Radial Mobilité et cytotoxiques fonction de réplication rétrovirale Vector transduits, non-adhérent Alloresponsive lymphocytes T
Summary
We describe a protocol to monitor radial mobility of non-adherent immune cells in vitro using a cell sedimentation manifold/slide apparatus. Cell migration is tracked on monolayers of tumor cells or on extracellular matrix proteins. Examination by light and fluorescence microscopy allows for observation of cell mobility and cytotoxic functionality.
Abstract
Nous rapportons une nouvelle adaptation du dosage Cell Migration radiale monocouche, d'abord rapporté pour mesurer la migration radiale des cellules tumorales adhérentes sur les protéines de la matrice extracellulaire, pour la mesure de la motilité de cellules immunitaires marquées par fluorescence, les droits non adhérente ou effectrices murin. Cette technique utilise un collecteur en acier inoxydable et lame de Téflon 10 puits à déposer focalement cellules T non adhérentes dans des puits préparés soit avec des monocouches de cellules tumorales confluentes ou des protéines de la matrice extracellulaire. La microscopie par fluorescence de lumière et / ou multi-canal est utilisé pour suivre le mouvement et le comportement des cellules effectrices dans le temps. Les colorants fluorescents et / ou des vecteurs viraux qui codent pour des transgènes fluorescents sont utilisés pour marquer de manière différentielle les types de cellules pour l'imagerie. Cette méthode est distincte de type semblable dans des essais in vitro qui suivent horizontale ou verticale migration / invasion utilisant des chambres de diapositives, l'agar ou transwell plaques. Le test permet aux données d'imagerie détaillées à Be recueillies avec différents types de cellules qui se distinguent par des marqueurs fluorescents spécifiques; même sous-populations spécifiques de cellules (ce est à dire, une transduction / nontransduced) peuvent être surveillés. Surface parcelles de fluorescence d'intensité sont générées en utilisant des canaux de fluorescence spécifiques qui correspondent au type de cellule en cours de migration. Cela permet une meilleure visualisation de la mobilité immunitaire non-adhérent cellulaire à des moments précis. Il est possible de recueillir des preuves d'autres fonctions des cellules effectrices, telles que la cytotoxicité ou le transfert des vecteurs viraux de l'effecteur aux cellules cibles, aussi bien. Ainsi, le procédé permet aux chercheurs de documenter les interactions de microscope marqués de façon différentielle, non adhérente de cellule à cellule avec les cellules adhérentes de différents types. Ces informations peuvent être particulièrement pertinent dans l'évaluation de types de cellules immunitaires biologiquement actif ou manipulées, où une preuve visuelle de la fonctionnalité est recherchée avec les cellules cibles de tumeur avant leur utilisation pour le traitement du cancer.
Introduction
Le dosage migration cellulaire Radial monocouche a été initialement développé pour mesurer les propriétés d'infiltration de cellules tumorales adhérentes 1-4 sur des lames revêtues de la matrice extracellulaire (ECM) protéines 5-7 ou avec des composants ECM individuelles, telles que la fibronectine ou la laminine 1,2. La technique implique l'ensemencement d'une suspension cellulaire unique de cellules tumorales dans le centre du puits en utilisant un collecteur de cellules sédimentation en acier inoxydable (CSM). Après sédimentation, les cellules tumorales se conformer au fond du puits et de la variation dans le diamètre de la population initiale de cellules au cours du temps a été utilisée pour établir un taux de mobilité horizontale. Le dosage migration cellulaire Radial monocouche fourni un avantage visuel sur les autres méthodes existantes qui emploient transwell plaques pour doser les capacités migratoires in vitro de cellules; ces tests sont non-propice à l'imagerie 8. En outre, il a également fourni une grande liberté dans le choix du timepoints lorsque la migration est évalué, sans aucune limite sur le nombre de points dans le temps un chercheur pourrait choisir d'image après la sédimentation.
Étant donné que la capacité de migrer est une fonctionnalité importante pour les cellules non adhérentes, en particulier dans le domaine de l'immunothérapie ou où ils peuvent être utilisés comme véhicules de délivrance de vecteurs viraux, nous avons adapté l'utilisation du CSM afin d'évaluer la migration des cellules non-adhérentes types sur des monocouches de cellules tumorales, en plus des protéines de la MEC. L'avantage supplémentaire de la visualisation au microscope la migration de cellules non-adhérentes sur des monocouches de cellules viables de la tumeur, sur ECM complexe isolé de la tumeur, ou sur des composants individuels de l'ECM rend ce test polyvalent. Les dosages qui utilisent des puits revêtus avec une seule protéine extracellulaire ne reflètent pas de façon précise le substrat de tissu ou de tumeur ECM les cellules migrer à travers seraient in vivo.
Ici, nous avons utilisé alloréactives lymphocytes T cytotoxiques (alloCTL), sensibilisés aux histocomp majeureatibility complexe (MHC) des protéines en utilisant des réactions de cellules tumorales de lymphocytes mixtes à une voie (MLTR) ou des réactions lymphocytaires mixtes (RLM) 9, comme notre type cellulaire non adhérente représentant. Nous avons testé les cellules d'origine tant humaine et murine. Lorsque la migration a été mesurée sur des monocouches tumorales, les cellules tumorales employées étaient des cibles partiellement pertinentes, l'affichage de certaines des mêmes protéines CMH trouvés sur la population de cellules utilisé pour sensibiliser les effecteurs, ou des cibles totalement pertinentes, avec un ensemble complet de molécules du CMH que le effecteurs avaient été sensibilisés envers. Dans certaines expériences, nous avons utilisé CellTracker fluorescent ou un colorant rouge CMPTX de prolifération cellulaire eFluor 670 pour différencier entre les cellules effectrices et cibles. Nous avons également utilisé transduction avec des vecteurs viraux codant pour des protéines fluorescentes comme un moyen supplémentaire pour visualiser les cellules. Pour certains essais, nous transduites l'alloCTL avec des vecteurs de réplication rétroviraux (VRR) de codant pour Emerald Green (EMD) de la protéine fluorescente 10,11; pour OTHteurs, les cellules tumorales ont été transduites avec les vecteurs lentiviraux codant pour mStrawberry.
Le alloCTL ont été ensemencées à travers un canal du collecteur dans le centre de soit des monocouches de cellules tumorales ou ECM récoltées à partir de monocouches de cellules tumorales. Les interactions des cellules adhérentes et non adhérentes ont été visualisées par lumière et / ou par microscopie de fluorescence au cours du temps. Perturbation dans la monocouche de cellules tumorales à faible puissance, ou les cellules tumorales avec des noyaux fragmentés à forte puissance étaient indicateurs de dommage cellulaire par lyse et l'apoptose, respectivement. Nous numériquement créé cartes fluorescentes d'intensité de surface montrant la migration des cellules T fluorescent non-adhérentes sur les cultures en monocouche. Nous avons également noté la cytotoxicité engendré à la monocouche cellulaire de gliome adhérente après la formation du groupe de l'alloCTL non adhérente superposée. En outre, la transduction horizontal de RRV-EMD de la alloCTL à la monocouche de gliome a été observée.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les cellules tumorales dans une suspension de cellules uniques ont été introduits à la pipette dans les puits d'une lame de téflon masqué. Les cellules ont été laissées à adhérer et ensuite formé des monocouches dans un humidifiée à 5% de CO2, 37 ° C incubateur (figure 1A). Monocouches établies ou des protéines de la MEC dérivés de la monocouche peuvent être récoltées pour ces dosages (figure 1B). Lymphocytes T effecteurs marqués avec des colorants f…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Soutenu en partie par NIH R01 CA121258, CA125244 R01, R01 CA154256, NIH / RNTAC UCLA CTSI Grant Nombre UL1TR000124, USAMRMC W81XWH-08-1-0734, et le Fonds de recherche Joan S. Holmes Memorial. MJH et GCO reçus soutenus de la Joan S. Holmes Memorial postdoctorale à l'UCLA. Le dispositif CSM a été obtenu à partir de Creative méthodes scientifiques: www.creative-sci.com. Le vecteur lentiviral a été reçue de la UCLA Vecteur de base, qui est soutenu par CURE / P30 DK041301.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Teflon-masked microscope slides | Creative Scientific Methods | CSM002 | |
| Cell Sedimentation Manifold | Creative Scientific Methods | CSM001 | |
| Petri Dish, 150mm | Corning | 430597 | |
| Petri Dish, 35mm | Corning | 430588 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Mediatech | 21-040 | |
| 20 μL Pipetman | Gilson | F123600 | |
| 200 μL Pipetman | Gilson | F123601 | |
| 200 μL pipette tips | VWR | 89003-060 | |
| Distilled, deionized water (sterile) | Mediatech | 25-055 | |
| Trypsin | Mediatech | 25-054-CL | |
| Celltracker Red CMPTX | Invitrogen | C34552 | |
| TrypLE Express (optional) | Gibco | 12604 | |
| Tumor cell culture media (e.g. DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| AIM-V serum-free media | Invitrogen | 12055-083 | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Inverted microscope | |||
| SPOT Advanced | Diagnostic Instruments | ||
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Fibronectin | BD | 354008 | |
| 31/2 x 51/4 Autoclave Pouches | Crosstex | SCXS2 | |
| Trypan Blue | Mediatech | 25-900-CI | |
| Cell Proliferation eFluor 670 | eBioscience | 65-0840-85 | |
| ImageJ | NIH |
Referencias
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