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Biología del desarrollo

3 차원 문화, 마이크로 RNA의 분석 및 추정 적 표적 유전자에 인간의 신경 줄기 세포 라인의 차별화

Published: April 12, 2015
doi:
10.3791/52410
, ,
1ReNeuron

Summary

With the intent of characterizing changes in miRNAs on differentiated human neural stem cells (hNSCs) we describe hNSC differentiation on a three dimensional system,the evaluation of changes in microRNA expression by miRNA PCR array, and computational analysis for miRNA target prediction and its validation by dual luciferase assay.

Abstract

신경 줄기 세포 (NSCs의)는 특정 지역의 미세 환경에서 신경 세포, 성상 세포 및 희소 돌기 아교 세포로자가 재생과 분화 할 수있다. 여기에서 우리는 현재 스트로크 장애 (NCT01151124과 NCT02117635, Clinicaltrials.gov)에 대한 임상 시험에서, 삼차원 (3D) 분화와 클론 인간 신경 줄기 세포 (hNSC) 라인의 miRNA의 분석에 사용되는 방법의 세트를 제시한다. HNSCs 윤리적 승인 임신 초기 인간 태아의 대뇌 피질에서 파생 된 조건부로 구성 C-mycER TAM의 단일 사본의 레트로 바이러스 통합을 사용하여 불후되었다. 우리는 3 차원 인공 지지체 방법 PCR 배열을 사용하여 miRNA의 발현에 관련된 변화를 정량화하는 방법에 차별화 된 hNSCs의 축삭 공정 부산물을 측정하는 방법에 대해 설명합니다. 또한 우리의 miRNA를 추정 대상을 선택하는 목적으로 전산 분석을 예시. SOX5 및 NR4A3 크게 선택의 적합 miRNA의 추정 대상으로 확인되었다 하향 조절차별화 된 hNSC에서 D의 miRNA. miRNA의 대상 유효성 검사 듀얼 기자 플라스미드 형질 전환 및 듀얼 루시페라아제 분석에 의해 SOX5과 NR4A3 3'UTRs 실시 하였다.

Introduction

줄기 세포 연구는 조직 공학, 발달 세포 생물학, 세포 치료제, 유전자 치료 분야에 걸쳐 재생 의료에서​​ 중심적인 역할을하고, 바이오 물질 (지지체와 매트릭스). 줄기 세포는 모두 developmentand 장기의 조직 복구에 중요하다; 줄기 세포가 어떻게 작동하는지 이해하는 새로운 줄기 세포 기반 치료 (1) 개발을위한 중추적입니다. CTX0E03 먼저 임신 인간 태아의 대뇌 피질에서 분리 된 클론, 조건부 불후의 인간 신경 줄기 세포 (hNSC) 줄입니다. CTX0E03 좋은 제조 기준 (GMP) 3에서 임상 세포 은행에 필수적인 품질 특성을 정의했습니다. HNSCs 자발적 신경 아교 세포 및 희소 돌기 아교 세포로 분화 할 수 있으며 국소 허혈 2,4,5의 쥐 모델에 이식 할 때 신경 학적 결손을 개선하기 위해 입증되었습니다. CTX0E03 hNSCs 뇌졸중 장애인들에 대한 임상 시험에서 현재성만 (NCT01151124 6 NCT02117635, Clinicaltrials.gov).

miRNAs의 길이는 평균 22 개 뉴클레오티드를 가지며 분자 규제 7 입증 이들은 단백질을 인코딩하지 않고, 단백질로 번역 안정성 및 조절, mRNA를 3 프라임 번역 영역 (3'UTR)를 결합한다. 개발의 miRNAs는, 증식 및 분화를 포함하여 8 세포 프로세스의 개수의 조절에 참여하는 것으로보고되고있다. 몇몇의 miRNAs는 신경줄 기세포 (9)의 거동 및 명세서 조절에 연루되어왔다.

표준 배양 환경 이차원 (2D)에서 생체 내 환경의 복잡성이 일치하지 않고, 따라서 hNSC 분화 유도 및 조절은 최적이 아니다. 생체 내에서, 세포는 다른 작곡 삼차원 (3D) 미세 둘러싸여 많은을 포함하여 세포와 세포 외 리간드,콜라겐, 라미닌, 기타 기질 단백질 (세포 외 기질, ECM)의 유형. 이전의 연구보고 한 그 ECM의 자신의 형상에 영향을 미치는 세포 표현형과 운명 10 ~ 15을 흉내 낸 재료의 건축 지형. 시중에서 판매하는 3 차원 인공 지지체의 숫자는 사용할 수 있습니다; 우리는 세포가 침입 16-18을 차별화 할 수있는에 3D 공간을 제공하는 200 μm의 두께 막에 잘 정의 된 균일 한 구조로 설계 다공성 폴리스티렌 발판을 사용했다.

여기에서 2D 및 3D 분화 분석은 axonprocess 파생물을 평가하는 데 사용됩니다. 더욱이, 우리는 또한 그것의 분화 된 miRNA에 미치는 영향을 조사하는 임상 등급 hNSC 라인의 miRNA 발현 프로파일 링 방법을 서술. 여기에 도시 된 방법은 원래 19에 기재된 것들에 기초한다.

Protocol

3 차원 (3D) 문화 1. HNSC 차별화 참고 : 분리 및 이전 간행물 2에 설명 된 윤리적 승인 된 조직에서, hNSCs을 유도. 이 절차를 수행하는 동안 윤리 및 제도적 지침을 따르십시오. 1.1) 3D 문화는 12 웰 플레이트를 사용하여 절차 전반에 걸쳐 무균 기술을 사용합니다. 생물 안전 캐비닛에서 / 웰 70 % 에탄올 2 ㎖를 추가하여 다시 수화물 골격은 관개 (WFIR) 물을 사용하여 제조. 물론 각각의 벽 아래로 70 % 에탄올을 분배하여 발판을 만지지 마십시오. 조심스럽게 70 % 에탄올을 대기음 즉시 2 ㎖ / 잘 DMEM으로 발판을 씻어 : 1 분 동안 F12. 두 번 세척 절차를 반복합니다. 조심스럽게 DME​​M을 대기음 : F12을 최종 세척 후. F12을 : DMEM에 라미닌 2 ㎖ / 웰 (10 ㎍ / ㎖)에 추가하여 코트 비계. 5 % CO 2 험에서 37 ° C에서 접시를 품어2 시간 이상 동안 인큐베이터 idified. 따뜻한 DMEM 씻을 플레이트 : F12. RMM + GF의 150 μL의 볼륨에 약 50 만 hNSCs 각 발판을 시드. 세포가 지지체에 정착 할 수 있도록 5 % CO 2에서 가습 인큐베이터에서 37 ° C에서 3 시간 동안 플레이트를 인큐베이션. 비계에서 세포를 꺼 내려하지 각각의 잘 돌보는에 RMM의 3.5 ML을 추가합니다. 7 일간 판을 품어; 일일 (제 1 급) 후 (3.5 ㎖ / 잘)과 RMM 매체를 대체 다시 제 1 급전 2 ~ 3 차례 일 후. 칠일 후 매체 제거하고 면역 세포 화학 (ICC)에 대한 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)와 세포를 수정하거나 / 웰 총 RNA 추출을위한 용해 시약 500 μL 추가 (≤ -80 ° C에서 저장 판 또는 총 RNA 추출로 진행) . 축삭 프로세스 파생물 1.2) 측정 4 % PFA는 표준 ICC 프로토콜 (20) 사용하여 β에 따라 차별화 된 hNSCs 고정 얼룩3 튜 불린 (TUBB3) 형광 색소 결합 된 이차 항체 검출 차 항체. 훽스트 (1 μM)와 Counterstain과 세포 핵. 형광 현미경을 사용하여 β3-tubulin에 염색 된 세포의 대표 이미지를 캡처; TIFF 나 JPEG 등의 이미지를 저장합니다. 소프트웨어 측정 도구 (예를 들어, 이미지 – 프로 플러스)를 이용하여 프로세스 축삭 생장의 측정. 이미지 도구 모음에서 선택 측정 옵션을 열고 추적 기능을 선택합니다. 추적을 시작하려면, 마우스 버튼을 클릭하여 축삭 가지의 시작점을 선택합니다. 축삭 가지의 전체 길이를 따라 추적; 오른쪽 각각의 추적을 완료합니다. 보기의 필드의 모든 축삭 outgrowthswith을 측정하기 위해 반복합니다. 픽셀 μm의 (대기 보정 설정)으로 측정을 표현한다. 샘플 비교 및​​ 통계 분석을 위해 스프레드 시트 프로그램에 내보내기 길이 측정. 2. miRNA의 발현 줄기 세포를 사용하고발달 진학 집중 miRNA의 PCR 배열 2.1) miRNA의 총 RNA 추출 비계 및 2D 성장 샘플에 miRNA의 추출을 수행합니다 (분화 및 분화, hNSC 제어). 필요한 경우 해동 발판은, 12 웰 플레이트에 삽입. 최종 용적 용균 시약 1 ㎖, 1.5 ㎖의 에펜 도르프 동일한 튜브에서 2 웰의 세포 용해 시약 내용 (500 μL)를 결합한다. 잘 발판을 남겨주의하십시오. 이전에 수집 된 건조 세포 펠렛 2D 성장 샘플 (차별화 된 hNSC 차원의 문화와 미분화 제어)의 경우 용해 시약 1 ㎖를 추가하고 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 내용을 전송합니다. 1ml의 주사기 짧은 20-25 게이지 바늘을 사용하여 각 시험 시료 균질화. 균일 한 해물을 얻을 때까지 1 ml를 최대 5 번까지 주사기 사용 바늘을 통해 해물을 전달합니다. 각 에펜 도르프 튜브에 클로로포름 200 μl를 추가하고 안전하게 모자. 반전과 소용돌이 튜브에내용을 섞는다. 원심 분리기 ≥12,000 x g에서 15 분 동안 각 1.5 ml의 microcentrifuge 관 포함 균질. 100 % 에탄올 750 μL를 함유하는 신선한 1.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브 (있는 계면, 핑크 색 액체 묻지 않도록) 각 시료의 상부 수성 상을 전송. 반전에 의해 철저하게 섞는다. 2 ml의 수집 튜브 내의 미니 컬럼에, 임의의 침전물을 각각 포함하는 시험 샘플을 700 μL, 최대 피펫. 실온에서 약 30 초 동안 ≥8,000 XG에서 뚜껑과 원심 분리기를 닫습니다. 흐름을 통해 폐기하십시오. 샘플의 나머지 부분을 사용하여이 단계를 반복합니다. 15 분 동안 DNA 다이제스트를 수행합니다. ≥8,000 × g으로 약 30 초 동안 미니 열 및 원심 분리기 700 μL 버퍼 RWT를 추가합니다. 흐름을 통해 폐기하십시오. 500 μL 버퍼 RPE를 추가하고 ≥8,000 × g으로 약 30 초 동안 원심 분리하여 미니 열을 씻으십시오. 흐름을 통해 폐기하십시오. 반복 wash.Ce1 분 ≥12,000 XG에 ntrifuge 더 막을 건조. 미니 컬럼의 RNase가없는 물 40 μl를 첨가하고 ≥8,000 × g으로 1 분간 원심 분리하여 1.5 ml의 에펜 도르프 튜브에서 총 RNA를 용출시켰다. 적절한 분광 광도계의 도움으로 전체 RNA의 농도를 측정한다. 2.2) miRNA의 cDNA를 준비 역 전사 마스터 믹스를 준비합니다. 각 샘플은 5 배 miScript HiSpec 버퍼 4 μL, 10 배 nucleics 믹스 2 μl를 요구, 2 μl의 효소 믹스를 역 miScript. PCR 튜브에서 마스터 믹스 우스 8 μl의 총 RNA (250 NG)의 필요한 양을 추가하고, 20 μL의 최종 부피의 RNase가없는 물을 첨가 하였다. miScript 역전사 효소 믹스를 불 활성화하기 위해 95 ° C에서 5 분 동안 37 ° C.Incubate에서 60 분 동안 품어. -20 ° C에서 각각 20 μL 역전사 반응에 매장을 200 μL의 RNA 분해 효소가없는 물을 추가, 또는 실제 TI 진행나 바로 PCR. 2.3) 줄기 세포 및 발달 진학 miRNA의 PCR 배열 집중 배 SYBR 녹색 마스터 믹스 1375 μL, 100 μL miRNA의 cDNA를 준비, 10 배 miScript 유니버셜 프라이머의 275 μL와의 RNase없는 물 (총 부피 2,750 μL) 1000 μl를 추가하여 15 ML 튜브에 PCR 구성 요소 믹스를 준비합니다. PCR 로딩 저수지에 PCR 구성 요소 믹스를 전송합니다. 조심스럽게 밀봉 백에서 96 웰 플레이트 PCR 배열을 제거합니다. 8- 채널 피펫 또는 단지 8 팁을 사용하여 12- 채널 피펫을 사용하여 PCR 어레이의 각 웰에 25 ㎕의 PCR 혼합물 성분을 추가한다. 우물 사이의 교차 오염을 방지하기 위해 각 피펫 팅 단계 다음 피펫 팁을 변경합니다. 거품을 제거하기 위해 실내 온도 (15-25 ° C에서) 1,000 XG에서 1 분 동안 광학 접착 필름과 접시, 원심 분리기를 밀봉합니다. 시각적으로 기포가 우물에 존재하지 않는 확인하기 위해 아래에서 접시를 검사합니다. 실시간 자전거 타는 사람의 96 웰 플레이트 PCR 배열을 놓습니다. 프로그램 따라서 실시간 클러 : 10 분, 95 ° C에서 15 초간 45 사이클, 그리고 60 ℃에서 1 분 동안 95 ° C에서 1 사이클은 단일 (형광 데이터 수집)를 설정한다. PCR 어레이 데이터 분석 템플릿 Excel 및 웹 기반 소프트웨어와 함께 사용하기위한 빈 Excel 스프레드 시트에 대한 모든 우물의 코네티컷 값을 내 보냅니다. 참고 : 소프트웨어에서 확인할 수있다 www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php . 3. 전산 분석 miRNA의 대상 예측 및 목표의 mRNA의 검증 리포터 플라스미드 형질과 Ddual 루시 페라 제 분석으로. 3.1) miRNA의 대상 예측을위한 전산 분석 검색 PicTar ( http://pictar.mdc-berlin.de/ ) 21 미르의 식별을 위해 온라인으로 제공 알고리즘NA는 예측의 mRNA를 대상으로. "척추 동물에 PicTar 예측 보려면 여기를 클릭"을 클릭합니다. 새 페이지가 열립니다. 새 페이지, PicTar 웹 인터페이스에서, 드롭 다운 메뉴에서 종을 선택하고 miRNA의 ID 상자에 관심의 miRNA를 삽입합니다. miRNA의의 대상에 대해 검색을 클릭합니다. aPicTar 점수에 의해 평가 대상의 mRNA의 목록을 관찰합니다. 주 : PicTar 주어진 UTR 선택된 miRNA의 표적, 및 시드 상보성, 열역학 및 공동 (22)의 miRNA 발현의 세트에서 모든 표적에 대한 조합을 기반으로 예측 될 가능성을 반영하는 스코어를 계산한다. 마찬가지로 DIANA-LAB (사용 대상의 mRNA의 목록을 검색 http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/ ) (23), 및 TargetScan ( http://www.targetscan.org/ 사용 가능한 회선에) 24, 대안을 알고리즘. m의 비교 테이블을 컴파일iRNAs 다양한 소프트웨어 툴을 사용하여 수득 된 순위에 기초하여. PicTar 집계 PCT에 의해, 그리고 TargetScan (잡음비 및 예측 된 결과의 중요성을 평가하기위한 정밀한 점수 신호에 기초하여) 정밀도에 점수 DianaLab 의해 순위 (시드 상보성 결합 자유 에너지 보존 위에에게에 기초 다른 종), 표 1을 참조하십시오. 리포터 플라스미드 형질 및 듀얼 루시 페라 제 분석하여 대상의 mRNA 3.2) 검증. 참고 : mRNA를하고있다 목표의 검증을위한 3 'UTR 루시 페라 제 기자는 이전 25 설명했다. 형질 / 웰로 24- 웰 플레이트에 105 세포의 밀도로 시드 HeLa 세포. 형질 전환 시약 및 NR4A3 3 'UTRor SOX5 3'UTR 플라스미드 100 NG 하나의 1.5 μL뿐만 아니라, 20 nM의 miRNA의 모방 (SOX5 3 HSA-은 miR-96-5p 24 시간, 공동 트랜 헬라 세포 후(217); 물론 당 UTR 및 HSA-은 miR-7-5p, 각각 NR4A3 3 'UTR을위한 HSA-은 miR-17-5p). NR4A3 3 'UTRor SOX5 3'UTRplasmid 및 형광 색소 표시 음성 대조군 siRNA를와 공동 트랜 제어 우물. 형광 색소 표시 음성 대조군 siRNA를 함께 제어 우물의 형질 전환은 형질 전환 효율의 평가를 허용하고 모방 miRNA의 3'UTR 바인드 특이성를 차지한다. 듀얼 루시 페라 제 활동의 측정 반딧불과 레 닐라 루시퍼 활동 24 시간 게시물 형질을 측정합니다. 세포 성장 매체를 제거합니다. 용액 10 ml의 I로 기재 I의 50 μl를 첨가하여 용액을 준비 작업 I; 잘 혼합. 내가 잘 각각 24로 작업 액의 300 μl를 추가합니다. 물론 96 흰색 접시의 3 우물, 각 μL (100)에 각 24의 내용을 전송합니다. 10 분을 기다린 발광 획득을위한 루미 세트에 반딧불 루시 페라을 측정한다. 작업 오디오 솔루션을 준비이온 II 솔루션 II 10 ㎖로 기판 II의 50 μl를 추가하여; 잘 혼합. 이미 작업 솔루션 I의 100 μl를 포함하는 각 96 우물에 작업 솔루션 I의 100 μl를 추가 10 분을 기다린 발광 획득을위한 루미 세트에 레 닐라 루시퍼을 측정한다. 레 닐라 루시퍼에 반딧불 루시 페라에서 발광의 비율을 계산합니다.

Representative Results

그림 1에서 전통적인 평면 문화 (2D)에 비해 3 차원 인공 지지체에 hNSC 차별화의 조사 및 정량을 시각화하고 축삭 프로세스 가지 측정을 expressedas된다. 도 2에서 representedthe 흐름 및 줄기 세포를 이용하여 miRNA의 정량화 결과이며 발달 경로 미분화 대조군과 비교 2D 및 3D 차별화 hNSCs에서의 miRNA 발현의 차이를 조사하기 위해 PCR miRNA의 배열을 집중. 차별화되고 미분화 hNSCs 및 목표 예측, SOX5 및 NR4A3 (NOR1)에 대한 전산 분석과 다음 miRNA의 비교 분석은 추정 대상의 mRNA로 확인되었다. miRNA가 우리가 SOX5 또는 NR4A3 3'UTR 시퀀스를 포함하는 2 상업적으로 이용 가능한 플라스미드 반딧불이 루시퍼 라제 리포터 유전자의 하류에 삽입 사용 3'UTR의 mRNA에 자신의 추정 위치 사이의 직접적인 상호 작용을 연구하는 ND 정상화 동일한 플라스미드 레 닐라 루시퍼 라제 유전자에 함유. 3 'UTR 루시 페라 제 활동 하향 조절의 대표적인 결과는 그림 3에 제시되어있다. 그림 1 :. 3 차원 인공 지지체에 hNSCs의 분화 및 축삭 과정 ES 가지의 측정 (A) β3-tubulin의 (녹색)과 훽스트 (파란색) 대표 현미경 사진으로 대조 핵에 대한 표준 ICC 염색에 따라 취득하고 축삭 프로세스의 측정했다 이미지 분석 소프트웨어의 도움으로 수행 하였다. (B) 1 (1W) 또는 3주 (3W)에 대해 차별화 된 2D 및 3D hNSCs 수행 축삭 프로세스 생장의 측정을보고하는 다이어그램.COM / 파일 / ftp_upload / 52410 / 52410fig1highres.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2 :. 차별화 된 hNSCs에서 miRNA의 프로파일 링의 도식 워크 플로우 총 RNA, miRNA에 포함하여, 3 차원 지지체 및 표준 2D 문화, 또는 분화 제어에 차별화 된 hNSCs 하나에서 추출 하였다. 총 RNA 250 NG 복고 전사 인간의 세포 분화 및 개발 miScript의 miRNA PCR 어레이와의 miRNA 정량에 적합한의 cDNA로 성숙의 miRNA의 선택적 전환을 용이하게하는 방법이었다. SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A 및 RNU6-2의 지리적 평균 -ΔΔct이 방법에 따른 데이터 분석에 이용 하였다. 중요한 변화는 역으로 접어 +/- 1.5 아래 규제로 정의 하였다tistically 상당한 정도. 데이터는 clustergram로 표현 가능한 결과를 웹 기반 소프트웨어를 사용하여 분석 하였다. 그림 3 (19)에서 수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 3 : miRNA의 대상 유효성 검사는 듀얼 루시 페라 보고서 분석을 이용하여 mRNA의 예측. (A)의 miRNA의 직접적인 대상으로 3'UTR 서열을 확인하는 툴로서 사용 듀얼 루시퍼 라제 리포터 플라스미드의 대표적인 다이어그램. (B) 트랜 스펙 션 효율을 나타내는 대표 현미경 사진. (C)   신호들은 인간 및 # 3에서, 상대적인 루시페라아제 활성으로 표현39; UTR 기자 ofSOX5 및 NR4A3 유전자는 크게 HSA-은 miR-96의 존재에 무너 뜨렸다하고, HSA-은 miR-7과 17의 miRNA 모방은 각각. 그림 5 (19)에서 수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. DIANALAB PicTar TargetScan miRNA의 표적 유전자 표적 부위는 / 유전자 발견 정확 점수 집계 P CT HSA-은 miR-96 SOX5 763분의 1,214 (1) 6.74 <td> 0.94 HSA-은 miR-183 DUSP10 190분의 302 0.72 4.75 0.85 HSA-은 miR-302A NR4A3 473분의 863 0.84 3.05 NF HSA-은 miR-182 FOXN3 794분의 1,358 0.94 NF 0.96 HSA-은 miR-7 NR4A3 NF NF 1.61 0.17 HSA-은 miR-7 FOXN3 136분의 399 0.17 NF 0.88 HSA-은 miR-20A NR4A3 841분의 1,650 0.85 5.87 0.63 <strong> HSA-은 miR-20B NR4A3 973분의 1,955 0.9 5.87 0.63 HSA-은 miR-17 NR4A3 961분의 1,928 0.9 5.38 0.63 + 0.37 HSA-은 miR-20A EIF4G3 841분의 1,650 0.97 NF NF HSA-은 miR-20B EIF4G3 973분의 1,955 0.94 NF NF HSA-은 miR-17 EIF4G3 961분의 1,928 0.94 NF NF 표 1 : miRNA의 표적 예측의 mRNA의 목록. miRNAs의 대표 테이블이, 예측 유전자를 표적으로하고, 분석 알고리즘 (예측이온 / 점수 / 총 각각 다이애나 연구소, PicTar 및 TargetScan를 사용하는 경우). 표 3 (19)에서 수정.

Discussion

평가 및 줄기 세포의 분화를 향상시키기 시험관 내 분석의 새로운 개발은 항상 기능 및 치료 기능 연구를 위해 도전을 제시하고있다. 장기 및 체외 분화 분석에서 강력한 3D의 발전에 필요한 hNSCs 안정 첨부, 재료 및 구조 용어 특성이 다른 여러 3D 기판을 테스트함으로써 해결 하였다. 분석 개발의 일환으로 우리는 또한 최적의 세포 시딩 농도를 평가하고 비계가 라미닌이 코팅하기위한 요구 사항을 확인했다. 우리 hNSCs 저절로 따라 차별화 할 수 있지만 표준 2D 분화 hNSCs 비교할 때 축삭 프로세스 생장 의해 측정 4-OHT 및 성장 인자 제거, 3 차원 배양 시스템의 구현은 분화 능력에 상당한 개선을 보였다.

3D 유도 differe의 효과를 알아보고자hNSC의 miRNA 발현에 ntiation 우리는 PCR 배열을 사용했다. 표준 마이크로 어레이 칩과 비교하여 PCR 어레이는 관심의 miRNA의 직접적인 정량 및 유효성의 이점을 제공한다. PCR 어레이 (96)보다 여기 이하에 예를 들면 어레이 당 miRNA의 전체 수의 용어로 한정되어 있지만, 이는 앞서 줄기 세포 발달에보고 우리의 경우, 특히 관심의 miRNAs를 포함하도록 맞추어 질 수있다. 경로에 초점을 맞추고있는 miRNA의 발현은 미분화 hNSCs에 비해 3D 및 2D 차별화 hNSCs에 등장했다. 가장 현저히 하향 조절의 miRNAs는 선택 가능한 온라인 알고리즘 (DIANA 랩 PicTar 및 TargetScans)를 사용하여 그들의 기능 및 생물학적 해석을 결정하는 그들의 의도로 추정 대상의 mRNA를 평가하기 위해 분석 하였다.

하나의 miRNA는 목표의 수백을 인식 할 수있는 이런 이유로 우리는에 적합한 후보가 될 수있다 3 'UTR mRNAsthat와 miRNA의 상호 작용을 검증xonal 규제. NR4A3, HSA-은 miR-7, 미르-17 가족의 목표는 해마 축색 돌기의 분화, 생존, 세포 사멸 및 규제에 참여, 표현의 수준에 따라 NR4A 가족 핵 수용체의 구성원 인 안내 (26). 마찬가지로 SOX5, HSA-은 miR-96의 타겟은, 신경 전구 세포 (27)의 길이 엑손 28, 이주 후 이동성 분화, 및 신경 돌기 (29)의 세포주기 진행을 조절하는 것으로보고되어있다. SOX5 및 NR4A3 모두 HSA-은 miR-96의 직접적인 대상 mRNA의 식별 및 듀얼 루시페라아제 기자 분석하여 각각 HSA-은 miR-7, 17되었다. 듀얼 루시퍼 라제 (개똥 벌레 및 레 닐라)은 동일한 두 개의 서로 다른 플라스미드에 리포터 유전자에 의존하고 차선 형질 번의 루시페라아제 플라스미드 시스템과 비교하여 세포 독성 효과에 의한 영향에 대한 정규화를 허용하는 개선 된 시스템을 제공한다. 우리의 분석 개발의 일환으로 우리는 또한 우리의 형질 컨디셔닝을 최적화순서 기능은 높은 효율을 얻을 수있다.

protocolsdescribed은 여기에 더 최적화 및 전임상 연구와 미래의 임상 응용 프로그램에 대한 intransplantation 프로토콜을 beimplemented 수 있습니다 체외 hNSC 분화의 특성을 악용 할 수 있습니다.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 헬라 배양 및 형질을 가진 그녀의 기술 지원을 hNSCs의 준비를 도와 줄리 Heward 및 Lavaniya Thanabalasundaram을 인정합니다.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
DMEM:F12 Invitrogen 21331-020 For RMM medium preparation
Human Albumin Solution  Baxter health care limited  1501052 For RMM medium used at a final concentration of  0.03%
Transferrin, Human recombinant Sigma T8158 For RMM medium used at a final concentration of  5 µg/ml
Putrescine DiHCl  Sigma P5780 For RMM medium used at a final concentration of  16.2 µg/ml
Insulin, Human recombinant   Sigma I9278 For RMM medium used at a final concentration of  5 µg/ml
Progesterone  Sigma P6149 For RMM medium used at a final concentration of  60 ng/ml
L-Glutamine  Invitrogen 25030-24 For RMM medium used at a final concentration of  2 mM
Sodium Selenite   Sigma S9133 For RMM medium used at a final concentration of 40 ng/ml
bFGF      Peprotech AF-100-15 To be added to RMM medium, used at a final concentration of 10 ng/ml
EGF        Peprotech AF-100-188 To be added to RMM medium, used at a final concentration of 20 ng/ml
4-OHT Sigma H7904 To be added to RMM medium, used at a final concentration of 100 nM
Laminin AMS Biotech 3400-010-10
TrypZean/EDTA Lonza  BE02-034E
Water for irrigation Baxter Healthcare UKF7114
Defined Trypsin Inhibitor (DTI) (store -20°C) Invitrogen R007-100
Alvetex 12 well plate  Reinnervate Ltd AVP002
Ethanol  Merck  1.00986.1000
βIII tubulin antibody Sigma T8660
Hoechst Sigma B2261
miRNeasy mini kit Qiagen  217004
RNase free DNase  Qiagen  79254
Chloroform Sigma C7559-5VL
miScript II RT Kit  Qiagen  218160
SYBR green PCR kit Qiagen  218073
Cell Development & Differentiation miScript miRNA PCR Array Qiagen/ SABiosciences MIHS-103Z
Lightcycler 480 white 96 plate Roche  4729692001
Lightcycler 480  sealing foil Roche  4729757001
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027
Vector NR4A3 miRNA 3' UTR target clones  GeneCopeia HmiT019538-MT0
Vector SOX5 miRNA 3' UTR target clones  GeneCopeia HmiT017632-MT01
Allstars negative control siRNA AF 488 (Qiagen). Qiagen  1027284 MiRNA transfection control
Luc-Pair miR Luciferase Assay GeneCopeia LPFR-M010
Lightcycler 480  Roche
GloMax 96 microplate luminometer  Promega
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Referencias

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Stevanato, L., Hicks, C., Sinden, J. D. Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes. J. Vis. Exp. (98), e52410, doi:10.3791/52410 (2015).
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