JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biología del desarrollo

Üç Boyutlu Kültürleri, mıkroRNA Analizi ve Putatif Hedef Genler üzerinde bir İnsan Sinir Kök Hücre Hattı Farklılaşma

Published: April 12, 2015
doi:
10.3791/52410
, ,
1ReNeuron

Summary

With the intent of characterizing changes in miRNAs on differentiated human neural stem cells (hNSCs) we describe hNSC differentiation on a three dimensional system,the evaluation of changes in microRNA expression by miRNA PCR array, and computational analysis for miRNA target prediction and its validation by dual luciferase assay.

Abstract

Nöral kök hücreler (NSC'lerde) Yerel mikroçevrelerde altında nöronlar, astrositler ve oligodendrositler kendini yenileme ve farklılaşma yeteneğine sahiptirler. Burada, şu anda inme sakatlık (NCT01151124 ve NCT02117635, Clinicaltrials.gov) için klinik çalışmalarda, üç boyutlu (3D) farklılaşma ve klonal insan nöral kök hücre (hNSC) hattının miRNA analizi için kullanılan yöntemlerin bir dizi sunuyoruz. HNSCs etik onaylanmış ilk trimester insan fetal korteks türetilen ve koşullu inşa c-mycER TAM tek bir kopyasının retroviral entegrasyonu kullanılarak ölümsüzleştirdi edildi. Biz 3D iskeleler ve nasıl PCR dizi kullanarak miRNA ifade ilişkilendirilmiş değişiklikleri ölçmek için farklılaştırılmış hNSCs akson süreci akıbet ölçmek için nasıl açıklar. Ayrıca biz miRNA varsayılan hedefleri seçme amacıyla hesaplama analiz örnek. SOX5 ve NR4A3 önemli ölçüde seçilen uygun miRNA varsayılan hedef olarak belirlenmiştir aşağı-regülefarklılaşmış hNSC d miRNA'ların. MiRNA hedef doğrulama çift raportör plazmid transfeksiyon ve çift lusiferaz deneyi ile SOX5 ve NR4A3 3'UTRs gerçekleştirilmiştir.

Introduction

Kök hücre araştırmaları da doku mühendisliği, gelişimsel hücre biyolojisi, hücresel tedavilerin, gen terapisi disiplinleri yayılan rejeneratif tıp, merkezi bir rol oynar, ve biyomalzemeler (iskeleleri ve matrisler). Kök hücreler, hem Organ GELİŞTİRME doku onarımında önemli; Kök hücreler nasıl çalıştığını anlamak, yeni kök hücre tabanlı tedaviler 1 geliştirmek için çok önemlidir. CTX0E03 birinci trimester insan fetal korteks izole bir klonal, şartlı ölümsüzleştirdi insan nöral kök hücre (hNSC) hattı 2. CTX0E03 iyi imalat uygulamaları (GMP) 3 altında klinik hücre bankacılığı için gerekli olan kalite özellikleri tanımlamıştır. HNSCs kendiliğinden nöronlar, glia, ve oligodentrositlere ayırt edebilir ve fokal iskemi 2,4,5 bir kemirgen modelinde nakledilen zaman nörolojik iyileştirmek için kanıtlanmıştır. CTX0E03 hNSCs inme disabil için klinik deneylerde şu andaSığ (NCT01151124 6 ve NCT02117635, Clinicaltrials.gov).

MiRNA uzunluğunda ortalama 22 nükleotid bulunacaktır ve düzenleyici moleküller 7 kanıtlanmış, onlar proteinleri kodlamak değil, daha ziyade proteinler onların istikrar ve çeviri düzenleyen, mRNA 3 asal çevrilmemiş bölge (3'UTR) bağlamak. MiRNA'lar geliştirme, proliferasyon ve farklılaşma 8 de dahil olmak üzere, hücresel süreçlerin bir dizi düzenlenmesinde rol bildirilmektedir. Birkaç miRNA'ların nöral kök hücrelerin 9 kaderi ve şartname düzenleyen suçlanmıştır.

Standart kültür ortamı, iki boyutlu (2D) in vivo ortamda karmaşıklığı uyumlu değildir, ve bu nedenle hNSC farklılaşmasının indüksiyonu ve ayarlama optimal değildir. İn vivo koşullarında, hücreler, diğer oluşan bir üç boyutlu (3D) mikro-ortamı tarafından çevrelenmiştir dahil olmak üzere birçok hücre ve hücre-dışı ligandlarkollajenler, laminin, ve diğer matris proteinleri (hücre dışı matris ECM) türleri. Önceki çalışmalar rapor olduğunu ECMs ve onların geometri etkisi, hücre fenotipi ve kader 10-15 taklit malzeme mimari topoğrafyası. Piyasada mevcut 3D iskelelerinin bir dizi vardır; Biz hücreleri istila ve 16-18 ayırt edebilirsiniz içine bir 3D alan sağlayan bir 200 mikron kalınlığında zarı içine iyi tanımlanmış ve düzgün mimarisi ile tasarlanmış bir çok gözenekli polistiren iskelesi kullanılır.

Burada 2D ve 3D farklılaşma deneyleri axonprocess gelişimini değerlendirmek için kullanılır. Ayrıca, daha da farklılaşma üzerinde miRNA etkilerini araştırmak için bir klinik sınıf hNSC hattının miRNA ifade profil bir yöntem açıklanmaktadır. gösterilen burada yöntem orjinal 19 açıklananlara dayanmaktadır.

Protocol

Üç Boyutlu (3D) Kültür 1. HNSC farklılaşması NOT: izole ve bir önceki yayında 2 açıklanan etik onaylanmış dokudan gelen, hNSCs elde. Bu prosedürü takip ederken etik ve kurumsal yönergeleri takip edin. 1.1) 3D Kültür 12-kuyu Plate Kullanımı Prosedür boyunca aseptik tekniği kullanın. Biyolojik güvenlik kabininde / göz% 70 etanol içinde 2 ml ilave etmek suretiyle yeniden hidrat iskeleleri sulama (WFIr) su kullanılarak hazırlanabilir. Her bir duvarı aşağı% 70 etanol dağıtarak iskeleleri dokunmaktan kaçının. Dikkatle% 70 etanol aspire ve hemen 2 ml / DMEM ile iskeleleri yıkayın: 1 dakika F12. Iki kez yıkama işlemi tekrarlayın. Dikkatle DMEM aspire: F12 son yıkamadan sonra. F12: DMEM laminin 2 mi / oyuk (10 ng / ml) ile kaplayın iskeleleri. % 5 CO2 uğultu 37 ° C 'de plaka inkübe2 saat içinde en az idified kuluçka makinesine kondu. Sıcak DMEM ile Plakayı: F12. RMM + GF 150 ul bir hacim içinde, yaklaşık 500,000 hNSCs her iskelesi Seed. Hücre iskeleleri yerleşmeye izin vermek için, bir% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatör içinde 37 ° C'de 3 saat plaka inkübe edin. Iskeleleri hücreleri çıkarmak için değil, her iyi alarak bakım RMM 3.5 ml ekleyin. 7 gün boyunca plaka inkübe; 1 gün (birinci besleme) sonra (3.5 ml / çukur) ve RMM orta yerine tekrar birinci besleme 2-3 gün sonra yapıldı. 7 gün sonra, ortam çıkarın ve immunositokimya (ICC) için% 4 paraformaldehit (PFA) ile hücrelerin saptamak ve / veya iyi bir toplam RNA ekstraksiyonu için, liziz reaktif maddesi 500 ul (≤ -80 ° C'de saklayın levha veya toplam RNA ekstraksiyonu devam) . Akson Süreci kıbet 1.2) ölçümü % 4 PFA standart ICC protokolü 20 kullanılarak β göre farklılaştırılmış hNSCs sabit Leke3-tubulin (TUBB3) bir florokrom konjuge sekonder antikor ile belirlenmiştir birincil antikor. Hoechst (1 uM) ile Counterstain hücre çekirdekleri. Bir floresan mikroskop kullanılarak β3-tubulin lekeli hücrelerin temsili görüntüler yakalayın; tiff veya jpeg olarak kaydedin. Bir yazılım ölçüm aracı (örn Resim-Pro Plus) kullanarak akson süreci akıbet Tedbir. Görüntüyü, araç çubuğunda seçin ölçümler seçeneğini açın ve iz özelliğini seçin. Izlemeyi başlatmak için, fare düğmesini tıklayarak akson akıbet üzerinde başlangıç ​​noktasını belirleyin. Akson büyümesinin tüm uzunluğu boyunca izini; Doğru, her iz bitirmek için tıklayın. Görüş alanındaki tüm akson outgrowthswith ölçmek için tekrarlayın. Piksel veya mikron (beklemede kalibrasyon kurmak) gibi ölçümleri ifade eder. Örnek karşılaştırmalı ve istatistiksel analiz için bir elektronik tablo programı İhracat uzunluğu ölçümleri. 2. Mirna İfade bir Kök Hücreler kullanma veGelişim Yolları Odaklı miRNA PCR Dizisi 2.1) miRNA toplam RNA ekstraksiyon Iskeleleri ve 2D yetiştirilen numuneler üzerinde miRNA çıkarma gerçekleştirin (farklılaşmış ve farklılaşmamış, hNSC kontrolü). Gerekirse Çözülme iskeleleri, 12 plaka takılı. Nihai hacim, liziz reaktif maddesi 1 ml aynı 1.5 ml'lik Eppendorf tüpü içinde 2 kuyu liziz reaktif içeriğini (500 ul) birleştirin. Kuyudaki iskele bırakmak özen gösterin. Daha önce toplanan kuru hücre topaklandı 2D yetiştirilen numuneler (farklılaştırılmış hNSC 2D kültürleri ve farklılaşmamış kontrol) için parçalama reaktifi 1 ml ekleyin ve 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine içeriğini aktarmak. Bir tane 1 ml'lik şırınga ve bir tane kısa 20-25 ölçü iğne kullanılarak, her bir test örneği homojenize edilmiştir. Homojen bir lizat elde edilene kadar, 1 ml 5 kata kadar şırınga kullanılarak bir iğne içinden lizat geçirin. Her bir Eppendorf tüpüne, kloroform ve 200 ul ilave edin ve güvenli bir kap. Invert ve vorteks tüpler içiniçerikleri karıştırmak. Santrifüj ≥12,000 x g'de 15 dakika boyunca her biri 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içeren homojenat. % 100 etanol içinde 750 ul ihtiva eden yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne (herhangi bir interfaz, pembe renkli bir sıvı geçişini engelleyecek) her numunenin üst sulu faz transfer. Tersine çevirerek iyice karıştırın. 2 ml'lik bir toplama tüpü içinde bulunan küçük bir kolon içine, bir çökelti de dahil olmak üzere, her bir test numunesinin 700 ul kadar Pipet. Oda sıcaklığında, yaklaşık 30 saniye boyunca ≥8,000 xg'de kapak ve santrifüj kapatın. Flow-through atın. Numunenin geri kalan kullanarak bu adımı tekrarlayın. 15 dakika boyunca bir DNA özet yapın. ≥8,000 x g'de yaklaşık 30 saniye için küçük bir sütun ve santrifüj 700 ul tampon RWT ekleyin. Flow-through atın. 500 ul tampon RPE eklenmesi ve ≥8,000 x g, yaklaşık 30 saniye için santrifüjleme ile küçük bir sütun yıkayın. Flow-through atın. Tekrar wash.Ce1 dakika boyunca ≥12,000 xg'de ntrifuge ayrıca membran kuru. Mini kolonuna RNaz içermeyen su, 40 ul ilave edilmesi ve ≥8,000 x g, 1 dakika için santrifüjleme ile, 1.5 ml'lik Eppendorf tüpü içinde toplam RNA Zehir. Uygun bir spektrofotometre yardımıyla, total RNA konsantrasyonu ölçümü. 2.2) MiRNA cDNA hazırlanması Ters-transkripsiyon ana karışımı hazırlayın. Her numune 5x miScript Hispec tampon 4 ul, 10x Nucleics karışımı 2 ul gerektirir, 2 ul transkriptaz karışımı ters miScript. PCR tüpü içinde ana karışımı kısım 8 ul toplam RNA (250 ng), gerekli hacmi ekleyin ve 20 ul bir son hacme kadar, RNaz içermeyen su ilave edin. MiScript Ters Transkriptaz Mix inaktive etmek için 95 ° C'de 5 dakika için 37 ° C.Incubate C'de 60 dakika süreyle inkübe edilir. -20 ° C de, her biri 20 ul ters transkripsiyon reaksiyonu deposu 200 ul RNaz içermeyen su ilave, ya da gerçek-ti ile devamBeni hemen PCR. 2.3) Kök Hücreler ve Gelişim Yolları miRNA PCR Array Odaklı 2x SYBR yeşil ana karışımı 1375 ul 100 ul MiRNA cDNA hazırlanmasını 10x miScript Evrensel Primer 275 ul ve RNase-barındırmayan su ile (toplam hacim 2750 ul) 1000 ul ekleyerek 15 ml tüp içinde, PCR parçaları karışımı hazırlayın. PCR yükleme rezervuar üzerinde PCR bileşenleri karışımını aktarın. Dikkatlice kapalı çantasından 96-plaka PCR dizisini kaldırmak. 8 kanallı pipet ya da sadece 8 uçları kullanılarak için 12 kanallı bir pipet kullanılarak, PCR dizisi, her sıra için 25 ul PCR bileşenleri karışımını ekleyin. Kuyular arasındaki çapraz bulaşmayı önlemek için her pipetleme adımı aşağıdaki pipet ipuçlarını değiştirin. Kabarcıklarını çıkarmak için oda sıcaklığında (15-25 ° C) 1,000 xg'de 1 dakika için optik yapışkan film ile plaka ve santrifüj kapatın. Görme kabarcıklar kuyularda mevcut sağlamak için alttan plaka kontrol edin. Gerçek zamanlı döngüleyici içinde 96 çukurlu levha PCR dizisi yerleştirin. Programı buna uygun olarak gerçek zamanlı cycler: 10 dakika ve 95 ° C'de 15 saniye, 45 döngü ve 60 ° C'de 1 dakika boyunca 95 ° C 'de 1 döngü, tek bir (floresans veri toplama) ayarlayın. PCR Dizi Veri Analizi Şablon Excel ve web tabanlı yazılım ile kullanılmak üzere boş bir Excel elektronik tüm kuyuları için Ct değerleri verin. NOT: Yazılım mevcuttur www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php . 3. Hesaplamalı Analiz miRNA Hedef Tahmin ve Hedef mRNA'larının Doğrulama Reporter plazmid Transfaksiyon ve Ddual Lüsiferaz Testi tarafından. 3.1) miRNA Hedef Tahmin Hesaplamalı Analizi Araştır PicTar ( http://pictar.mdc-berlin.de/ ) 21, miR tanımlanması için online bulunabilirlik algoritmaNA tahmin mRNA'ları hedef. "Omurgalılar üzerinde PicTar tahmini için tıklayınız" üzerine tıklayın. Yeni bir sayfa açılacaktır. Yeni sayfa, PicTar web arayüzünde, açılan menüde türleri seçmek ve miRNA Kimlik kutusuna ilgi miRNA yerleştirin. Bir miRNA hedefler için arama tıklayınız. APicTar skoru göre sıralanmış hedef mRNA'ların bir listesini gözlemleyin. NOT: PicTar verilen UTR seçilmiş miRNA tarafından hedeflenen, ve tohum tamamlayıcılık, termodinamik ve birlikte ifade miRNA'lar 22 setleri ortak hedefler için bir birleştirici tahmine dayalı olacağı olasılığını yansıtan bir puan hesaplar. Benzer DIANA-LAB (kullanarak hedef mRNA'ların listesini almak http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/ ) 23, ve TargetScan ( http://www.targetscan.org/ mevcut hat üzerine) 24, alternatif algoritmaları. M karşılaştırmalı tablo DerlemeiRNAs farklı yazılım araçları kullanılarak elde edilen sıralama dayalı. PicTar toplam PCT tarafından ve TargetScan (gürültü oranı ve tahmin sonuçların önemi değerlendirilmesi için bir hassas skoru sinyaline dayalı) hassasiyet ile skoru, DianaLab tarafından rütbeleri (tohum tamamlayıcılık, bağlayıcı termodinamik serbest enerji, koruma üzerinde dayalı Farklı türler), Tablo 1. Muhabir Plazmid Transfaksiyon ve Çift Lusiferaz Testi tarafından hedef mRNA 3.2) Doğrulama. NOT: mRNA olmuştur hedefin doğrulanması için 3 'UTR lusiferaz gazetecilere daha önce 25 nitelendirdi. Transfeksiyon / Oyuk, 24 oyuklu bir plaka içerisinde 10 5 hücre yoğunluğunda Tohum HeLa hücreleri. Transfeksiyon tepkin maddesi ve NR4A3 3 'UTRor SOX5 3' UTR, plazmid, 100 ng ya da 1.5 ul, aynı zamanda, 20 nM MiRNA taklit (SOX5 3 hsa-miR-96-5p ile 24 saat, ko-transfeksiyonu HeLa hücrelerinde sonra217; Oyuk başına UTR ve hsa-miR-7-5p ve sırasıyla NR4A3 3 'UTR için hsa-miR-17-5p). NR4A3 3 'UTRor SOX5 3' UTRplasmid ve florokrom etiketli negatif kontrol siRNA'lar ile birlikte transfekte edilmesi, kontrol kuyuları. florokrom etiketli negatif kontrol siRNA'lara kontrol kuyuları transfeksiyon transfeksiyon verimliliği değerlendirmeyi sağlar ve taklit miRNA 3'UTR bağlama özgüllüğü hesapları. Çift Lusiferaz Faaliyetlerinin Ölçülmesi Firefly ve Renilla lusiferaz faaliyetlerinden 24 saat sonrası transfeksiyon ölçün. Hücre büyüme ortamı çıkarın. 10 Çözüm I ml içine substrat ben 50 ul ekleyerek çözüme I çalışma hazırlayın; iyice karıştırın. Ben de her 24 içine çözüm çalışma 300 ul ekleyin. Iyi bir 96 beyaz plaka 3 kuyuları, her ul 100 içine her 24 içeriğini aktarmak. 10 dakika bekleyin ve ışıldama edinimi için luminometre sette Ateşböceği lusiferazı ölçmek. Çalışma solut hazırlayıniyon II çözeltisi II 10 ml alt-tabaka II 50 ul ekleyerek; iyice karıştırın. Zaten çalışma çözeltisi I 100 ul ihtiva eden her 96 oyuğuna hazır çözelti bir 100 ul ekle 10 dakika bekleyin ve ışıldama edinimi için luminometre seti Renilla lusiferaz ölçmek. Renilla lusiferaz Firefly lusiferaz gelen ışıma oranını hesaplayın.

Representative Results

Şekil 1 geleneksel düz bir yüzey kültürleri (2D) ile karşılaştırıldığında 3D iskelelerde hNSC farklılaşma soruşturma ve miktarının görsel ve akson süreci akıbet ölçümleri expressedas edilir. Şekil 2'de representedthe iş akışı ve kök hücrelerini kullanarak miRNA ölçümü sonuçları ve gelişimsel yollar farklılaşmamış kontrol ile karşılaştırıldığında 2D ve 3D farklılaşmış hNSCs içinde miRNA'lar diferansiyel ifadesini araştırmak için miRNA PCR dizi duruldu. Farklılaşmış ve farklılaşmamış hNSCs ve hedef tahmini, SOX5 ve NR4A3 (NOR1) için hesaplama analiz arasındaki aşağıdaki miRNA karşılaştırmalı analizi, farazi hedef mRNA'lara olarak tespit edilmiştir. MiRNA'lar ve SOX5 veya NR4A3 3'UTR dizisini birini içeren 2 piyasadan temin plazmidler ateş böceği lusiferaz raportör geninin aşağısında eklenen kullanılan 3'UTR mRNA, kendi varsayılan site arasında doğrudan etkileşim incelemek için bir nd normalleştirilmesi için aynı plazmid Renilla lusiferaz geni ihtiva eden. 3 'UTR, lusiferaz aktivitesinin aşağı doğru düzenlenmesi için temsili sonuçlar Şekil 3'te gösterilmiştir. Şekil 1:. 3D iskelelerde hNSCs farklılaşması ve akson sürecin es akıbet ölçümü (A) β3-tubulin (yeşil) ve Hoechst (mavi) temsil mikrofotoğraflarından ile zıt çekirdekleri için standart ICC boyama sonrasında elde edildi ve akson süreçlerinin ölçümü vardı Bir görüntü analizi yazılımı yardımı ile gerçekleştirilir. (B) 1 (1W) veya 3 hafta (3W) için 2D ve 3D farklılaşmış hNSCs yapılan akson süreci akıbet ölçümü raporlama Diyagramları.com / files / ftp_upload / 52.410 / 52410fig1highres.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız. Şekil 2:. Farklılaşmış hNSCs içinde MiRNA profil şematik akışı Toplam RNA, miRNA'ların de dahil olmak üzere, 3 boyutlu iskeleler ve standart 2B kültürleri veya farklılaşmamış kontrolü farklı hNSCs birinden ekstre edilmiştir. Toplam RNA 250 ng retro transkripsiyonu insan hücre farklılaşması ve geliştirme miScript miRNA PCR dizisi ile miRNA ölçümü için uygun cDNA içine olgun miRNA'lar seçici dönüşüm kolaylaştıran bir yöntem vardı. SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A ve RNU6-2 jeo-ortalama 2 -ΔΔct yöntemine dayalı veri analizi için kullanılmıştır. Önemli değişiklikler sta kadar katlayın +/- 1.5 ve aşağı düzenleme olarak tanımlandıistatistiksel olarak anlamlı ölçüde. Veriler clustergram olarak ifade edilmiştir Sonuçlar mevcut web tabanlı yazılım kullanılarak analiz edildi. Şekil 3 19 den Modifiye. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 3: miRNA hedef Doğrulama çift lusiferaz rapor deneyi kullanılarak mRNA öngördü. (A) miRNA doğrudan hedef olarak 3'UTR sekansı doğrulamak için bir araç olarak kullanılabilir çift lusiferaz raportör plasmidinin Örnek diyagramıdır. (B) transfeksiyon verimini gösteren Temsilcisi mikroskobu. (C)   Sinyaller, insan 3 ve # ile ilgili, olan nisbi lusiferaz aktivesi olarak ifade39 UTR muhabirleri ofSOX5 ve NR4A3 genleri önemli ölçüde hsa-miR-96 varlığında yıkıldı ve hsa-miR-7 ve 17 miRNA taklit sırasıyla. Şekil 5 19 den Modifiye. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. DIANALAB PicTar TargetScan miRNA Hedef gen Hedef siteleri / genler bulundu Hassas Gol Agrega P CT hsa-miR-96 SOX5 1214/763 1 6.74 <td> 0.94 hsa-miR-183 DUSP10 302/190 0.72 4.75 0.85 hsa-miR-302a NR4A3 863/473 0.84 3.05 NF hsa-miR-182 FOXN3 1358/794 0.94 NF 0.96 hsa-miR-7 NR4A3 NF NF 1.61 0.17 hsa-miR-7 FOXN3 399/136 0.17 NF 0.88 hsa-miR-20a NR4A3 1650/841 0.85 5.87 0.63 <strong> hsa-miR-20b NR4A3 1955/973 0.9 5.87 0.63 hsa-miR-17 NR4A3 1928/961 0.9 5.38 0.63 + 0.37 hsa-miR-20a EIF4G3 1650/841 0.97 NF NF hsa-miR-20b EIF4G3 1955/973 0.94 NF NF hsa-miR-17 EIF4G3 1928/961 0.94 NF NF Tablo 1: miRNA hedef tahmin mRNA'sından listesi. MiRNA'ların Temsilcisi tablo, öngörü genleri hedef ve algoritmalar analizi (tahminiyon / Skor / agrega sırasıyla Diana Lab, PicTar ve TargetScan kullanılarak sağlanır). Tablo 3 19 den Modifiye.

Discussion

değerlendirmek ve kök hücrelerin farklılaşmasını geliştirmek için in vitro deneylerde yeni gelişme her zaman işlevleri ve terapötik yetenekleri soruşturma için bir meydan okuma sunmuştur. Uzun vadeli ve in vitro farklılaştırma denemesinde sağlam bir 3D gelişimi için gerekli hNSCs istikrarlı eki, malzeme ve yapıların vadede farklı özelliklere sahip birkaç 3D yüzeylerde test hitap etti. Tahlil gelişmenin bir parçası olarak biz de optimum hücre ekim konsantrasyonunu değerlendirildi ve iskeleler laminin kaplı olması gerekliliğini tespit. Bizim hNSCs kendiliğinden üzerine ayırt rağmen standart 2D farklılaşmış hNSCs göre akson işlemi büyümesinin ile ölçüldüğü gibi 4-OHT ve büyüme faktörü kaldırılması, 3B, kültür sisteminin uygulanması farklılaşma kabiliyeti açısından önemli bir gelişme gösterdi.

3D bağlı differe etkisini araştırmak içinhNSC MiRNA ifadesi üzerindeki ntiation bir PCR dizisi kullanılır. Standart çip mikroarray ile karşılaştırıldığında PCR dizi ilgi miRNA doğrudan ölçümü ve doğrulama avantajlar sunuyor. PCR dizisi, 96 burada daha az, örneğin dizi başına miRNA toplam sayısının vadede sınırlı olsa da, daha önce kök hücre gelişme rapor eden durumunda özellikle ilgi miRNA'lar dahil etmek uygun olabilir. yolu odaklı miRNA'lar ifade farklılaşmamış hNSCs ile karşılaştırıldığında 3D ve 2D farklılaşmış hNSCs profilli edildi. En önemli ölçüde aşağı-regüle miRNA'lar seçilmiş ve çevrimiçi mevcut algoritmaları (DIANA Lab, PicTar ve TargetScans) kullanarak işlevselliğini ve biyolojik yorumunu belirlenmesi amacı ile kendi varsayılan hedef mRNA'ları değerlendirmek için analiz edildi.

Tek bir miRNA'ların hedeflerinin yüzlerce kabul edilebilir ve bu nedenle, bir uygun aday olabilir 3 'UTR mRNAsthat ile MiRNA etkileşimleri doğrulanmışxonal düzenleme. NR4A3, HSA miR-7, ve miR-17 ailesinin bir hedef, hipokampal akson farklılaşma, hayatta kalma, apoptoz ve düzenlenmesinde rol olan, ifade düzeylerine bağlı olarak NR4A aile nükleer reseptörlerin bir üyesi olan Rehberlik 26. Benzer SOX5, hsa-miR-96 hedef, sinir atalarıdır 27 akson uzunluğu 28, göç, post-göçmen farklılaşma ve nöronların 29 projeksiyonları hücre döngüsü ilerlemesini kontrol etmek bildirilmiştir. SOX5 ve NR4A3 Hem hsa-miR-96 doğrudan bir hedef mRNA olarak tanımlanan ve çift lusiferaz raportör tahlilleri sırasıyla hsa-miR-7 ve 17 edildi. Çift lusiferaz (Firefly ve Renilla) aynı plazmid iki farklı muhabiri genler dayanır ve optimal transfeksiyon ve tek lusiferaz plazmid sistemi ile karşılaştırıldığında sitotoksik etkileri nedeniyle etkileri normalleşme sağlayan geliştirilmiş bir sistem sunmaktadır. Bizim tahlil gelişmenin bir parçası olarak biz de transfeksiyon conditi optimizesırayla ons yüksek verim elde etmek.

protocolsdescribed bundan başka, en iyi duruma getirmek ve ön klinik çalışmalarda ve gelecekte yapılacak klinik uygulamalarda intransplantation protokolleri beimplemented olabilir, in vitro hNSC farklılaşma karakterize etmek için yararlanılabilir.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz HeLa kültürleme ve transfeksiyon ona teknik destek için hNSCs hazırlanmasında yardımcı olmak için Julie Heward ve Lavaniya Thanabalasundaram kabul.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
DMEM:F12 Invitrogen 21331-020 For RMM medium preparation
Human Albumin Solution  Baxter health care limited  1501052 For RMM medium used at a final concentration of  0.03%
Transferrin, Human recombinant Sigma T8158 For RMM medium used at a final concentration of  5 µg/ml
Putrescine DiHCl  Sigma P5780 For RMM medium used at a final concentration of  16.2 µg/ml
Insulin, Human recombinant   Sigma I9278 For RMM medium used at a final concentration of  5 µg/ml
Progesterone  Sigma P6149 For RMM medium used at a final concentration of  60 ng/ml
L-Glutamine  Invitrogen 25030-24 For RMM medium used at a final concentration of  2 mM
Sodium Selenite   Sigma S9133 For RMM medium used at a final concentration of 40 ng/ml
bFGF      Peprotech AF-100-15 To be added to RMM medium, used at a final concentration of 10 ng/ml
EGF        Peprotech AF-100-188 To be added to RMM medium, used at a final concentration of 20 ng/ml
4-OHT Sigma H7904 To be added to RMM medium, used at a final concentration of 100 nM
Laminin AMS Biotech 3400-010-10
TrypZean/EDTA Lonza  BE02-034E
Water for irrigation Baxter Healthcare UKF7114
Defined Trypsin Inhibitor (DTI) (store -20°C) Invitrogen R007-100
Alvetex 12 well plate  Reinnervate Ltd AVP002
Ethanol  Merck  1.00986.1000
βIII tubulin antibody Sigma T8660
Hoechst Sigma B2261
miRNeasy mini kit Qiagen  217004
RNase free DNase  Qiagen  79254
Chloroform Sigma C7559-5VL
miScript II RT Kit  Qiagen  218160
SYBR green PCR kit Qiagen  218073
Cell Development & Differentiation miScript miRNA PCR Array Qiagen/ SABiosciences MIHS-103Z
Lightcycler 480 white 96 plate Roche  4729692001
Lightcycler 480  sealing foil Roche  4729757001
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027
Vector NR4A3 miRNA 3' UTR target clones  GeneCopeia HmiT019538-MT0
Vector SOX5 miRNA 3' UTR target clones  GeneCopeia HmiT017632-MT01
Allstars negative control siRNA AF 488 (Qiagen). Qiagen  1027284 MiRNA transfection control
Luc-Pair miR Luciferase Assay GeneCopeia LPFR-M010
Lightcycler 480  Roche
GloMax 96 microplate luminometer  Promega
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Falanga, V. Stem cells in tissue repair and regeneration. J Invest Dermatol. 132 (6), 1538-1541 (2012).
  2. Pollock, K., et al. A conditionally immortal clonal stem cell line from human cortical neuroepithelium for the treatment of ischemic stroke. Exp Neurol. 199 (1), 143-155 (2006).
  3. Hodges, H., et al. Making stem cell lines suitable for transplantation. Cell Transplant. 16 (2), 101-115 (2007).
  4. Smith, E. J., et al. Implantation site and lesion topology determine efficacy of a human neural stem cell line in a rat model of chronic stroke. Stem Cells. 30 (4), 785-796 (2012).
  5. Stroemer, P., et al. The neural stem cell line CTX0E03 promotes behavioral recovery and endogenous neurogenesis after experimental stroke in a dose-dependent fashion. Neurorehabil Neural Repair. 23 (9), 895-909 (2009).
  6. Kalladka, D., Muir, K. W. Brain repair: cell therapy in stroke. Stem Cells Cloning. 7, 31-44 (2014).
  7. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  8. Anokye-Danso, F., et al. Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 8 (4), 376-388 (2011).
  9. Li, X., Jin, P. Roles of small regulatory RNAs in determining neuronal identity. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 329-338 (2010).
  10. Badylak, S. F. The extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Semin Cell Dev Biol. 13 (5), 377-383 (2002).
  11. Buxboim, A., Discher, D. E. Stem cells feel the difference. Nat Methods. 7 (9), 695-697 (2010).
  12. Li, W. J., et al. A three-dimensional nanofibrous scaffold for cartilage tissue engineering using human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 26 (6), 599-609 (2005).
  13. Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
  14. Ortinau, S., et al. Effect of 3D-scaffold formation on differentiation and survival in human neural progenitor cells. Biomed Eng Online. 9 (1), 70 (2010).
  15. Saha, K., Pollock, J. F., Schaffer, D. V., Healy, K. E. Designing synthetic materials to control stem cell phenotype. Curr Opin Chem Biol. 11 (4), 381-387 (1016).
  16. Knight, E., Murray, B., Carnachan, R., Przyborski, S. Alvetex(R): polystyrene scaffold technology for routine three dimensional cell culture. Methods Mol Biol. 695, 323-340 (2011).
  17. Bokhari, M., Carnachan, R. J., Przyborski, S. A., Cameron, N. R. Emulsion- templated porous polymers as scaffolds for three dimensional cell culture: effect of synthesis parameters on scaffold formation and homogenity. J. Mater. Chem. 17, 4088-4094 (2007).
  18. Bokhari, M., Carnachan, R. J., Cameron, N. R., Przyborski, S. A. Novel cell culture device enabling three-dimensional cell growth and improved cell function. Biochem Biophys Res Commun. 354 (4), 1095-1100 (2007).
  19. Stevanato, L., Sinden, J. D. The effects of microRNAs on human neural stem cell differentiation in two- and three-dimensional cultures. Stem Cell Res Ther. 5 (2), 49 (2014).
  20. Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number. J Vis Exp. (45), (2010).
  21. Chen, K., Rajewsky, N. Natural selection on human microRNA binding sites inferred from SNP data. Nat Genet. 38 (12), 1452-1456 (2006).
  22. Krek, A., et al. Combinatorial microRNA target predictions. Nat Genet. 37 (5), 495-500 (2005).
  23. Maragkakis, M., et al. Accurate microRNA target prediction correlates with protein repression levels. BMC Bioinformatics. 10, 295 (2009).
  24. Lewis, B. P., Burge, C. B., Bartel, D. P. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets. Cell. 120 (1), 15-20 (2005).
  25. Aldred, S. F., Collins, P., Trinklein, N. Identifying targets of human micrornas with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3’UTR-reporter constructs and a microRNA mimic in adherent cells. J Vis Exp. (55), (2011).
  26. Ponnio, T., Conneely, O. M. nor-1 regulates hippocampal axon guidance, pyramidal cell survival, and seizure susceptibility. Mol Cell Biol. 24 (20), 9070-9078 (2004).
  27. Martinez-Morales, P. L., Quiroga, A. C., Barbas, J. A., Morales, A. V. SOX5 controls cell cycle progression in neural progenitors by interfering with the WNT-beta-catenin pathway. EMBO Rep. 11 (6), 466-472 (2010).
  28. Kwan, K. Y., et al. SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (41), 16021-16026 (2008).
  29. Lai, T., et al. SOX5 controls the sequential generation of distinct corticofugal neuron subtypes. Neuron. 57 (2), 232-247 (2008).

Tags

Human Neural Stem Cells3D CultureDifferentiationMicroRNATarget GenesSOX5NR4A3Axon OutgrowthMiRNA ExpressionComputational AnalysisDual Luciferase Assay

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Stevanato, L., Hicks, C., Sinden, J. D. Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes. J. Vis. Exp. (98), e52410, doi:10.3791/52410 (2015).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image