إنسانية ويجب التضحية الحيوانات المصابة.
قدمنا سيلة سهلة لمتابعة البروتوكول الذي يسمح للأداء BDL في الفئران التي هي بسيطة لتنفيذ وتثير نفوق الحيوانات منخفضة فقط جنبا إلى جنب مع استنساخ عالية. كافة البروتوكولات الجراحية يمكن القبض بسرعة من قبل العلماء المهرة. خلال التجريب كاملة، يتم الاحتفاظ الحيوانات على لوحة ظاهرة الاحتباس عند 37 درجة مئوية ومتصلا بشكل دائمإلى نظام التخدير تقليل الألم والضيق. لإجراء عملية جراحية، يتم فتح البطن مع البطن خط الوسط والقناة الصفراوية و ligated المزدوج دون تشريح ذلك. وتظهر نتائج تمثيلية التي تمت مناقشتها هنا إلى أن التعديلات المظهرية فيما يتعلق مورفولوجيا الكبد (التهاب، والتليف، تليف الكبد) هي استنساخه للغاية وتسمح لدراسة جوانب مختلفة من تكون الألياف (على سبيل المثال، بدء، التهاب، التقدم، نهاية مرحلة المرض) في تعريف نقاط الوقت.
نأمل أن ملخص بروتوكول لدينا سوف تساعد على تقصير منحنى التعلم ما هو ضروري لإنشاء بنجاح هذا النموذج التليف في غيرها من المختبرات وضمان نتائج موثوقة وقابلة للتكرار في مواقع مختلفة. وبالتالي نعتقد أن البروتوكول المقدمة تؤيد مبدأ 3R التي كان من المفترض من قبل راسيل وبورتش في عام 1959 ويمثل أساس قواعد الرفق بالحيوان الجديدة التي يتم تنفيذها حاليا في العديد من البلدان وايرقيقة الإطار الأوروبي.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أنوه بدعم مالي من مؤسسة البحوث الألمانية (SFB / TRR57، وQ3 Q2). الكتاب أشكر ماركيه شولتز، باسكال Paschenda، وكلاوديا Warzecha لمساعدتهم في إعداد الصور.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Shaver Favorita II | Aeskulap | GT104 | |
| Cutter head | Aeskulap | GT730 | |
| Bepanthen eye and nose ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Warming plate and controller | Labotect | HP 062 | |
| Fluovac anesthesia system | Harvard Apparatus | 34-1030 | |
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
| Scotch Tape | commercially available | ||
| Tissue paper | commercially available | ||
| Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
| Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Raucodrape OR adhesive drapes | Lohmann & Rauscher GmbH | 33013 | |
| Scissor | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Graefe forceps straight | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| 6-0 Mersilk suture | Ethicon | K889H | Silk, non-absorbable/Abdominal closure |
| Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Colibri retractor | Fine Science Tools Inc. | 17000-03 | |
| Cotton swabs | Noba Verbandmittel | 974202 | |
| Cotton swabs | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1032238 | |
| 25mL beaker | Schott Duran | 50-1150 | |
| Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Micro-serrations forceps Moria MC31 | Fine Science Tools Inc. | 11370-31 | Bile duct separation |
| 5-0 Mersilene suture | Ethicon | EH6731H | Polyester, non-absorbable/Bile duct ligation |
| 5mL syringe | BD Discardit II | 300296 | |
| 1mL syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| Sterican needle 26 G x 1 | B. Braun | 4657683 | |
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | Analgeticum, 0.1 mg/kg |
| Infrared lamp | Petra Electric | IR 11 |
Referencias
- Liedtke, C., et al. Experimental liver fibrosis research: update on animal models, legal issues and translational aspects. Fibrogenesis Tissue Repair. 6 (1), 19 (2013).
- Aller, M. A., Arias, J. L., García-Domínguez, J., Arias, J. I., Durán, M., Arias, J. Experimental obstructive cholestasis: the wound-like inflammatory liver response. Fibrogenesis Tissue Repair. 1 (1), 6 (2008).
- Tacke, F., Weiskirchen, R. Update on hepatic stellate cells: pathogenic role in liver fibrosis and novel isolation techniques. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 6 (1), 67-80 (2012).
- Weiler-Normann, C., Herkel, J., Lohse, A. W. Mouse models of liver fibrosis. Z. Gastroenterol. 45 (1), 43-50 (2007).
- Cameron, G. R., Oakley, C. L. Ligation of the common bile duct. J. Pathol. 35 (5), 769-798 (1932).
- Cameron, G. R., Hasan, S. M. Disturbances of structure and function in the liver as the result of biliary obstruction. J. Pathol. 75 (2), 333-349 (1958).
- Accatino, L., Contreras, A., Fernańdez, S., Quintana, C. The effect of complete biliary obstruction on bile flow and bile acid excretion: postcholestatic choleresis in the rat. J Lab Clin Med. 93 (5), 706-717 (1979).
- Accatino, L., Contreras, A., Berdichevsky, E., Quintana, C. The effect of complete biliary obstruction on bile secretion. Studies on the mechanisms of postcholestatic choleresis in the rat. J Lab Clin Med. 97 (4), 525-534 (1981).
- Kountouras, J., Billing, B. H., Scheuer, P. J. Prolonged bile duct obstruction: a new experimental model for cirrhosis in the rat. Br J Exp Pathol. 65 (3), 305-311 (1984).
- Tuchweber, B., Desmoulière, A., Bochaton-Piallat, M. L., Rubbia-Brandt, L., Gabbiani, G. Proliferation and phenotypic modulation of portal fibroblasts in the early stages of cholestatic fibrosis in the rat. Lab Invest. 74 (1), 265-278 (1996).
- Desmoulière, A., et al. Extracellular matrix deposition, lysyl oxidase expression, and myofibroblastic differentiation during the initial stages of cholestatic fibrosis in the rat. Lab Invest. 76 (6), 765-778 (1997).
- Arias, M., et al. Adenoviral expression of a transforming growth factor-β1 antisense mRNA is effective in preventing liver fibrosis in bile-duct ligated rats. BMC Gastroenterol. 3 (29), (2003).
- Borkham-Kamphorst, E., et al. Dominant-negative soluble PDGF-β receptor inhibits hepatic stellate cell activation and attenuates liver fibrosis. Lab. Invest. 84 (6), 766-777 (2004).
- Borkham-Kamphorst, E., Huss, S., Van de Leur, E., Haas, U., Weiskirchen, R. Adenoviral CCN3/NOV gene transfer fails to mitigate liver fibrosis in an experimental bile duct ligation model because of hepatocyte apoptosis. Liver Int. 32 (9), 1342-1353 (2012).
- Borkham-Kamphorst, E., et al. The anti-fibrotic effects of CCN1/CYR61 in primary portal myofibroblasts are mediated through induction of reactive oxygen species resulting in cellular senescence, apoptosis and attenuated TGF-β signaling. Biochim. Biophys. Acta. 1843 (5), 902-914 (2014).
- Huss, S., et al. Development and evaluation of an open source Delphi-based software for morphometric quantification of liver fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 3 (1), 10 (2010).
- Borkham-Kamphorst, E., Drews, F., Weiskirchen, R. Induction of lipocalin-2 expression in acute and chronic experimental liver injury moderated by pro-inflammatory cytokines interleukin-1β through nuclear factor-κB activation. Liver Int. 31 (5), 656-665 (2011).
- Karlmark, K. R., et al. The fractalkine receptor CX3CR1 protects against liver fibrosis by controlling differentiation and survival of infiltrating hepatic monocytes. Hepatology. 52 (5), 1769-1782 (2010).
- Tarcin, O., et al. Time course of collagen peak in bile duct-ligated rats. BMC Gastroenterol. 11, 45 (2011).
- Takase, S., Leo, M. A., Nouchi, T., Lieber, C. S. Desmin distinguishes cultured fat-storing cells from myofibroblasts, smooth muscle cells and fibroblasts in the rat. J. Hepatol. 6 (3), 267-276 (1988).
- Borkham-Kamphorst, E., et al. Protective effects of lipocalin-2 (LCN2) in acute liver injury suggest a novel function in liver homeostasis. Biochim. Biophys. Acta. 1832 (5), 660-673 (2013).
- Labbus, K., et al. Proteomic profiling in Lipocalin 2 deficient mice under normal and inflammatory conditions. J Proteomics. 78, 188-196 (2013).
- Kirkland, J. G., et al. Reversible surgical model of biliary inflammation and obstructive jaundice in mice. J. Surg. Res. 164 (2), 221-227 (2010).
- Heinrich, S., et al. Partial bile duct ligation in mice: a novel model of acute cholestasis. Surgery. 149 (3), 445-451 (2011).
- Scholten, D., et al. Genetic labeling does not detect epithelial-to-mesenchymal transition of cholangiocytes in liver fibrosis in mice. Gastroenterology. 139 (3), 987-998 (2010).
- Aller, M. A., et al. A half century (1961-2011) of applying microsurgery to experimental liver research. World J Hepatol. 4 (7), 199-208 (2012).
- Russell, W. M. S., Burch, R. . The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).
