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Medicina

Bile ligature du canal chez la souris: induction de inflammatoire lésions hépatiques et les fibrose par obstructive cholestase

Published: February 10, 2015
doi:
10.3791/52438
, , , , , ,
1Institute of Molecular Pathobiochemistry, Experimental Gene Therapy and Clinical Chemistry,RWTH Aachen University, 2Institute for Laboratory Animal Science and Experimental Surgery,RWTH Aachen University, 3Department of Medicine III,RWTH Aachen University

Summary

Disruption of bile flow results in severe inflammatory cholestatic liver injury with a characteristic time-dependent sequence of morphological alterations. Here we present a protocol for the surgical ligation of the common bile duct in mice that allows to induce a strong fibrotic response after 21 to 28 days.

Abstract

Dans la plupart des vertébrés, le foie produit la bile qui est nécessaire pour émulsionner les graisses absorbées et permettre la digestion des lipides dans l'intestin grêle, ainsi que d'excréter la bilirubine et d'autres produits métaboliques. Dans le foie, l'obstruction expérimentale du système biliaire extrahépatique initie une cascade complexe d'événements pathologiques qui mène à la cholestase et l'inflammation résultant d'une réaction fibrotique solide provenant des champs périportes. Par conséquent, la ligature chirurgicale du canal cholédoque est devenu le modèle le plus couramment utilisé pour induire des blessures cholestatique obstructive chez les rongeurs et d'étudier les événements moléculaires et cellulaires qui sous-tendent ces mécanismes physiopathologiques induites par écoulement de la bile inappropriée. Au cours des dernières années, différentes techniques chirurgicales ont été décrites que soit permettre la reconnexion ou réanastomose après ligature du canal biliaire (BDL), par exemple, BDL partielle, ou d'autres méthodes de microchirurgie pour les questions de recherche spécifiques. Cependant, le modèle le plus fréquemment utilisé est l'obstruction complète du canal cholédoque qui induit une forte réponse fibrotique après 21 à 28 jours. Le taux de mortalité peut être élevé en raison de complications infectieuses ou des inexactitudes techniques. Ici nous fournissons une intervention chirurgicale détaillée pour le modèle BDL chez les souris qui induisent une réponse fibrotique hautement reproductible conformément à la règle des 3R bien-être animal postulée par Russel et Burch en 1959.

Introduction

La fibrose hépatique est définie comme la production et l'accumulation excessive de la matrice extracellulaire (ECM) qui provient d'un réseau complexe d'interactions entre les cellules étoilées hépatiques matrice et produisant une grande variété de cellules du sang du foie résident cellules infiltrantes et 1,2. Bien que la fibrose hépatique peut être causée par une multitude de différents stimuli les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la fibrose sont généralement très semblables. Suite à des lésions hépatiques, un programme très orchestré des changements moléculaires et cellulaires est initiée. Dans ce programme, une interaction étroite entre les signaux inflammatoires, des monocytes / macrophages et les cellules étoilées du foie se produit que les résultats finaux de l'activation des cellules étoilées et transdifférenciation de myofibroblastes, dépôt de ECM et les modifications anatomiques et fonctionnelles consécutives de l'intégrité des tissus du foie 3. L'activation des cellules étoilées du foie est particulièrement entraînée par des signaux inflammatoires et les interactions avec le foiemacrophages résidentiel (ce est à dire les cellules de Kupffer). Pathogènes motifs moléculaires associés sont reconnus par spécialisés récepteurs de reconnaissance des formes telles que les récepteurs Toll-like qui lorsqu'il est activé signal à travers un réseau complexe de différentes voies qui déclenchent l'expression et la sécrétion d'une multitude de cytokines inflammatoires et de chimiokines qui animent le processus inflammatoire 3. La réponse inflammatoire et l'insulte hépatique formé ne est que temporaire lorsque le facteur de maladie production est enlevé. En revanche, si la lésion persiste, l'inflammation chronique évolue dans le foie et l'expression et l'accumulation de la foule ECM au premier plan résultant de la substitution progressive du parenchyme hépatique normale par la formation de tissu cicatriciel.

Depuis fibrogenèse hépatique chez les humains est un problème clinique dans le monde entier, plusieurs modèles de rongeurs expérimentaux d'insuffisance hépatique aiguë et chronique ont été établies au cours des dernières décennies. Dans les muSystème rine par exemple, des modèles communs sont l'administration d'une variété de différents hépatotoxines, la ligature de la voie biliaire principale, l'induction d'une lésion hépatique auto-immune, et l'introduction ciblée d'anomalies génétiques ou inversement la surexpression des transgènes qui affectent critique voies impliquées dans la pathogenèse de la fibrose hépatique quatre signalisation.

La ligature de la voie biliaire commun chez les rongeurs a été réalisée comme une procédure expérimentale dans la recherche depuis de nombreuses années 08/05. Un premier protocole hautement reproductible pour la bile prolongée ligature du canal (BDL) chez les rongeurs a déjà été présenté il ya maintenant plus de trois décennies neuf. Dans ce protocole tant cathétérisme / obstruction et ligature induit un rendement élevé de la cirrhose chez les rats avec des changements morphologiques qui étaient comparables à ceux observés dans la cirrhose biliaire humaine 9. Le protocole respective est simple, l'intervention chirurgicale est relativement rapidement applicable, Et les taux des animaux de survie sont élevés à plus de 95%. Dans le protocole rat cathétérisme / d'obstruction classique, une courte incision de 2 cm est faite juste en dessous de la pointe du sternum. Par la suite, une canule est insérée dans la partie proximale de la voie biliaire et fixé dans sa position par des sutures en soie. Dans une étape suivante, la partie distale de la canule est obstruée avec trois noeuds, mettre à travers l'extrémité inférieure de l'incision médiane et enterré sous-cutanée dans le quadrant inférieur droit 9. A la fin, l'abdomen est fermé et les animaux sont autorisés à récupérer. Dans le protocole de ligation, les rats sont soumis à une double ligature de la voie biliaire principale, avec ou sans dissection de la voie biliaire principale entre les ligatures 9.

Ce modèle expérimental est bien acceptée et utilisée dans le monde entier dans des centaines de laboratoires pour induire une cholestase hépatique et la fibrose. Il induit biliaire intrahépatique prolifération des cellules épithéliales, differentiatio myofibroblastiquen portail de fibroblastes autour de la prolifération des cellules epitheliales biliaires, résultant en une expression massif très reproductible et le dépôt de 10,11 ECM. Par conséquent, l'application de ce modèle chez le rat et la souris est d'être populaire parmi les scientifiques qui visent à comprendre la pathogenèse de l'inflammation hépatique et la fibrose.

Dans notre laboratoire, nous avons largement utilisé ce protocole dans le passé chez les rats dans plusieurs études expérimentales visant à enquêter sur les aspects moléculaires et cellulaires spéciales de fibrogenèse hépatique et de tester de nouveaux concepts et de médicaments antifibrotiques 12-15.

Récemment, nous avons adapté cette méthodologie pour le système murin et constaté que l'opération de ligature de la voie biliaire est également un moyen attrayant pour établir la fibrose en fonction du temps avec une faible variation et de la mortalité chez les souris de 16 à 18. En raison de la petite taille des animaux, cependant, quelques modifications importantes en ce qui concerne l'anesthésie, interv chirurgicaleention et observation post-traitement sont nécessaires pour obtenir des résultats fiables et reproductibles dans ce modèle. L'adaptation complète est résumée dans le protocole suivant et dans la documentation vidéo d'accompagnement.

Protocol

NOTE: Toutes les expériences ont été approuvés par le soin des animaux d'État et l'utilisation comité officiel (LANUV, Recklinghausen, Allemagne). Les souris sont logés dans des conditions exemptes d'agents pathogènes spécifiques selon les directives de la Fédération pour les animaux de laboratoire associations scientifiques (FELASA). Toutes les expériences ont été menées conformément à la loi fédérale allemande sur la protection des animaux et «Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire» (National Institutes of Health publication 8 e édition, 2011). 1. Préparation préopératoire REMARQUE: Effectuer toutes les procédures dans des conditions propres mais non stériles. Tous les instruments et autres équipements réutilisables tels que pinces chirurgicales, ciseaux, et Colibri enrouleur qui sont utilisés pour effectuer des interventions chirurgicales doivent être stérilisés avant utilisation selon des protocoles qui sont en stricte conformité avec les directives institutionnelles pour effectuer les chirurgies chez les animaux.; Pour une liste détaillée des réactifs nécessaires, les matériaux et l'équipement, se il vous plaît se référer à la liste des matières spécifiques / équipement. Au cours de l'expérimentation complète, garder l'animal sur une plaque chauffante à une température de 37 ° C, connecté en permanence à un système d'anesthésie, et le couvercle de la zone opérationnelle globale avec imperméables aux fluides, des stores autocollantes. Organiser correctement tous les instrumentations et des solutions qui sont utilisés lors de l'expérimentation avant la chirurgie (figure 1). Anesthésier la souris à l'inhalation de 4% en volume d'isoflurane dans de l'oxygène à 100% à un débit de 4 l / min pour l'induction de l'anesthésie. La profondeur de l'anesthésie est suffisante lorsque les critères essentiels suivants sont accessibles: respiration régulière spontanée, sans réflexe après le réglage de stimuli de douleur entre les orteils, et aucune réponse à la douleur. Rasez la fourrure abdominale de la souris avec un rasoir électrique de la fourrure et de protéger les yeux de sécher par l'usage de l'oeil et npommade ose. Placez la souris sur une plaque chaude chauffée à 37 ° C, insérez le museau de la souris dans le masque Fluovac du système d'anesthésie Fluovac, et fixer les pattes de l'animal avec des bandes de ruban de soie. Maintenir une anesthésie de la souris par inhalation de 1,5 à 3% en volume d'isoflurane dans 100% d'oxygène à un débit de 1 L / min et incorporer analgésie périopératoire par injection intrapéritonéale d'une solution de la buprénorphine (0,1 mg / kg de poids corporel dissous dans une solution de NaCl à 0,9%) . Stériliser la peau abdominale rasée avec un tampon de gaze qui est humidifié avec une norme antiseptique, prête à utiliser solution alcoolique pour le traitement pré-opératoire de la peau. Remarque: Dans nos protocoles que nous utilisons un antisepticum de la peau poly-alcool. Ce est en pleine conformité avec la loi fédérale allemande sur la protection des animaux et les lignes directrices de la Fédération pour animaux de laboratoire associations scientifiques. Cet antiseptique contenant 70% (v / v) de 2-propanol, le butane-1,3.diol et des traces de jaune de quinoléine, du parfum ete. 2. Interventions chirurgicales Ouvrir l'abdomen avec une laparotomie médiane d'une longueur d'environ 2 cm en coupant le derme ainsi que le fascia en même temps avec un ciseau chirurgical 11,5 cm. On dissèque le tissu conjonctif sur le dessus du péritoine à l'aide du ciseau comme une spatule. Couper le péritoine le long de la ligne blanche pour ouvrir la cavité péritonéale. Agrandir la cavité par l'insertion d'un support de suture dans le sternum, portant le filament de la suture, et sa fixation sur le dessus du masque Fluovac. Étendre la zone d'opération en insérant un écarteur Colibri dans la cavité péritonéale (Figure 2). Soulevez le foie avec un hydratée (0,9% solution de NaCl) coton-tige de sorte que la face ventrale de lui colle à la membrane et le hile est clairement visible. Exposer le conduit biliaire par le mouvement de l'intestin caudal (Figure 3). Séparer soigneusement la voie biliaire de laflanquant la veine porte et l'artère hépatique en utilisant un micro-dentelures pince (figure 4A). Placez le 5-0 suture autour de la voie biliaire et le fixer avec deux noeuds chirurgicaux. Lorsque attacher les noeuds augmenter la force de traction continue à assurer obstruction efficace sans sectionner le canal biliaire (figure 4B). Ajouter une deuxième ligature crânienne de la même manière mais ne disséquer la voie biliaire entre les deux (Figure 4C). Sinon, il ya un risque considérable que les fuites biliaires si un nœud ne est pas sécurisée, et les animaux ne subissent aucune cholestase, mais développent une péritonite graves. Couper les extrémités des sutures (figure 4D), abaisser le sternum, et retirer l'écarteur. Rincer la cavité peritoneale avec une solution de NaCl à 0,9% et de remplacer les organes abdominaux aux positions physiologiques. Fermer les deux couches abdominaux (péritoine et la peau ainsi que planche de bord) avec des sutures de fonctionnement séparées avec 6-0 Mersilk. Couper le ends des sutures et stériliser la zone d'opération avec un tampon de gaze humidifiée avec une solution antiseptique. REMARQUE: Lorsque vous effectuez l'opération pour la première fois, effectuer toutes les procédures en vertu d'un microscope chirurgical à un grossissement de 16X-20X. Cela permet une meilleure reconnaissance de la voie biliaire et le distingue de la veine porte et l'artère hépatique (figures 5 et 6) clairement. Certains laboratoires recommandent la dissection de la voie biliaire principale entre les deux ligatures. Laissez la voie biliaire intacte parce fuites potentielles dans l'un des noeuds se traduira par une péritonite aiguë sévère, ascite et endotoxémie systémique lorsque le canal biliaire est disséqué. 3. Traitement post-opératoire et suivi Laisser la souris pour récupérer dans une cage chauffée par une lampe à infrarouge jusqu'à ce que la souris est pleinement éveillé et actif. Ensuite, déplacez la souris dans une cage normal et fournir un accès ad libitum à l'eau et de la nourriture. Unprès la chirurgie, de surveiller les animaux à intervalles réguliers et d'effectuer le suivi de traitement post-opératoire à l'analgésie appropriée (par exemple, la solution de la buprénorphine) suite à la recommandation locale du soin des animaux interne et appel à des comités. REMARQUE: Effectuer un traitement analgésique pour trois jours. Tout comportement anormal peut indiquer des complications rares comme la péritonite, septicémie ou une hémorragie interne et devrait être traitée comme critère d'évaluation humaine de mettre fin à l'expérience. Les animaux sont maintenus avec un accès libre à la nourriture et l'eau ad libitum jusqu'à la fin de l'expérience. Il ne est pas nécessaire pour le dessin de sang depuis fibrogénèse en cours est indiqué par un ictère. Lorsque les animaux sont sacrifiés, le sang est prélevé pour la mesure de paramètres de chimie clinique (AST, ALT, bilirubine, etc.) et le foie est récupérée pour l'analyse histochimique et biochimique.

Representative Results

Dans une expérimentation typique BDL a été réalisée dans 40 souris mâles / 6 de type sauvage C57BL pesant environ 18-20 grammes. Cette expérience a été effectuée pour étudier la fibrogenèse hépatique dans la phase d'initiation (3 et 7 jours), lors de la progression (10, 14, et 20 jours), et pendant à long terme (30 et 60 jours) 16. Dans ce modèle, la fibrose persinusoidal a déjà développé sur 10 jours après l'opération, tandis que la fibrose périportale qui augmente en permanence jusqu'à la fin de l'expérience a été complètement développée au bout de 20 jours. Dans l'expérience mentionnée, tous les animaux qui ont reçu une imposture-opération simple survécu, et seulement deux des 40 souris (5%) qui ont reçu BDL développé un mauvais état général et ont donc été sacrifiés prématurément avant le point de fin projetée de l'expérience. L'activité des animaux opérés de manière fictive était déjà sans exception normale un jour après laparotomie, alors que la plupart des animaux soumis à BDL ont montré une activité réduite au cours des trois premiers jours. Jaundiced la peau avait été déjà apparente dans tous les animaux BDL un ou deux jours après la prise de la BDL 16. Les valeurs à la fois de l'alanine aminotransférase (ALT) et d'aspartate aminotransférase (AST) qui représentent des marqueurs sériques bien établies d'atteinte hépatique ont augmenté rapidement et ont atteint un sommet durant la journée et 7 jours 20 après BDL (tableau 1). Par la suite, ALT et AST diminué régulièrement jusqu'au jour 30 et sont restés stables jusqu'à 60 jours après la chirurgie. En ligne avec la blessure cholestatique, les concentrations sériques de la bilirubine totale étaient constamment élevée et atteint un plateau après 7 jours 16. Similaires cours du temps des activités d'ALT et AST sériques ont également été signalés chez les rats qui ont subi BDL. Dans une étude récente, il a été la démonstration que les niveaux de AST et ALT sérique augmenté jusqu'à 5 ou 10 fois la normale lors de la première semaine après la chirurgie BDL et diminué après deux semaines 19. Typiquement, les foies d'animaux opérés de manière fictive semblent toujours Smooth à la fin de l'expérience, tandis que les foies des animaux qui ont reçu BDL montrent des modifications architecturales qui sont caractérisées principalement par la formation d'oedème et fibrotiques nodules à la surface du foie et anasarque de la vésicule biliaire qui est rempli avec de grandes quantités d'correspondant bile (figure 7). Les modifications morphologiques caractéristiques du foie induites par la chirurgie BDL sont également démontrable dans l'analyse histologique standard (Figure 8). Dans la même série d'expériences, le développement de la fibrose hépatique a été évaluée semi-quantitativement sur la base de l'histologie du foie évaluée par un pathologiste aveugle utilisant un système de notation dans lequel la fibrose périportale a été organisée 0-4 et 0-2 périsinusoïdale fibrose, donnant un maximum valeur qui est équivalente à la cirrhose 6. Comme on s'y attendait, le score moyen de la fibrose dans le groupe des animaux opérés de manière fictive était de 0,00 ± 0,00. En revanche, dans le groupe d'animaux tchapeau reçu BDL, le score a augmenté régulièrement jusqu'à ce jour 60 à une valeur de 4,83 ± 0,17. Le maximum de trois pour la fibrose périportale a été atteint au jour 20. Dans tous les animaux analysés, la fibrose périsinusoïdale était absent pendant les 10 premiers jours de l'expérience et a été tout d'abord perceptible au bout de deux semaines. Par la suite, il a augmenté de façon constante jusqu'à la fin de l'expérience à des valeurs de 1,8 ± 0,17 (tableau 1). Egalement dans plusieurs autres expériences sur les animaux indépendantes qui ont été effectuées, il a été observé que la formation de fibrose était augmentation dépendant du temps de très reproductible démontrant l'expression de collagène intra-hépatique et le dépôt à la suite de la fibrogenèse en cours (figure 9). De même, le processus de fibrogénèse cours est perceptible dans l'expression élevée de α-actine musculaire lisse (α-SMA) qui représente un marqueur de cellules fibroblastiques, soit activée hépatique cellules étoilées et myofibroblastes portail,et hydroxyproline hépatique, un acide aminé abondamment trouvées dans les matrices de collagène 18 (figure 9). En outre, l'expression de la vimentine indique que des quantités de plus en plus myofibroblastes ou des fibroblastes est augmentée après le réglage de la chirurgie BDL 20. La concomitance de l'inflammation dans le foie blessés sont encore traduit par une expression accrue de Lipocalin 2 (LCN2) qui est fortement induite pendant une lésion hépatique aiguë et chronique et évolue effets hépato-protecteur au cours de lésion hépatique aiguë 21,22. Les cellules inflammatoires infiltrent que le foie des animaux qui ont reçu BDL peuvent être détectés par coloration spécifique avec un anticorps qui est spécifique de CD45 (Figure 10). Ce marqueur de surface cellulaire qui est également connu comme PTPRC (protéine tyrosine phosphatase, type récepteur) est spécifiquement exprimé dans toutes les cellules hématopoïétiques différenciées, à l'exception des erythrocytes et des cellules plasmatiques. <table fo:keep-together.within-page = "border" > Temps après ligature du canal biliaire (jour) La bilirubine totale AST (U / L) ALT (U / L) Portail fibrose Fibrose périsinusoïdale Note totale (Mg / dl) 0 (n = 3) 0,17 ± 0,06 192,67 ± 30,50 50,33 ± 6,03 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 3 (n = 5) 6,85 ± 2,21 1159,25 ± 319,27 566,50 ± 335,25 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 7 (n = 5) <td> 14,38 ± 2,14 ± 976,60 ± 477,16 448,20 ± 259,47 0,60 ± 0,25 0,0 ± 0,0 0,60 ± 0,25 10 (n = 5) 15,92 ± 2,60 1916,60 ± 868,25 560,40 ± 80,88 1,40 ± 0,25 0,25 ± 0,25 1,67 ± 0,25 14 (n = 5) 17,90 ± 3,84 1088,60 ± 276,32 505,00 ± 96,15 ± 2,4 ± 0,25 1,0 ± 0,0 3,40 ± 0,24 20 (n = 4) 18,00 ± 2,12 1072,67 ± 364,27 404,00 ± 195,48 3,0 ± 0,0 1,0 ± 0,0 4,0 ± 0,0 30 (n = 5) 16,04 ± 4,79 446,40 ± 169,75 260,20 ± 126,97 ± 2,8; 0,2 1,4 ± 0,25 4,20 ± 0,20 60 (n = 6) 16,02 ± 1,19 484,67 ± 117,79 257,17 ± 50,97 3,0 ± 0,0 1,8 ± 0,17 4,83 ± 0,17 Les abréviations utilisées sont: ALT, alanine aminotransférase; AST, aspartate aminotransférase. Tableau 1: fibrose marquant dans une expérience représentative Les données de ce tableau a été reproduit à partir d'une étude dans laquelle la fibrose hépatique a été induite par ligature du canal cholédoque dans C57BL / 6 16.. Dans cette étude, le taux de mortalité après la chirurgie BDL était de 5% (2 sur 40 animaux ont été sacrifiés prématurément parce que les conditions animales pauvres développés). Figure 1: Dispositif expérimental pour effectuer une bileligature du canal. L'animal est maintenu sur une plaque chauffante à une température de 37 o C et la zone opérationnelle est couverte globale avec imperméables aux fluides, des stores autocollantes. Au cours de la chirurgie terminée, l'animal est relié en permanence à un système d'anesthésie. Tous les instrumentations et solutions (analgésiques, des anesthésiques, solution antiseptique, 0,9% de NaCl) sont disposés clairement. Figure 2:. Préparation de la zone de la chirurgie Avant l'ouverture de la cavité péritonéale, la peau abdominale doit être rasé avec un rasoir électrique de la fourrure et désinfecté avec un tampon de gaze antiseptique. La zone d'intervention chirurgicale est ensuite recouvert d'un fluide imperméable, des stores auto-adhésives. L'abdomen est ouvert avec une laparotomie médiane (~ 2 cm de longueur). La cavité est agrandie en insérant un maintien de suture dans le sternum et la zone d'opération se propager parl'insertion d'un enrouleur permettant l'expérimentation Colibri sans entrave au cours de la chirurgie. Figure 3: L'exposition de la voie biliaire. (A) Pour la réalisation de la ligature du canal cholédoque, la face ventrale du foie est soulevé afin qu'il puisse en tenir à la membrane et le hile hépatique devient clairement visible. (B) Pour mieux les dénoncer la voie biliaire, l'intestin est caudale déplacé avec un coton-tige humidifié. Le canal biliaire est indiqué par une flèche. Figure 4: La ligature de la voie biliaire. (A) Dans une première étape, la voie biliaire est séparé soigneusement à partir de la veine porte et flanquant artère hépatique en utilisant un micro-dentelure forceps. (B) Ensuite, un fil de suture est placé autour dela voie biliaire et fixé avec un noeud chirurgical (C). Par la suite, un second fil de suture est placé à proximité immédiate de la première suture et noué autour de la voie biliaire. (D) Le fil de suture est raccourci, la cavité rincés avec une solution de NaCl à 0,9% et tous les organes remplacés à leur position physiologique. Figure 5:.. Représentation précise de nouage Pour documenter le placement des sutures et la fixation des deux noeuds qui empêchent l'écoulement de la bile, le même mode opératoire présenté sur la figure 4 a été documentée en vertu d'un binoculaire (A) de confinement de la voie biliaire avec la premier fil de suture. (B) le nouage de la première suture. (C) de confinement de la voie biliaire avec le deuxième fil de suture. (D) de la seconde Knotting suture. (E) Double-ligaturé bile dUCT après raccourcissement de sutures excédentaires. (E ') Ce panneau montre un croquis de (E). Les positions de la droite (RL), à gauche (LL) et médian (ml) des lobes du foie ainsi que de la voie biliaire, de l'estomac et du duodénum sont appelées. Dans l'esquisse la voie biliaire est à double ligaturé par deux sutures. Figure 6:. Anatomie de la voie biliaire, la veine porte et l'artère hépatique chez la souris Pour une meilleure localisation anatomique du canal cholédoque, la veine porte et l'artère hépatique sont dépeints comme un régime. Marqué sont également les positions de la droite (de droite à gauche), à ​​gauche (ll) médian (ml) et le noyau caudé (cl) lobes du foie. Figure 7: Représentant appearance des foies deux semaines après opération fictive et BDL. Souris C57BL / 6 ont été soumises à une opération ou intervention chirurgicale simulacre BDL. Après deux semaines de la cavité viscérale a été ouverte. Bien que le foie des animaux opérés de manière fictive ne présentaient aucun signe de fibrose, le foie des animaux recevant la ligature de la voie biliaire ont une structure de surface irrégulière avec formation d'oedème et de nodules fibreux sur la surface de foies correspondants. Figure 8:. Sections de foie hématoxyline et éosine ont été préparés à partir de C57BL / 6 animaux de type sauvage qui étaient opération fictive (A) ou reçus BDL pendant trois semaines (B). Les sections ont été colorées avec des procédures standard de l'hématoxyline et de l'éosine suivantes. Se il vous plaît noter les modifications typiques dans le foie BDL qui comprennent des signes d'inflammation (cellules infiltrant), parenchyme (hépatoCyte) nécrose, et la prolifération des voies biliaires. La barre d'échelle dans chaque panneau de chiffre représente 50 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 9: lectures histologiques et biochimiques pour fibrogenèse hépatique. (A) les articles du foie ont été préparés à partir d'animaux qui ont reçu opération fictive ou BDL pour deux semaines et colorées avec Sirius Rouge (panneau supérieur, les fibres de collagène en rouge) ou analysés pour l'expression d'α-actine musculaire lisse (α-SMA) (panneau inférieur , cellules positives α-SMA en brun) par immunohistochimie. La barre d'échelle dans chaque panneau de chiffre représente 100 um. (B) Les extraits protéiques de foies ont été soumis à Western blot et analysé pour EXPREssion du collagène de type I, α-SMA, et Vimentin qui sont des marqueurs de la fibrogenèse hépatique bien établi. L'expression de la lipocaline 2 (LCN2) indique la réponse inflammatoire associée à la fibrogenèse cours. Dans cette analyse, une charge égale de protéines a été démontrée en sondant les taches avec un anticorps spécifique pour β-actine. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 10:. La coloration immunologique de l'infiltration des cellules inflammatoires du foie sections en série ont été préparées à partir d'un foie d'un animal qui a reçu la ligature du canal cholédoque pendant 3 semaines. Les sections ont été colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine (A) ou avec un anticorps qui est spécifique de CD45 (B). Se il vous plaît noter,le nombre élevé de cellules positives CD45 entourant les voies biliaires. Ces infiltrats massifs qui indiquent inflammation ne sont pas visibles dans les sections de foie provenant d'animaux opérés de manière fictive (non représentées). La barre d'échelle dans chaque panneau de chiffre représente 500 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Une lésion hépatique cholestatique est l'un des principaux facteurs responsables du développement de la fibrose et la cirrhose du foie chez les patients ayant une maladie hépatique chronique. Basé sur le fait que ces maladies produisent des coûts des soins de santé impondérables, il est compréhensible que de nombreux chercheurs tentent de comprendre les mécanismes pathogènes de la fibrose hépatique en cours. Par conséquent, des modèles expérimentaux ont été générés qui imitent les divers aspects des mécanismes complexes qui conduisent à une inflammation hépatique, la fibrose et la cirrhose 1.

Chirurgical BDL est l'un des modèles expérimentaux les plus répandues qui est utilisé pour induire des blessures cholestatique obstructive chez les souris et les rats 4,23,24. Dans la plupart des protocoles, les animaux sont anesthésiés et une section médiane de la laparotomie est effectuée. Par la suite, la voie biliaire principale est à découvert à partir de la cavité abdominale et on le ligature à deux reprises avec de la ficelle chirurgicale. En conséquence, les souris et les rats qui ont reçu cette chirurgie dEvelop un réaction fibrotique forte qu'au premier proviennent des champs périportaux 25. Au cours des années, plusieurs techniques chirurgicales différentes et des modifications ont été décrites. Procédures spéciales permettent même de reconnexions ou réanastomose après BDL 23. D'autres techniques sont basées sur BDL partiel résultant en beaucoup moins de formation de nécrose et par conséquent la prolifération des hépatocytes 24. BDL partielle en combinaison avec l'élimination ultérieure de la vésicule biliaire (cholécystectomie) qui empêche la formation d'une cholécystite représente également un excellent modèle expérimental pour cholestase aiguë. Il a été proposé pour être un modèle qui est plus proche de la situation humaine 24. Et en effet, lors de l'établissement de ce modèle, il a déjà été démontré qu'il cause reproductible cholestase avec seulement une lésion tissulaire histologique minime et ne procède pas à une cholestase chronique 25. Par conséquent, il a été suggéré que ce modèle est idéal pour étudier lateffets de e de cholestase inversée 24. Même des méthodes plus sophistiquées sont basées sur la microchirurgie et permettent un moyen rapide et reproductible d'infliger des lésions hépatiques cholestatiques dans une partie seulement du foie 26.

Bien que ces modifications sophistiquées de la BDL protocole original ont été révélés très utiles dans les enquêtes sur des questions spécifiques de recherche, de nombreux laboratoires dans le monde visent essentiellement à employer le modèle BDL comme un modèle hautement reproductible et fiable pour la fibrose hépatique cholestatique. Cependant, de nombreuses complications peuvent survenir pouvant modifier considérablement la reproductibilité et la fiabilité des résultats obtenus par ce modèle, si des inexactitudes techniques ne sont pas évités. Par exemple, les complications liées aux lésions des vaisseaux sanguins accompagnant le saignement des voies biliaires (voir figures 3-4) peuvent se produire pendant ou après une intervention chirurgicale rapide. Surdosage de l'anesthésie avec dépression cardiaque ou r ultérieureéchec espiratory sont aussi des complications évitables de la procédure. Les infections sévères, allant de la péritonite, de la septicémie peuvent se produire pendant toute la durée de l'expérience, si les fils de suture ne sont pas effectuées avec précision et les fuites biliaires dans la cavité peritoneale. Les blessures accidentelles à l'intestin pendant la chirurgie pourraient également conduire à une péritonite. Par conséquent, il est évident que des protocoles normalisés qui sont en conformité avec les directives de manipulation strictes sont fortement nécessaires. Cette disposition a aussi été récemment réclamé dans les pays de l'Union européenne, qui a mis en œuvre de nouvelles règles de protection des animaux en 2013 1. Les exigences respectives qui sont associés à ce règlement ne sont pas nouvelles et ont déjà été proposées en 1959, lorsque Russell et Burch suggéré une éthique cadre pour mener des expériences scientifiques avec des animaux qui est basé principalement sur ​​un remplacement, raffinement et réduction (3R) principe 27.

En suivant l'outlinprotocole ed il ya seulement quelques complications qui peuvent survenir à partir des inexactitudes techniques. Trois questions spécifiques peuvent se produire en assez basse fréquence.

Comme avec toutes les procédures chirurgicales, la surdose d'anesthésique est une source potentielle de danger pour les animaux en particulier en combinaison avec une hypothermie. Si pendant la chirurgie complications cardiovasculaires se produisent, la fourniture d'anesthésiques doit être arrêté immédiatement et l'opérateur devrait essayer de fournir autant que possible l'oxygène à la souris. Cela peut être fait au moyen d'une petite seringue en plastique qui est rempli d'air et pompée dans la bouche de l'animal réduite. Alternativement, l'utilisation d'un petit Peleusball pour la ventilation de l'animal infecté est souvent utile pour le processus de revitalisation.

Problèmes dans la cicatrisation des plaies

Après la chirurgie BDL, les souris peuvent se mordre les coutures endoloris ou ceux d'autres animaux. Si cela se produit, les souris respectifs devraient être séparémenten cage. Animaux présentant des plaies ouvertes doivent être anesthésiés, la région autour de la plaie doucement stérilisé avec un antiseptique standard, et la plaie doit être cousu à nouveau. Au cours des 3 prochains jours, la plaie de ces animaux doit être inspecté régulièrement (deux à trois fois par jour).

Ballonnements de l'abdomen ou de la formation de l'ascite sont indicatifs pour les infections bactériennes. Celles-ci pourraient survenir en raison de travail non stérile au cours de la chirurgie. Tous les types d'infections doit être manipulé sans exception comme critère humain et les animaux touchés devrait être sacrifié.

Nous avons fourni un facile de suivre le protocole qui permet l'exécution de BDL chez la souris qui est simple à mettre en œuvre et évoque la mortalité animale qu'une faible combinée à une haute reproductibilité. Tous les protocoles chirurgicaux peuvent être rapidement appréhendé par des scientifiques qualifiés. Au cours de l'expérimentation terminée, les animaux sont gardés sur une plaque chauffante à 37 ° C et connectés en permanenceà un système d'anesthésie minimiser la douleur et la détresse. Pour la chirurgie, l'abdomen est ouvert avec une laparotomie médiane et la voie biliaire principale ligaturée double sans dissection. Les résultats représentatifs qui ont été discutés ici démontrent que les changements phénotypiques en ce qui concerne la morphologie du foie (inflammation, la fibrose, la cirrhose) sont hautement reproductibles et permettent d'étudier les différents aspects de la fibrogenèse (par ex., L'initiation, l'inflammation, la progression, la maladie en phase terminale) aux points de contrôle définis.

Nous espérons que le résumé de notre protocole aidera à raccourcir la courbe d'apprentissage qui est nécessaire pour établir avec succès ce modèle de la fibrose dans d'autres laboratoires et de garantir des résultats fiables et reproductibles à différents endroits. Ainsi nous pensons que le protocole présenté appuie le principe des 3R qui devait par Russell et Burch en 1959 et représente la base de nouvelles règles de protection des animaux qui sont actuellement mises en œuvre dans de nombreux pays wimince Cadre européen.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à remercier le soutien financier de la Fondation allemande pour la recherche (SFB / TRR57, Q3 et Q2). Les auteurs remercient Mareike Schulz, Pascal Paschenda et Klaudia Warzecha pour leur aide dans la préparation des photographies.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Isoflurane Forene Abbott B 506
Shaver Favorita II Aeskulap GT104
Cutter head Aeskulap GT730
Bepanthen eye and nose ointment Bayer Vital GmbH 6029009.00.00
Warming plate and controller Labotect HP 062
Fluovac anesthesia system Harvard Apparatus 34-1030
ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser Eickemeyer 4802885
Scotch Tape commercially available
Tissue paper commercially available
Durapore silk tape 3M 1538-1
Cotton Gauze swabs Fuhrmann GmbH 32014
Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum Antiseptica GmbH 72PAH200
Raucodrape OR adhesive drapes Lohmann & Rauscher GmbH 33013
Scissor Fine Science Tools Inc. 14074-11
Graefe forceps straight Fine Science Tools Inc. 11050-10
6-0 Mersilk suture Ethicon K889H Silk, non-absorbable/Abdominal closure
Needle holder Mathieu Fine Science Tools Inc. 12010-14
Colibri retractor Fine Science Tools Inc. 17000-03
Cotton swabs Noba Verbandmittel 974202
Cotton swabs Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH 1032238
25mL beaker Schott Duran 50-1150
Isotonic (0.9%) NaCl solution DeltaSelect GmbH PZN 00765145
Micro-serrations forceps Moria MC31 Fine Science Tools Inc. 11370-31 Bile duct separation
5-0 Mersilene suture Ethicon EH6731H Polyester, non-absorbable/Bile duct ligation
5mL syringe BD Discardit II 300296
1mL syringe BD Plastipak 300013
Sterican needle 26 G x 1 B. Braun 4657683
Buprenorphine Essex Pharma 997.00.00 Analgeticum, 0.1 mg/kg
Infrared lamp Petra Electric IR 11
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Referencias

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Tag, C. G., Sauer-Lehnen, S., Weiskirchen, S., Borkham-Kamphorst, E., Tolba, R. H., Tacke, F., Weiskirchen, R. Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis. J. Vis. Exp. (96), e52438, doi:10.3791/52438 (2015).
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