شعاعي التنقل والسامة للخلايا وظيفة من فيروسات الرجعية تكرار ناقل Transduced، غير ملتصقة Alloresponsive T اللمفاويات
Summary
We describe a protocol to monitor radial mobility of non-adherent immune cells in vitro using a cell sedimentation manifold/slide apparatus. Cell migration is tracked on monolayers of tumor cells or on extracellular matrix proteins. Examination by light and fluorescence microscopy allows for observation of cell mobility and cytotoxic functionality.
Abstract
نحن الإبلاغ عن التكيف رواية للمقايسة الهجرة خلية شعاعي أحادي الطبقة، لاول مرة لقياس الهجرة شعاعي من الخلايا السرطانية ملتصقة على البروتينات المصفوفة خارج الخلية، لقياس الحركة البشرية غير ملتصقة أو المستجيب الفئران خلايا fluorescently المسمى، المناعية. هذه التقنية تستخدم مشعب الفولاذ المقاوم للصدأ و10-جيدا الشريحة تفلون لإيداع الوزراء البريطانى خلايا T غير ملتصقة في آبار أعدت مع أي متموجة الطبقات الوحيدة الخلية السرطانية أو البروتينات المصفوفة خارج الخلية. يستخدم الضوء و / أو متعدد القنوات المجهري مضان لتتبع حركة وسلوك الخلايا المستجيب على مر الزمن. الأصباغ الفلورية و / أو ناقلات فيروسية أن يتم استخدام رمز الجينات المحورة الفلورية لتسمية بشكل مختلف أنواع الخلايا للتصوير. هذا الأسلوب هو متميز من نوع مماثل في فحوصات المختبر التي تتبع أفقي أو عمودي الهجرة / الغزو استخدام غرف الشرائح، أجار أو transwell لوحات. مقايسة يسمح بيانات التصوير مفصلة لبالبريد جمعها مع أنواع مختلفة من الخلايا تتميز علامات الفلورسنت محددة؛ يمكن رصدها حتى القطعان معينة من الخلايا (أي transduced / nontransduced). يتم إنشاؤها سطح المؤامرات كثافة مضان باستخدام قنوات محددة مضان التي تتوافق مع نوع من الخلايا المهاجرة. وهذا يسمح لتصور أفضل للتنقل الخلايا المناعية غير ملتصقة في أوقات محددة. فمن الممكن لجمع أدلة عن وظائف الخلية المستجيب أخرى، مثل سمية الخلايا أو نقل ناقلات فيروسية من المستجيب لاستهداف الخلايا، كذلك. وهكذا، فإن الأسلوب يسمح للباحثين لتوثيق مجهريا خلية الى خلية تفاعلات المسمى تفاضلي، وعدم تمسكا مع الخلايا الملتصقة من مختلف الأنواع. قد تكون هذه المعلومات ذات أهمية خاصة في تقييم أنواع الخلايا المناعية بيولوجيا التلاعب بها أو تفعيلها، حيث هو المطلوب برهان البصرية من وظائف مع الخلايا المستهدفة الورم قبل استخدامها لعلاج السرطان.
Introduction
وقد تم تطوير هذا الفحص الهجرة خلية شعاعي واحد رقائق أصلا لقياس خصائص الارتشاحي من الخلايا السرطانية ملتصقة 1-4 على الشرائح المغلفة مع المصفوفة خارج الخلية (ECM) البروتينات 5-7 أو مع مكونات ECM الفردية، مثل فبرونيكتين أو laminin 1،2. وشملت تقنية البذر تعليق خلية واحدة من الخلايا السرطانية في وسط الآبار باستخدام الفولاذ المقاوم للصدأ الترسيب خلية متعددة (CSM). بعد الترسيب، فإن الخلايا السرطانية الانضمام إلى قاع البئر والتغيير في قطر من السكان الخلية الأولي مع مرور الوقت كانت تستخدم لإقامة معدل الحركة الأفقية. قدم فحص شعاعي الهجرة الخلية أحادي الطبقة ميزة البصرية على الطرق الأخرى القائمة التي يعملون transwell لوحات لفحص القدرات في المختبر من خلايا المهاجرة. هذه المقايسات غير قابلة للتفضي إلى التصوير 8. كذلك، قدمت أيضا قدرا كبيرا من الحرية في اختيار timepointليالي عندما يتم تقييم الهجرة، مع عدم وجود حد لعدد من timepoints الباحث يمكن أن يختار الصورة بعد الترسيب.
لأن القدرة على الهجرة هي وظيفة هامة للخلايا غير ملتصقة، وخاصة في مجال العلاج المناعي أو حيث يمكن أن تستخدم وسائل إيصالها للناقلات فيروسية، ونحن تكييفها استخدام CSM لتقييم هجرة الخلايا غير ملتصقة أنواع على الطبقات الوحيدة الخلية السرطانية، بالإضافة إلى البروتينات ECM. فائدة إضافية تتمثل في تصور مجهريا هجرة الخلايا غير ملتصقة على الطبقات الوحيدة الخلية السرطانية قابلة للحياة، على ECM معقدة معزولة عن الورم، أو على مكونات ECM الفردية يجعل هذا الاختبار تنوعا. لا تعكس المقايسات التي تستخدم الآبار المغلفة مع البروتين خارج الخلية واحد بدقة الركيزة الأنسجة ECM أو ورم أن الخلايا تهاجر من خلال في الجسم الحي.
هنا، كنا alloreactive السامة للخلايا T الليمفاوية (alloCTL)، توعيتهم histocomp الرئيسيةمجمع atibility (MHC) البروتينات باستخدام تفاعلات في اتجاه واحد الخلايا السرطانية اللمفاوية مختلطة (MLTR) أو ردود الفعل اللمفاويات مختلطة (MLR) 9، كما لدينا التمثيلي غير ملتصقة نوع من الخلايا. نحن اختبار خلايا المنشأ البشري والفئران على حد سواء. عندما تم قياس الهجرة على الطبقات الوحيدة الورم، وكانت الخلايا السرطانية يعملون الأهداف ذات الصلة إما جزئيا، وعرض بعض من نفس البروتينات MHC وجدت على السكان الخلية المستخدمة لتوعية المستجيبات، أو الأهداف ذات الصلة بشكل كامل، مع مجموعة كاملة من جزيئات MHC أن تم توعية المستجيبات نحو. في بعض التجارب، وكنا CellTracker الفلورسنت الأحمر CMPTX أو تكاثر الخلايا صبغ eFluor 670 إلى التفريق بين الخلايا المستجيب والهدف. كنا أيضا التنبيغ مع ترميز ناقلات فيروسية لالبروتينات الفلورية وسيلة إضافية لتصور الخلايا. بالنسبة لبعض المقايسات، فإننا transduced في alloCTL مع ناقلات تتكاثر فيروسات (RRV) الترميز لالزمرد الأخضر (EMD) البروتين الفلوري 10،11. لأوراسكوم تليكوم القابضةالمتطلبات البيئية، تم transduced الخلايا السرطانية مع ناقلات lentiviral الترميز لmStrawberry.
تم المصنفة في alloCTL من خلال قناة من مشعب في مركز الورم إما الطبقات الوحيدة الخلية أو ECM تحصد من الطبقات الوحيدة الخلية السرطانية. تم تصور ملتصقة وغير ملتصقة التفاعلات الخلية التي كتبها ضوء و / أو بواسطة المجهر مضان على مر الزمن. كانت اضطراب في أحادي الطبقة الخلية السرطانية في انخفاض القوة، أو ورم الخلايا مع نوى مجزأة في عالية الطاقة مؤشرات إصابة الخلية التي تحلل وموت الخلايا المبرمج، على التوالي. أنشأنا رقميا كثافة سطح خرائط الفلورسنت تبين هجرة الخلايا T الاستشعاع غير ملتصقة على الثقافات أحادي الطبقة. لاحظنا أيضا أفرز السمسة إلى ملتصقة أحادي الطبقة خلية الورم بعد تشكيل مجموعة من alloCTL غير ملتصقة مضافين. كذلك، لوحظ التنبيغ الأفقي للRRV-EMD من alloCTL إلى أحادي الطبقة بالورم.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم pipetted الخلايا السرطانية في تعليق خلية واحدة في الآبار من الشريحة ملثمين تفلون. سمح للخلايا التمسك ومن ثم تشكيل الطبقات الوحيدة في ترطيب 5٪ CO 2، 37 ° C الحاضنة (الشكل 1A). الطبقات الوحيدة التي أنشئت أو البروتينات ECM المستمدة من أحادي الطبقة يمكن أن تحصد لهذ…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بدعم جزئي من المعاهد الوطنية للصحة R01 CA121258، R01 CA125244، R01 CA154256، NIH / NCATS UCLA CTSI غرانت عدد UL1TR000124، USAMRMC W81XWH-08-1-0734، وصندوق جوان S. هولمز التذكاري للبحوث. MJH وبطاقات المعايدة الواردة معتمد من زمالة ما بعد الدكتوراه التذكارية جوان S. هولمز في جامعة كاليفورنيا. تم الحصول على الجهاز CSM من الأساليب العلمية الإبداعية: www.creative-sci.com. وكان في استقبال ناقلات lentiviral من جامعة كاليفورنيا المتجهات الأساسية، الذي تدعمه CURE / P30 DK041301.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Teflon-masked microscope slides | Creative Scientific Methods | CSM002 | |
| Cell Sedimentation Manifold | Creative Scientific Methods | CSM001 | |
| Petri Dish, 150mm | Corning | 430597 | |
| Petri Dish, 35mm | Corning | 430588 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Mediatech | 21-040 | |
| 20 μL Pipetman | Gilson | F123600 | |
| 200 μL Pipetman | Gilson | F123601 | |
| 200 μL pipette tips | VWR | 89003-060 | |
| Distilled, deionized water (sterile) | Mediatech | 25-055 | |
| Trypsin | Mediatech | 25-054-CL | |
| Celltracker Red CMPTX | Invitrogen | C34552 | |
| TrypLE Express (optional) | Gibco | 12604 | |
| Tumor cell culture media (e.g. DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| AIM-V serum-free media | Invitrogen | 12055-083 | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Inverted microscope | |||
| SPOT Advanced | Diagnostic Instruments | ||
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Fibronectin | BD | 354008 | |
| 31/2 x 51/4 Autoclave Pouches | Crosstex | SCXS2 | |
| Trypan Blue | Mediatech | 25-900-CI | |
| Cell Proliferation eFluor 670 | eBioscience | 65-0840-85 | |
| ImageJ | NIH |
Referencias
- Hwang, J. H., Smith, C. A., Salhia, B., Rutka, J. T. The role of fascin in the migration and invasiveness of malignant glioma cells. Neoplasia. 10 (2), 149-159 (2008).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37 (2), 208-215 (2005).
- Berens, M. E., Rief, M. D., Loo, M. A., Giese, A. The role of extracellular matrix in human astrocytoma migration and proliferation studied in a microliter scale assay. Clin Exp Metastasis. 12 (6), 405-415 (1994).
- Osawa, H., Smith, C. A., Ra, Y. S., Kongkham, P., Rutka, J. T. The role of the membrane cytoskeleton cross-linker ezrin in medulloblastoma cells. Neuro-oncology. 11 (4), 381-393 (2009).
- Berens, M. E., Beaudry, C. Radial monolayer cell migration assay. Methods Mol Med. 88, 219-224 (2004).
- Giese, A., Rief, M. D., Loo, M. A., Berens, M. E. Determinants of human astrocytoma migration. Cancer Res. 54 (14), 3897-3904 (1994).
- Vlodavsky, I., Levi, A., Lax, I., Fuks, Z., Schlessinger, J. Induction of cell attachment and morphological differentiation in a pheochromocytoma cell line and embryonal sensory cells by the extracellular matrix. Dev Biol. 93 (2), 285-300 (1982).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Hickey, M. J., et al. Implementing preclinical study findings to protocol design: translational studies with alloreactive CTL for gliomas. Am J Transl Res. 4 (1), 114-126 (2012).
- Tai, C. K., Wang, W. J., Chen, T. C., Kasahara, N. Single-shot, multicycle suicide gene therapy by replication-competent retrovirus vectors achieves long-term survival benefit in experimental glioma. Mol Ther. 12, 842-851 (2005).
- Logg, C. R., Baranick, B. T., Lemp, N. A., Kasahara, N. Adaptive evolution of a tagged chimeric gammaretrovirus: identification of novel cis-acting elements that modulate splicing. J Mol Biol. 369 (5), 1214-1229 (2007).
- Koya, R. C., et al. Kinetic phases of distribution and tumor targeting by T cell receptor engineered lymphocytes inducing robust antitumor responses. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (32), 14286-14291 (2010).
- Zumwalde, N. A., Domae, E., Mescher, M. F., Shimizu, Y. ICAM-1-dependent homotypic aggregates regulate CD8 T cell effector function and differentiation during T cell activation. J Immunol. 191 (7), 3681-3693 (2013).
- Campbell, C. B., Cukierman, E., Artym, V. V. 3-D extracellular matrix from sectioned human tissues. Curr Protocol Cell Biol. 62 (Unit 19), 11-20 (2014).
- Prevention, C. f. D. C. a. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , (2009).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J Cell Biol. 75 (2 Pt 1), 606-616 (1977).
- Alstergren, P., et al. Polarization and directed migration of murine neutrophils is dependent on cell surface expression of CD44. Cell Immunol. 231 (1-2), 146-257 (2004).
- Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J Immunol. 115 (6), 1650-1656 (1975).
- Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis. BMC Immunol. 6 (12), 21 (2005).
- Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurement of chemotactic cell motility. Biotechniques. 31 (5), 1130-1138 (2001).
- Zhang, J. G., et al. Tumor antigen precursor protein profiles of adult and pediatric brain tumors identify potential targets for immunotherapy. J Neuro-oncol. 88, 65-76 (2008).
