Выращивание<em> Heligmosomoides Polygyrus:</em> Иммуномодулирующая нематода Паразит и его секретируемые продукты

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры в этом протоколе осуществляется в соответствии с принципами, изложенными в Соединенном Королевстве внутренних дел и Университета Эдинбурга Ветеринарных служб. 1. Заражение мышей через желудочный зонд Магазин Heligmosomoides polygyrus L3 личинки в дистиллированной воде в течение шести месяцев при 4 ° С. Перед использованием, вымойте L3 личинки три раза в дистиллированной воде: центрифуги при 300 мкг в течение 10 мин (с тормозом), удалить все, кроме 500 мкл воды (чтобы не потревожить гранулированную личинок L3) и ресуспендируют осадок каждый раз. Для третьей промывки, добавить воду к точному объема (обычно 40 мл) и аспирации 20 мкл с 200 мкл разреза наконечника, чтобы расширить свой отверстие. Поместите два 20 мкл образцов на поверхности 60 мм чашки для культивирования и подсчета личинок L3 (обычно мобильный, и лучше всего рассматривать в соответствии с 50-кратном увеличении с препаративным микроскопом). Ресуспендируют осадок в окончательный дистиллированной водой до concentratioп 2000 L3 личинок на мл. Для жизненного цикла продукции, заразить 8-недельных F1 (C57BL / 6xCBA) мышей с 400 H. polygyrus L3 личинки в 200 мкл дистиллированной воды через желудочный зонд (сдерживать мышей в вертикальном положении на загривок и аккуратно пройти тупой через зонд иглу через рот и пищевод в желудок). Перемешивайте тщательно перед каждой инфекции (личинки быстро оседают в воде) и аспирации 200 мкл в 1 мл шприц; использовать выделенный через зонд иглу с закругленным концом. Для экспериментального заражения молодых мышей (6-8 недель), или других инбредных линий (например, C57BL / 6 или BALBc), заразить мышей с 200 L3 личинок. 2. Распространение и обслуживание H. polygyrus Поместите уголь в центре большого пластиковой тубе и позволяют холодной водопроводной воды для запуска над ним в течение как минимум 30 минут (немытые активированный уголь является токсичным для L3 личинок). Слейте воду из ванны и разместить уголь на Т-WO слоев впитывающей бумаги, оставляя его не подвергается воздуха в помещении до полного высыхания. Если яйца не требуется, очистить фекалии First Out толстой кишки с щипцами (и ножницы при необходимости). Если большое количество личинок L3 необходимо, поместить мышей на проволочной сетке и сбора фекальных гранул в течение нескольких дней. Смешайте фекалии гранулированным древесным углем в соотношении по меньшей мере 1: 1, чтобы достигнуть консистенции просто влажной достаточно, чтобы присоединиться к фильтровальной бумагой. Намажьте тонким слоем на центре некоторой влажной фильтровальной бумаге в чашках Петри и разместить во влажной камере (добавить влажное полотенце бумаги и блюдо воды) в темноте в течение 12-14 дней. Удалить L3 личинок из 7 день года, и собрать их, по крайней мере в двух случаях, прежде чем бумага удаляется. Личинки образуют кольцо вокруг края фильтровальной бумаги; поднять фильтровальную бумагу из чашки Петри и промойте личинки, которые остались от пластины (с помощью пипетки и 5 мл стерильной воды в тарелке) в 50 мл пробирку. Лифтот фильтровальную бумагу и собрать оставшиеся личинки оставляют на пластины с дистиллированной водой в 50 мл пробирку. Центрифуга вытекающего раствора при 300 х г в течение 10 мин. Промыть личинок три раза дистиллированной водой, а затем хранить при температуре 4 ° С в срок до 50 мл дистиллированной водой до тех пор, пока требуется. ПРИМЕЧАНИЕ: Личинки остаются жизнеспособными и инфекционный, по крайней мере, 6 месяцев. 3. Сбор взрослых H. polygyrus черви Подготовка модифицированный Baermann Аппарат заранее, как показано на рисунке 1. Cull мышей четырнадцать дней после заражения. Вымойте живота с 70% этанола. Разрежьте кожу на животе и отступить, чтобы показать переднюю брюшную стенку. Сделайте срединный разрез, чтобы войти в брюшную полость. Удалить всю тонкой и толстой кишки (от проксимального двенадцатиперстной кишки дистальной кишки). Поместите в сухое чашке Петри. Выпрямите кишки по всей длине; акцизного кала, содержащего толстой кишки; разместить это в отдельную посуду для яиц препаратов более поздних. Акцизный проксимальных 20 см тонкой кишки, который содержит взрослых червей -identified на относительно толстой стенкой двенадцатиперстной кишки и часто красный цвет, из-за внутри-просвета червей. Поместите в (диаметр 100 мм) чашки Петри с 5 мл раствора Хенкса, нагревают до 37 ° C (два образца на чашку). Откройте червями заполнено проксимального кишечника часть в продольном направлении с ножницами (круглые состава ножницы лучше для этого), и отчищать внутри оболочки кишечника с двумя стеклами, чтобы удалить червей. Тогда отказаться от чистой стенки кишечника. Совет черви в небольших муслин сумки, продуктом закрыты и закрепите скрепки по краям стеклянной воронки (рис 1). Заполните воронку с раствором Хэнкса и добавить около 4 чашек Петри червей в каждой воронке. Место аппарат в 37 ° C инкубаторе в течение 1-2 часов, мягко агитировать на полпути через, чтобы сместитьмусор от подготовки кишечника, которые могут закупоривать марли фильтр. Будьте осторожны, чтобы не высыпался мусора за пределами марли мешок – это может привести к загрязнению конечного препарата ГЭК. Взрослых червей следует медленно мигрировали через ткани марли и решен в нижней части стеклянной пробирке. Осторожно снимите пробирку с соединительной резинового шланга над раковиной (заботясь, чтобы избежать потери червей в этой точке). Использование пластиковой пипетки передачи червей в 50 мл трубки и мыть шесть раз Хэнкса Решение (плюс червей урегулировать под действием силы тяжести, извлекайте носитель с stripette, добавить 40 мл Хэнкса Решение и повторите пять раз). ПРИМЕЧАНИЕ: червь культура должна быть стерильной С этого момента. Перемещение в ламинарном боксе и мыть еще шесть раз в стерильного раствора Хэнкса, дополненной 100 Е / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина, готовый к культуре в пробирке. ГрафВзрослые черви восстанавливается путем два образца 20 мкл, принятых с желтым разреза наконечника, чтобы расширить свою диафрагму; ожидать примерно 50% от количества засеянных личинками. 4. Настройка культур для ГЭК: средний подготовки, стиральная взрослых червей Замачивание червей 3,11 примерно 10 мл RPMI с добавкой 10% гентамицина в течение 20 мин, в результате чего труба отдыхает под углом, чтобы обеспечить черви полностью покрыты. Выполнение этого в ламинарном боксе: мыть раз в шесть раз раствором Хэнкса (с добавлением 5 ед / мл пенициллина и 5 мкг / мл стрептомицина). Подготовка H. polygrus массовой информации. Поддержание стерильности в ламинарном проточном боксе, 500 мл RPMI 1640, добавить 11,1 мл 45% глюкозы (конечная концентрация 1,2%, как RPMI1640, содержит 0,2% глюкозы), 5 мл 100x Peniclllin-стрептомицина (конечная концентрация 5 ед / мл пенициллина, 5 мкг / мл стрептомицина), 5 мл L-глутамина (конечная концентрация 2 мМ), и5 мл гентамицина (конечная концентрация 1%). Не добавляйте FCS. Кратные черви в вентилируемых колбы Т25, ок. 1000 червей в 15 мл H. polygyrus средствах массовой информации в колбе, и место в вертикальном положении в 37 ° C инкубатор (5% СО 2) в течение 3 недель. 5. Получение HES Сбор ГЭС, содержащие питательные среды из культур с интервалом не более чем в два раза в неделю, отложив в сторону свою первую коллекцию после 24 часов культуры (из-за высоких уровней загрязнения ЛПС и белков хозяина – может быть обработана отдельно или отбрасываются). Держите каждую коллекцию отдельным и четко обозначена цифрой даты и партии. Заменить с равным объемом H. polygyrus СМИ в каждом случае. Центрифуга HES-носитель, содержащий по 400 г в течение 5 мин. Затем процедить стерилизации через 0,2 мкм с низким содержанием белка-связывающих фильтров в 50 мл пробирки. Хранить в -20 ° C морозильнике четко обозначены с указанием даты сбора урожая червя и даты ГЭС сollection. После 21 дней сбора ГЭС от культуры, отбросить червей. Бассейн 500-1000 мл ГЭК супернатанта (как правило, из замороженных складе, а не в том числе сбор первых 24 ч) и сосредоточиться над 3000 MWCO фильтр ультрафильтрации устройства под давлением азота. ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте очень осторожны, чтобы не позволить фильтр всухую. Чтобы настроить устройство фильтра, в первую мыть 3 кДа мембраны блестящей стороной вниз в 1 л стакан с дистиллированной водой в течение 3 х 20 мин при перемешивании. Соберите устройства для ультрафильтрации в соответствии с инструкциями изготовителя с мембранного фильтра блестящей стороной вверх. Место в шкафу при 4 ° С и передать 50 мл дистиллированной воды через перед началом сконцентрировать объединенные HES. Добавить каждую пробирку ГЭК в устройство фильтрации в соответствии с требованиями (100-140 мл в день), до тех пор, пока объем концентрируют до 2-5 мл. Для удаления загрязнений из HES-культуральной среде, содержащей, добавить 50 мл Pyrоген свободной PBS, к устройству фильтрации и затем концентрируют до примерно 2 мл. Повторите этот шаг дважды (150 мл PBS в общей сложности). Передача HES в 15 мл пробирку, фильтр стерилизуют (с 0,2 мкм фильтр) в ламинарном боксе и измерения концентрации белка с использованием спектрофотометра (E 280 = 10) или с помощью анализа Брэдфорда. Аликвоты, этикетка с номером партии и датой, и замерзает при температуре -80 ° С. Выполните хромогенную LAL анализа в соответствии с протоколами производителя на каждую партию ГЭС до использования. Если уровни LPS больше, чем 1 U ЛПС на 1 мкг белка, рассматривать не с помощью этой партии для естественных условиях экспериментов в или в культурах пробирке. Процесс ГЭК, собранные через 24 часа по отдельности таким же образом; он будет содержать LPS и некоторые белки и хост, в то время как не подходит для функциональных экспериментов, он является полезным источником индивидуальных молекул, которые могут быть выделены с помощью моноклонального антитела аффинной очистки. </ol>