마우스의 담관 결찰 : 폐쇄성 담즙에 의한 염증성 간 손상과 섬유화의 유도

전형적인 실험에서, BDL은 18-20 그램 (40) 가중 수컷 C57BL / 6 야생형 마우스에서 수행 하였다. 이 실험은 진행 (10, 14, 및 20 일) 동안 개시 단계 (3, 7 일)에서의 간 섬유화를 조사하기 위해 수행하고, 장기 (30 일 60 일) 동안 16 하였다. 영구적 실험의 단부까지 증가 문맥 주위 섬유증 완전히 이십일 후에 개발하면서이 모델에서 이미 persinusoidal 섬유증, 수술 후 10 일째에 개발했다. 한 실험에서, 간단한 가성 조작을받은 모든 동물이 생존 만 BDL받은 40 마우스 (5 %)의 두 불량한 일반적인 조건을 개발하기 때문에 조기에 실험 계획 종점 전에 희생시켰다. BDL 실시 동물의 대부분은 제 3 일간은 감소 된 활성을 보였다 가짜 조작 동물의 활성은, 개복 수술 후 예외없이 이미 실제 섬광 날이었다. Jaundiced 피부 BDL (16)의 설정 후 모든 BDL 동물 하나 또는 두 개의 일 이미 분명 있었다. 간 손상의 잘 확립 된 혈청 마커를 대표하는 두 알라닌 아미노 전이 효소 (ALT) 및 아스 파르 테이트 트랜스 아미나 제 (AST)의 값은 급격히 증가하고 BDL (표 1) 후 7 일 및 20 일 동안 만족. 그 후, ALT 및 AST는 하루에 30 일까지 꾸준히 감소 60 일 수술 후까지 안정적으로 유지. 담즙 정체성 부상 라인에서, 총 빌리루빈의 혈중 농도는 꾸준히 상승했다 7 일 16 후 고원에 도달했다. ALT 및 AST 혈청 활동 비슷한 시간 코스는 BDL을 시행 한 쥐에 대해보고했다. 최근의 연구에서이 BDL 수술 후 첫 주에 정상의 5 ~ 10 배까지 증가 2 주 (19) 이후 감소하는 혈청 AST와 ALT 수준을 입증했다. 일반적으로 가짜로 작동하는 동물의 간은 여전히​​ 스무 트 봐실험의 끝에서 H, BDL받은 동물들의 간 주로 간과 다량으로 가득 담낭의 수종의 대응 표면에 부종과 섬유화 결절의 형성을 특징으로 구조적 변경을 표시하는 동안 담즙 (그림 7). BDL 수술에 의해 유도 된 간장의 특성 형태 학적 변화는 또한 표준 조직 학적 분석 (그림 8)에서 입증된다. 실험 동일한 세트에서, 간 섬유증의 개발은 최대주고, 반 정량적으로 평가 문맥 주위 섬유증 0-2 0-4과 perisinusoidal 섬유증에서 준비된시킨 점수 시스템을 사용하여 맹검 병리학 자에 의해 평가 간 조직 학적 기준 할 예상 한 바와 같이 제 간경변 동등했다 값은 가짜 조작 동물 군의 평균 섬유화 점수 0.00 ± 0.00이었다. t 동물 군 대비에서,모자 BDL가, 점수가 4.83 ± 0.17의 값으로 하루 60까지 꾸준히 증가 받았다. 문맥 주위 섬유증 (3)의 최대 분석 모든 동물에서 20 일에 도달하고, perisinusoidal 섬유증 실험의 처음 10 일 동안 결석 2 주 후에 우선 두드러졌다. 그 후, 1.8 ± 0.17 (표 1)의 값을 실험의 단부까지 점차 증가 하였다. 또 다른 몇몇 실시 하였다 독립적 동물 실험에서는, 섬유화가 진행 섬유화 형성 (도 9)의 결과로서 간내 콜라겐 발현 및 증착 재현성을 보여주는 시간 – 의존적 증가가 관측되었다. 이와 유사하게, 지속적으로 섬유화의 과정은 α-평활근 액틴 섬유 아세포의 세포의 마커를 나타냅니다 (α-SMA)의 높은 발현 눈에 띄는, 즉, 별 모양의 세포 및 포털 근섬유 간 활성화및 간 하이드 록시 프롤린은 콜라겐 풍부에서 발견 된 아미노산 (18) (도 9) 행렬. 또한, 근섬유 아세포 또는 양을 증가 나타낸다 멘틴의 발현은 수술 BDL (20)의 설정 후 증가된다. 부상 간에서 염증이 수반 더 강하게 급성 및 만성 간 손상 중 유도 된 급성 간 손상 (21, 22) 중 간세포 보호 효과를 진화한다 리포 칼린 2 (LCN2)의 발현 증가에 의해 반영됩니다. BDL받은 동물들의 간 침투 염증 세포는 CD45 (도 10)에 특이적인 항체로 염색하여 특정 검출 할 수있다. 또한 PTPRC (단백질 티로신 포스파타제, 수용체 타입)으로 알려진이 세포 표면 마커 특이 적 적혈구와 혈장 세포를 제외한 모든 분화 된 조혈 세포에서 발현된다. <table fo:keep-together.within 페이지 = "항상"국경 = "0"의 cellpadding = "0"cellspacing = "0"> 담관 결찰 후 시간 (일) 총 빌리루빈 AST (U / L) ALT (U / L) 포털 섬유증 Perisinusoidal 섬유증 총 점수 (㎎ / dL 이상) 0 (N = 3) 0.17 ± 0.06 192.67 ± 30.50 50.33 ± 6.03 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 도 3 (N = 5) 6.85 ± 2.21 1159.25 ± 319.27 566.50 ± 335.25 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 도 7의 (N = 5) <td> 14.38 ± 2.14 ± 976.60 ± 477.16 448.20 ± 259.47 0.60 ± 0.25 0.0 ± 0.0 0.60 ± 0.25 10 (N = 5) 15.92 ± 2.60 1916.60 ± 868.25 560.40 ± 80.88 1.40 ± 0.25 0.25 ± 0.25 1.67 ± 0.25 14 (N = 5) 17.90 ± 3.84 1088.60 ± 276.32 505.00 ± 96.15 ± 2.4 ± 0.25 1.0 ± 0.0 3.40 ± 0.24 20 (N = 4) 18.00 ± 2.12 1072.67 ± 364.27 404.00 ± 195.48 3.0 ± 0.0 1.0 ± 0.0 4.0 ± 0.0 30 (N = 5) 16.04 ± 4.79 446.40 ± 169.75 260.20 ± 126.97 2.8 ±; 0.2 1.4 ± 0.25 4.20 ± 0.20 60 (N = 6) 16.02 ± 1.19 484.67 ± 117.79 257.17 ± 50.97 3.0 ± 0.0 1.8 ± 0.17 4.83 ± 0.17 사용 된 약어는 다음과 같다 : ALT, 알라닌 아미노 전이 효소; AST, 아스파 테이트 아미노 전이 효소. 표 1 : 섬유증 대표적인 실험에서 기록이 테이블의 데이터 간 섬유증가 C57BL / 6 마우스 16 담관 결찰에 의해 유도 된 연구로부터 재생 하였다.. 이 연구에서, BDL 수술 후 사망률이 5 % (2 (40)의 중간에 동물을 동물 열악한 조건 개발 때문에 희생시켰다). 그림 1 : 담즙을 수행하기위한 실험 설정덕트 결찰. 동물 37 O C의 온도로 보온 판에 유지되고 연산 영역은 유체 – 불 투과성의, 자체 접착 드레이프 전체적으로 덮는다. 완전한 수술 중에 동물 영구적 마취 시스템에 접속된다. 모든 측정 장치 및 솔루션 (진통제, 마취제, 소독액, 0.9 % 염화나트륨)을 명확하게 배열되어있다. 그림 2 :. 수술 영역의 준비 복강의 전 개방, 복부 피부 전기 모피 면도기로 면도 살균 거즈 면봉으로 소독해야한다. 수술 영역이어서 유체 – 불 투과성, 자체 접착 드레이프 덮여있다. 복부 정중선 개복술 (~ 길이 2cm)로 열립니다. 공동은 흉골에 들고 봉합사 및 연산에 의해 확산 영역을 삽입하여 확대수술하는 동안 방해받지 않고 실험을 허용하는 콜리 브리 견인기를 삽입. 그림 3 : 담관의 노출. 이 다이어프램에 충실하고 간 나 hilus가 눈에 잘되도록 담관 결찰술을 수행하기위한 (A)는, 간 복부 측이 들어 올려진다. (B)보다 담관을 노출하기 위해, 장내는 미부로 이동 가습 면봉. 담관이 화살표로 표시됩니다. 그림 4 : 담관을 결찰. (A) 제 1 단계에서, 담관은 톱니 형 마이크로 핀셋을 사용하여 문맥과 간동맥을 플 랭킹으로부터 조심스럽게 분리된다. (B) 다음으로, 봉합사가 주위에 배치되고담관 수술 매듭 고정. (C) 그 후, 제 봉합 제 봉합사에 근접 배치 담관 주위 결착되어있다. (D) 봉합사 짧게는, 공동은 0.9 % NaCl 용액으로 세정 모든 장기는 생리 학적 위치로 대체했다. 그림 5 :..과 담관의 매듭의 정확한 표현 봉합의 배치 및 담즙의 흐름을 방해하는 두 노트의 설정을 문서에이 그림 4에 설명 된 동일한 절차가 양안에서 문서화 된 (A) 감금 먼저 봉합. 첫 번째 봉합의 (B) 매듭. 두 번째 봉합과 담관의 (C) 감금. (D) 두 번째 봉합사의 매듭. (E)은 담즙 D를 두 번 결찰UCT 초과 봉합의 단축 후. (E ')이 패널 (E)의 스케치를 보여줍니다. 왼쪽에서 오른쪽 (RL), (LL) 및 메디안 (ML)의 돌출부 간뿐만 아니라 담관, 위 및 십이지장의 위치가 글자된다. 스케치에서 담관은 두 개의 봉합사로 결찰한다. 그림 6 :. 담관, 문맥과 생쥐의 간 동맥의 해부학 담관의 더 나은 해부학 적 위치는 문맥과 간동맥을 구성표로 묘사된다. 또한 표시됨 오른쪽 (RL)의 위치이며, 좌측 (LL) 중앙값 (ml) 및 간 미상핵 (CL) 엽. 그림 7 : 대표 appeara이주 가짜 운영 및 BDL 후 간의 NCE. C57BL / 6 마​​우스를 조작 BDL 또는 가짜 수술을 행 하였다. 이주 후 내장 공동 열렸다. 가짜 조작 동물의 간 섬유증의 흔적을 보이지 않았다 동안 담즙 덕트의 결찰을받는 동물의 간 대응은 간 표면에 부종 형성 및 섬유 성 결절 요철 구조를 가지고 있었다. 그림 8 :. 헤 마톡 실린 및 에오신 얼룩 간 부분은 (A) 가짜로 작동했다 3 주 (B)에 대한 BDL를받은 C57BL / 6 야생형 동물로부터 제조 하였다. 섹션은 헤 마톡 실린 및 에오신 다음과 같은 표준 절차를 염색 하였다. 염증의 징후 (침윤 세포), 실질 (간세포를 포함 BDL 간 내에서 일반적인 변경을 유의하시기 바랍니다cyte) 괴사 및 담관의 확산. 각각의 그림 패널의 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 9 : 간 섬유화에 대한 조직 학적 및 생화학 적 판독. (A) 간 섹션 2 주 동안 가짜 조작 또는 BDL를받은 동물에서 준비하고 시리우스 레드 (상단 패널, 빨간색 콜라겐 섬유)로 염색 또는 α-smooth muscle actin의 발현 (α-SMA) (하단 패널 분석 하였다 면역 조직 화학 염색에 의한 갈색, α-SMA 양성 세포). 각각의 그림 패널의 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. (B)이 간에서 단백질 추출물 웨스턴 블롯을 실시하고 expre 분석 하였다콜라겐 타입 I, α-SMA, 잘 간 섬유화의 마커를 설립 멘틴의 ssion. 리포 칼린 2 (LCN2)의 발현은 지속적인 섬유화과 연관된 염증 반응을 나타낸다. 이 분석에서, 동일한 단백질 로딩은 β – 굴지에 대한 특이적인 항체로 말을 프로빙에 의해 입증되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 도 10 :. 염증 세포 침윤의 면역 염색 간 직렬 섹션 3 주 동안 담관 결찰술을받은 동물의 간으로부터 제조 하였다. 절편을 헤 마톡 실린 및 에오신 (A) 또는 CD45 (B)에 특이적인 항체로 염색 하였다. 유의하시기 바랍니다,담관 주변 CD45 양성 세포 수의 높은. 염증을 나타내는 이러한 대규모 침윤이 가짜로 작동하는 동물에서 유래 간 섹션에 표시되지 않습니다 (도시하지 않음). 각각의 그림 패널의 스케일 바는 500 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.