JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biología del desarrollo

Differentiatie van een menselijke neurale stamcellen Line op Three Dimensional Culturen, Analyse van MicroRNA en vermeende doelwit-genen

Published: April 12, 2015
doi:
10.3791/52410
, ,
1ReNeuron

Summary

With the intent of characterizing changes in miRNAs on differentiated human neural stem cells (hNSCs) we describe hNSC differentiation on a three dimensional system,the evaluation of changes in microRNA expression by miRNA PCR array, and computational analysis for miRNA target prediction and its validation by dual luciferase assay.

Abstract

Neurale stamcellen (NSC) in staat zijn zelf-vernieuwing en differentiatie in neuronen, astrocyten en oligodendrocyten onder specifieke lokale micro-omgevingen. In hier, presenteren we een set van methoden die worden gebruikt voor het driedimensionaal (3D) differentiatie en miRNA analyse van een klonale menselijke neurale stamcellen (hNSC) lijn, die momenteel in klinische studies voor een beroerte handicap (NCT01151124 en NCT02117635, Clinicaltrials.gov). HNSCs werden afgeleid van een ethisch goedgekeurd eerste trimester foetale cortex en voorwaardelijk onsterfelijk gemaakt met behulp van retrovirale integratie van een enkele kopie van de c-mycER TAM construeren. We beschrijven hoe axon proces uitgroei van hNSCs gedifferentieerd 3D steigers en hoe daarmee samenhangende veranderingen in miRNA expressie met behulp van PCR-array kwantificeren meten. Verder illustreren wij computeranalyse teneinde miRNA selecteren vermeende doelen. SOX5 en NR4A3 werden aangeduid als geschikt miRNA vermeende doelwit van aanzienlijk geselecteerde downregulerend miRNAs in gedifferentieerde hNSC. Mirna targetvalidatie werd uitgevoerd op SOX5 en NR4A3 3'UTRs door dual reporter plasmide transfectie en dual luciferasetest.

Introduction

Stamcelonderzoek speelt een centrale rol in de regeneratieve geneeskunde, die ook overspant de disciplines van tissue engineering, ontwikkelingsstoornissen celbiologie, cellulaire therapieën, gentherapie, en biomaterialen (steigers en matrices). Stamcellen zijn belangrijk in zowel orgel ontwikkeling zijnde weefselherstel; begrijpen hoe stamcellen werken is cruciaal voor de ontwikkeling van nieuwe stamcel gebaseerde behandelingen 1. CTX0E03 is een klonale, voorwaardelijk vereeuwigd menselijke neurale stamcellen (hNSC) lijn 2 geïsoleerd van eerste trimester humane foetale cortex. CTX0E03 heeft kwaliteitskenmerken die essentieel zijn voor de klinische cel banking onder goede fabricagemethoden (GMP) 3 zijn gedefinieerd. HNSCs kunnen spontaan differentiëren in neuronen, glia, en oligodendrocyten en is bewezen dat neurologische afwijkingen te verbeteren wanneer getransplanteerd in een knaagdier Model van focale ischemie 2,4,5. De CTX0E03 hNSCs zijn momenteel in klinische studies voor een beroerte disabilteit (NCT01151124 6 en NCT02117635, Clinicaltrials.gov).

MiRNAs hebben een gemiddelde 22 nucleotiden lang en zijn bewezen regulerende moleculen 7, hebben ze geen eiwitten coderen, maar eerder te binden 3 prime onvertaalde regio (3'UTR) van mRNA's, het reguleren van hun stabiliteit en de vertaling in eiwitten. MiRNAs worden gerapporteerd deelnemen aan de regulatie van verschillende cellulaire processen, waaronder ontwikkeling, proliferatie en differentiatie 8. Verscheidene miRNAs zijn betrokken bij het ​​reguleren van het lot en de specificatie van neurale stamcellen 9.

In tweedimensionale (2D) standaard kweekomgeving de complexiteit van de in vivo omgeving niet wordt gecompenseerd, en daarmee de inductie en regulatie van hNSC differentiatie niet optimaal. In vivo cellen zijn omgeven door een driedimensionale (3D) micro samengesteld door andere cellen en extracellulaire liganden, waaronder veletypes collagenen, laminine en andere matrixeiwitten (extracellulaire matrix, ECM). Eerdere studies hebben gemeld dat de architectonische topografie van de materialen nabootsen ECM's en hun geometrie invloed cel fenotype en het lot 10-15. Een aantal commercieel verkrijgbare 3D draagstructuren beschikbaar; We gebruikten een zeer poreuze polystyreen steiger ontworpen met een goed gedefinieerde en uniforme architectuur in een 200 um dikke membraan dat een 3D ruimte waarin cellen kunnen binnendringen en differentiëren 16-18 verschaft.

Hierin 2D en 3D differentiatie assays worden gebruikt om axonprocess uitgroei beoordelen. Verder beschrijven we een werkwijze voor het miRNA expressie van een klinische kwaliteit hNSC lijn profiel te miRNA effecten op de differentiatie verder te onderzoeken. De werkwijzen hierin geïllustreerd zijn gebaseerd op die welke oorspronkelijk beschreven in 19.

Protocol

1. HNSC differentiatie op Driedimensionale (3D) Cultuur OPMERKING: Isoleer en ontlenen hNSCs, vanuit een ethisch goedgekeurd weefsel, in een eerdere publicatie 2 beschreven. Volg de ethische en institutionele richtlijnen tijdens het volgen van deze procedure. 1.1) 3D Cultuur Met behulp van 12-well plaat Gebruik aseptische techniek tijdens de gehele procedure. In een biologisch veiligheidskabinet, opnieuw te hydrateren steigers door toevoeging van 2 ml / putje van 70% ethanol bereid met water voor irrigatie (WFIr). Raak de steigers door het afgeven van de 70% ethanol aan den muur van elk putje. Aspireren zorgvuldig de 70% ethanol en de steigers onmiddellijk wassen met 2 ml / putje DMEM: F12 voor 1 min. Herhaal het wassen procedure tweemaal. Zuig voorzichtig de DMEM: F12 na de laatste wasbeurt. Coat steigers door toevoeging van 2 ml / putje van laminine (10 ug / ml) in DMEM: F12. Incubeer plaat bij 37 ° C in een 5% CO 2 humidified incubator gedurende minimaal 2 uur. Was de plaat met warm DMEM: F12. Zaad elke steiger met ongeveer 500.000 hNSCs in een volume van 150 ul van RMM + GF. Incubeer de plaat gedurende 3 uur bij 37 ° C in een 5% CO2 bevochtigde incubator om cellen te vestigen in de steigers. Voeg 3,5 ml van RMM aan elk putje zorg niet te cellen los van steigers. Incubeer de plaat voor 7 dagen; Vervang RMM medium na 1 dag (eerste voeding) (3,5 ml / putje) en opnieuw na 2-3 dagen na de eerste voeding. Na 7 dagen Verwijder medium en vast de cellen met 4% paraformaldehyde (PFA) voor immunocytochemie (ICC) en voeg 500 ul / putje van lysis reagens voor totale RNA-extractie (opslag plaat bij ≤ -80 ° C of naar het totale RNA-extractie) . 1.2) Meting van Axon Process uitgroei Vlekken op 4% PFA vaste gedifferentieerde hNSCs volgens een standaard ICC-protocol 20 met behulp van β3-tubuline (TUBB3) primair antilichaam gedetecteerd met een fluorochroom geconjugeerd secundair antilichaam. Tegenkleuring celkernen met Hoechst (1 uM). Leg representatieve beelden van β3-tubuline gekleurde cellen met behulp van een fluorescentiemicroscoop; afbeeldingen opslaan als tiff of jpeg. Maatregel van axon proces uitgroei met behulp van een software-meetinstrument (bv Image-Pro Plus). Open de afbeelding, selecteer metingen optie in de werkbalk en selecteer trace functie. Om het spoor te beginnen, selecteert u het beginpunt van de axon uitgroei door te klikken op de muisknop. Trace langs de gehele lengte van het axon uitgroei; klik met de rechtermuisknop op elk spoor af te maken. Herhaal dit tot alle axon outgrowthswith in het gezichtsveld te meten. Versneld metingen als pixels of micrometer (in afwachting van de kalibratie ingesteld). Lengte export metingen naar een spreadsheet programma voor monster vergelijkende en statistische analyse. 2. miRNA expressie met behulp van een stamcellen enOntwikkelingspaden Focused miRNA PCR Array 2.1) miRNA totaal RNA-extractie Voeren miRNA extractie op steigers en 2D gegroeid monsters (gedifferentieerde en ongedifferentieerde, hNSC controle). Ontdooi steigers, ingebracht in een 12 well plaat, indien nodig. Combineer lysis inhoud reagens (500 pl) van 2 putten in dezelfde 1,5 ml Eppendorf buis eindvolume 1 ml lysis reagens. Zorg ervoor dat de steiger in de put te verlaten. Voor eerder verzamelde als droge cel afgedraaid 2D gegroeid monsters (gedifferentieerde hNSC 2D culturen en ongedifferentieerde controle) voeg 1 ml lysis reagens en overdragen inhoud in 1,5 ml microcentrifugebuis. Homogeniseren elk monster met behulp van een 1 ml spuit en een korte 20 tot 25 gauge naald. Haal het lysaat door de naald met een 1 ml spuit tot 5 keer totdat een homogene lysaat wordt bereikt. Voeg 200 ul chloroform aan elk Eppendorf buisje en dop vast. Omkeren en vortex buizenMeng de inhoud. Centrifugeer elk 1,5 ml microcentrifugebuis met homogenaat gedurende 15 min bij ≥12,000 x g. Breng de bovenste waterige fase van elk monster (vermijden dat eventuele tussenfase roze gekleurde vloeistof) naar een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis met 750 pi 100% ethanol. Meng goed door omkeren. Pipetteer tot 700 gl van elk monster, inclusief de neerslag, in een kleine kolom in een 2 ml verzamelbuis. Sluit het deksel en centrifugeer bij ≥8,000 xg gedurende ongeveer 30 seconden bij kamertemperatuur. Gooi de doorstroom. Herhaal deze stap met de rest van het monster. Voer een DNA digest gedurende 15 min. Voeg 700 ul buffer RWT aan de mini-kolom en centrifugeer gedurende ongeveer 30 sec bij ≥8,000 x g. Gooi de doorstroom. Was mini column door het toevoegen van 500 ul buffer RPE en centrifugeren gedurende ongeveer 30 sec bij ≥8,000 x g. Gooi de doorstroom. Herhaal wash.Centrifuge bij ≥12,000 xg gedurende 1 minuut om het membraan verder te drogen. Elueer totaal RNA in een 1,5 ml Eppendorf buisje door toevoeging van 40 gl RNase-vrij water aan de mini-kolom en centrifugeren gedurende 1 minuut bij ≥8,000 x g. Meet totaal RNA-concentratie met behulp van een geschikte spectrofotometer. 2.2) miRNA cDNA Voorbereiding Bereid de reverse-transcriptie master mix. Elk monster 4 pi 5x miScript HiSpec buffer, 2 pl 10x nucleics mix vereist, miScript 2 pi reverse transcriptase mix. Aliquot 8 pi Master Mix in een PCR-buis, voeg benodigde hoeveelheid totaal RNA (250 ng), en voeg RNase-free water tot een eindvolume van 20 pl. Incubeer gedurende 60 minuten bij 37 ° C.Incubate gedurende 5 min bij 95 ° C geïnactiveerd miScript Reverse Transcriptase Mix. Voeg 200 ul RNase-vrij water aan elk 20 ui reverse transcriptie reactie, bewaar bij -20 ° C, of ​​verder met real-time meteen PCR. 2.3) Stem Cells en de ontwikkelingspaden Gericht miRNA PCR Array Bereid de PCR-componenten mix in een buis van 15 ml door het toevoegen van 1375 pi 2x SYBR groene master mix, 100 ul miRNA cDNA voorbereiding, 275 ul van 10x miScript Universal Primer, en 1000 pl RNase-vrij water (totaal volume 2750 pi). Transfer PCR componenten mix op een PCR laden reservoir. Verwijder de 96-well plaat PCR-array uit de verzegelde tas zorgvuldig. Voeg 25 ul PCR-componenten mengsel aan elk putje van de PCR array met een 8-kanaals pipet, of een 12-kanaals pipet met slechts 8 tips. Veranderen pipet tips na elke pipetteren stap om kruisbesmetting tussen de putten te vermijden. Seal plaat met optische kleeffolie en centrifugeer gedurende 1 min bij 1000 xg bij kamertemperatuur (15-25 ° C) om luchtbellen te verwijderen. Inspecteer de plaat van onderaf om ervoor te zorgen geen luchtbellen aanwezig in de putten zijn. Plaats de plaat met 96 putjes PCR array in de real-time cycler. Programmeer de real-time cycler bijgevolg: 1 cyclus bij 95 ° C gedurende 10 minuten en 45 cycli van 15 sec bij 95 ° C en 1 min bij 60 ° C een eenvormig (fluorescentie gegevensverzameling). De Ct-waarden te exporteren voor alle putjes naar een leeg Excel-spreadsheet voor gebruik met PCR Array Data Analyse Template Excel en web-based software. OPMERKING: Bij software is beschikbaar op www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php . 3. Computational Analyse voor miRNA Target Voorspelling en Validatie van Target mRNA door reporterplasmide Transfection en Ddual luciferasetest. 3.1) Computational Analyse voor miRNA Target Voorspelling Bladeren PicTar ( http://pictar.mdc-berlin.de/ ) 21, online beschikbaar algoritme voor de identificatie van miRNA richten voorspelling mRNA. Klik op "klik hier voor PicTar voorspelling op gewervelde dieren". Een nieuwe pagina wordt geopend. In de nieuwe pagina, PicTar webinterface, kiest soorten in het drop down menu en steek miRNA van belang in het vak miRNA-ID. Klik op zoeken voor doelwitten van een miRNA. Observeer een lijst van doelwit mRNA volgorde van aPicTar score. OPMERKING: PicTar berekent een score die de waarschijnlijkheid dat een bepaalde UTR zal worden gericht op de geselecteerde miRNA, en op basis van zaad complementariteit, thermodynamica en een combinatorische voorspelling voor gemeenschappelijke doelen in sets van co-uitgedrukt miRNAs 22. Op dezelfde manier halen de lijst van doelwit mRNA met behulp van DIANA-LAB ( http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/ ) 23, en TargetScan ( http://www.targetscan.org/ ) 24, alternatieve on-line beschikbaar algoritmen. Stel een vergelijkende tabel van miRNAs gebaseerd op ranglijst verkregen met behulp van verschillende software tools. PicTar gelederen op score, DianaLab door precisie (gebaseerd op de signaal-ruisverhouding en een precisie-score voor de evaluatie van de betekenis van de voorspelde resultaten), en TargetScan door geaggregeerde PCT (op basis van zaad complementariteit, thermodynamische vrije energie van binding, behoud dan verschillende soorten), zie tabel 1. 3.2) Validatie van Target mRNA door reporterplasmide Transfection en Dual luciferasetest. OPMERKING: 3 'UTR luciferase reporters voor de validatie van target mRNA is eerder beschreven 25. Transfectie Zaad HeLa-cellen bij een dichtheid van 10 5 cellen / putje in 24-well plaat. Na 24 uur co-transfecteren HeLa cellen met 1,5 ui transfectie reagens en hetzij 100 ng NR4A3 3 'UTRor SOX5 3' UTR plasmide en 20 nM miRNA bootst (HSA-miR-96-5p voor SOX5 3217; UTR, en HSA-miR-7-5p, en HSA-miR-17-5p voor NR4A3 3 'UTR respectievelijk) per well. Co-transfecteren controle putten met NR4A3 3 'UTRor SOX5 3' UTRplasmid en fluorochroom gelabelde negatieve controle siRNA. De transfectie van controle putten met fluorchroom gelabelde negatieve controle siRNA maakt evaluatie van de transfectie-efficiëntie en is goed voor mimic miRNA 3'UTR binden specificiteit. Meting van Dual Luciferase activiteiten Meet Firefly en Renilla luciferaseactiviteiten 24 uur na transfectie. Verwijder celkweekmedium. Bereid werkoplossing I door toevoeging van 50 pl substraat I in 10 ml Oplossing I; meng goed. Voeg 300 ul van werkende oplossing die ik in elkaar 24 ook. Breng de inhoud van elke 24 tot in 3 wells van een 96 witte plaat, 100 pl elk. Wacht 10 minuten en meet vuurvliegluciferase in lichtmeter set voor luminescentie overname. Bereid te werken solution II door toevoeging van 50 pl substraat II in 10 ml oplossing II; meng goed. Voeg 100 ui werkoplossing I in elk 96 putjes al bevattende 100 ui werkoplossing I. Wacht 10 minuten en meet Renilla luciferase in lichtmeter set voor luminescentie overname. Bereken de verhouding van luminescentie uit de Firefly luciferase het Renilla luciferase.

Representative Results

In figuur 1 wordt gevisualiseerd onderzoek en kwantificering van hNSC differentiatie 3D draagstructuren vergelijking met traditionele vlakke kweken (2D) en expressedas axon proces uitgroei metingen. In figuur 2 is representedthe workflow en de resultaten voor de miRNA kwantificering met behulp van stamcellen en ontwikkelingstrajecten gericht miRNA PCR array om differentiële expressie van miRNAs in 2D en 3D gedifferentieerde hNSCs vergelijking met ongedifferentieerde controle te onderzoeken. Volgende miRNA vergelijkende analyse tussen gedifferentieerde en ongedifferentieerde hNSCs, en computationele analyse voor doel voorspelling, SOX5 en NR4A3 (NOR1) werden geïdentificeerd als vermoedelijke doelwit mRNA. Om de directe interactie tussen de miRNAs en hun vermeende site op het 3'UTR mRNA gebruikten we 2 in de handel verkrijgbare plasmiden die ofwel SOX5 of NR4A3 3'UTR volgorde geplaatst stroomafwaarts van de vuurvlieg luciferasereportergen, bestuderen een nd die in hetzelfde plasmide Renilla luciferase gen voor normalisatie. De representatieve resultaten van 3 'UTR luciferaseactiviteit neerwaartse regulatie is weergegeven in figuur 3. Figuur 1:. Differentiatie van hNSCs op 3D steigers, en meting van axon proces es uitgroei (A) Naar aanleiding van de ICC-kleuring voor β3-tubuline (groen) en kernen tegengekleurd met Hoechst (blauw) vertegenwoordiger microfoto's werden verworven en meting van axon processen waren uitgevoerd met behulp van beeldanalyse software. (B) Schema melden het meten van axon uitgroei werkwijze uitgevoerd in 2D en 3D gedifferentieerde hNSCs 1 (1W) of 3 weken (3W).com / files / ftp_upload / 52410 / 52410fig1highres.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 2:. Schematische workflow van miRNA profilering in gedifferentieerde hNSCs Totaal RNA, zoals miRNAs, geëxtraheerd uit hetzij gedifferentieerde hNSCs op 3D draagstructuren en standaard 2D culturen of ongedifferentieerde controle. 250 ng totaal RNA waren retro-getranscribeerd met een methode die de selectieve omzetting van volwassen miRNAs in cDNA geschikt voor miRNA kwantificering met menselijke cel differentiatie en ontwikkeling miScript miRNA PCR-array vergemakkelijkt. De geo-gemiddelde van SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A en RNU6-2 werd gebruikt voor data-analyse op basis van de 2 -ΔΔct methode. Significante veranderingen werden gedefinieerd als +/- 1.5 klappen op en neer regelgeving naar een statistically belangrijke mate. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van web-based software verkrijgbaar bij De resultaten worden uitgedrukt als een clustergram. Gewijzigd ten opzichte van figuur 3 19. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 3: Validatie van miRNA doelwit voorspeld mRNA met een dual luciferase rapport test. (A) representatief diagram van een duale luciferase reporter plasmide gebruikt als een instrument om 3'UTR sequentie valideren als direct doelwit van een miRNA. (B) Vertegenwoordiger vergroting toont transfectie-efficiëntie. (C)   Signalen, uitgedrukt als relatieve luciferase-activiteit van humane 3 en #39; UTR verslaggevers ofSOX5 en NR4A3 genen werden aanzienlijk neergehaald in de aanwezigheid van HSA-miR-96, en miR-7 HSA-en 17 miRNA bootst respectievelijk. Gewijzigd ten opzichte van Figuur 5 19. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. DIANALAB PicTar TargetScan miRNA Doelgen Doelplaatsen / genen gevonden Precisie Partituur Aggregate P CT HSA-miR-96 SOX5 1214/763 1 6.74 <td> 0,94 HSA-miR-183 DUSP10 302/190 0.72 4.75 0.85 HSA-miR-302a NR4A3 863/473 0.84 3.05 NF HSA-miR-182 FOXN3 1358/794 0.94 NF 0.96 HSA-miR-7 NR4A3 NF NF 1.61 0.17 HSA-miR-7 FOXN3 399/136 0.17 NF 0.88 HSA-miR-20a NR4A3 1650/841 0.85 5.87 0.63 <strong> HSA-miR-20b NR4A3 1955/973 0.9 5.87 0.63 HSA-miR-17 NR4A3 1928/961 0.9 5.38 0,63 + 0,37 HSA-miR-20a EIF4G3 1650/841 0.97 NF NF HSA-miR-20b EIF4G3 1955/973 0.94 NF NF HSA-miR-17 EIF4G3 1928/961 0.94 NF NF Tabel 1: Lijst van miRNA doelwit voorspelling mRNA. Representatieve tafel van miRNAs, richten voorspellende genen, en algoritmen analyse (voorspellenion / score / aggregaat geleverd met behulp van Diana Lab, PicTar en TargetScan respectievelijk). Gemodificeerde tabel 3 19.

Discussion

De ontwikkeling van nieuwe in vitro testen om te beoordelen en verbeteren van de differentiatie van stamcellen is altijd een uitdaging voor het onderzoek van hun functies en therapeutische mogelijkheden. Lange termijn en stabiele bevestiging van hNSCs, die voor de ontwikkeling van een robuuste 3D in vitro differentiatie assay werd aangepakt door testen van verschillende 3D ​​substraten met verschillende eigenschappen in termen van materialen en structuren. Als onderdeel van de ontwikkeling van testen onderzochten we ook optimaal zaaien van cellen en concentratie die de eis dat de steigers laminine te bekleden. Hoewel onze hNSCs spontaan kunnen onderscheiden van 4-OHT en groeifactor verwijdering, de uitvoering van een 3D teeltsysteem vertoonden een significante verbetering in hun differentiatie vermogen gemeten door axon werkwijze uitgroei vergelijking met standaard 2D gedifferentieerde hNSCs.

Om het effect van 3D-geïnduceerde differe onderzoekenntiation op hNSC miRNA expressie gebruikten we een PCR-array. Vergeleken met standaard chip microarray PCR-array biedt de voordelen van een directe kwantificering en validatie van miRNA van belang. Hoewel de PCR matrix beperkt in termen van totaal aantal miRNA per array, bijvoorbeeld hier minder dan 96, kan worden aangepast om specifiek omvatten miRNAs plaats, in ons geval voorheen in stamcellen ontwikkeling. De expressie van pathway gericht miRNAs werd geprofileerd in 3D en 2D gedifferentieerd hNSCs vergelijking met ongedifferentieerde hNSCs. De meest significante down-gereguleerd miRNAs werden geselecteerd en geanalyseerd om hun vermeende doelwit mRNA beoordelen met de bedoeling van het bepalen van hun functionaliteit en biologische interpretatie met behulp van online beschikbaar algoritmen (DIANA Lab, PicTar en TargetScans).

Een enkele miRNA kan honderden doelwitten te herkennen en om deze reden hebben gevalideerd miRNA interacties met 3 'UTR mRNAsthat kunnen geschikte kandidaten in een te zijnxonal regelgeving. NR4A3, een doel van de HSA-miR-7 en miR-17-familie, is een lid van de familie NR4A nucleaire receptoren die afhankelijk van het niveau van expressie, zijn betrokken bij de differentiatie, overleving, apoptose en regulering van hippocampale axon leiding 26. Evenzo SOX5, een doelstelling van HSA-miR-96, is naar verluidt de celcyclus in neurale voorlopercellen 27 axon lengte 28, migratie, post-trekkende differentiatie, en projecties van neuronen 29 regelen. Zowel SOX5 en NR4A3 werden geïdentificeerd als een direct doelwit mRNA van HSA-miR-96, en HSA-miR-7 en 17 respectievelijk door dual luciferase reporter assays. Dual luciferase (Firefly en Renilla) berust op twee reporter genen in hetzelfde plasmide en biedt een verbeterd systeem dat normalisatie om effecten van suboptimale transfectie en cytotoxische effecten in vergelijking met één luciferase plasmide systeem. Als onderdeel van onze test ontwikkeling die we ook geoptimaliseerd onze transfectie conditions om hoge rendement te bereiken.

De protocolsdescribed uitvinding kunnen worden benut verder te optimaliseren en te karakteriseren in vitro differentiatie hNSC eventueel beimplemented intransplantation protocollen voor preklinische studies en toekomstige klinische toepassingen.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij erkennen Julie Heward voor het helpen bij de voorbereiding van hNSCs en Lavaniya Thanabalasundaram voor haar technische ondersteuning met HeLa kweken en transfectie.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
DMEM:F12 Invitrogen 21331-020 For RMM medium preparation
Human Albumin Solution  Baxter health care limited  1501052 For RMM medium used at a final concentration of  0.03%
Transferrin, Human recombinant Sigma T8158 For RMM medium used at a final concentration of  5 µg/ml
Putrescine DiHCl  Sigma P5780 For RMM medium used at a final concentration of  16.2 µg/ml
Insulin, Human recombinant   Sigma I9278 For RMM medium used at a final concentration of  5 µg/ml
Progesterone  Sigma P6149 For RMM medium used at a final concentration of  60 ng/ml
L-Glutamine  Invitrogen 25030-24 For RMM medium used at a final concentration of  2 mM
Sodium Selenite   Sigma S9133 For RMM medium used at a final concentration of 40 ng/ml
bFGF      Peprotech AF-100-15 To be added to RMM medium, used at a final concentration of 10 ng/ml
EGF        Peprotech AF-100-188 To be added to RMM medium, used at a final concentration of 20 ng/ml
4-OHT Sigma H7904 To be added to RMM medium, used at a final concentration of 100 nM
Laminin AMS Biotech 3400-010-10
TrypZean/EDTA Lonza  BE02-034E
Water for irrigation Baxter Healthcare UKF7114
Defined Trypsin Inhibitor (DTI) (store -20°C) Invitrogen R007-100
Alvetex 12 well plate  Reinnervate Ltd AVP002
Ethanol  Merck  1.00986.1000
βIII tubulin antibody Sigma T8660
Hoechst Sigma B2261
miRNeasy mini kit Qiagen  217004
RNase free DNase  Qiagen  79254
Chloroform Sigma C7559-5VL
miScript II RT Kit  Qiagen  218160
SYBR green PCR kit Qiagen  218073
Cell Development & Differentiation miScript miRNA PCR Array Qiagen/ SABiosciences MIHS-103Z
Lightcycler 480 white 96 plate Roche  4729692001
Lightcycler 480  sealing foil Roche  4729757001
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027
Vector NR4A3 miRNA 3' UTR target clones  GeneCopeia HmiT019538-MT0
Vector SOX5 miRNA 3' UTR target clones  GeneCopeia HmiT017632-MT01
Allstars negative control siRNA AF 488 (Qiagen). Qiagen  1027284 MiRNA transfection control
Luc-Pair miR Luciferase Assay GeneCopeia LPFR-M010
Lightcycler 480  Roche
GloMax 96 microplate luminometer  Promega
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Falanga, V. Stem cells in tissue repair and regeneration. J Invest Dermatol. 132 (6), 1538-1541 (2012).
  2. Pollock, K., et al. A conditionally immortal clonal stem cell line from human cortical neuroepithelium for the treatment of ischemic stroke. Exp Neurol. 199 (1), 143-155 (2006).
  3. Hodges, H., et al. Making stem cell lines suitable for transplantation. Cell Transplant. 16 (2), 101-115 (2007).
  4. Smith, E. J., et al. Implantation site and lesion topology determine efficacy of a human neural stem cell line in a rat model of chronic stroke. Stem Cells. 30 (4), 785-796 (2012).
  5. Stroemer, P., et al. The neural stem cell line CTX0E03 promotes behavioral recovery and endogenous neurogenesis after experimental stroke in a dose-dependent fashion. Neurorehabil Neural Repair. 23 (9), 895-909 (2009).
  6. Kalladka, D., Muir, K. W. Brain repair: cell therapy in stroke. Stem Cells Cloning. 7, 31-44 (2014).
  7. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  8. Anokye-Danso, F., et al. Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 8 (4), 376-388 (2011).
  9. Li, X., Jin, P. Roles of small regulatory RNAs in determining neuronal identity. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 329-338 (2010).
  10. Badylak, S. F. The extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Semin Cell Dev Biol. 13 (5), 377-383 (2002).
  11. Buxboim, A., Discher, D. E. Stem cells feel the difference. Nat Methods. 7 (9), 695-697 (2010).
  12. Li, W. J., et al. A three-dimensional nanofibrous scaffold for cartilage tissue engineering using human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 26 (6), 599-609 (2005).
  13. Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
  14. Ortinau, S., et al. Effect of 3D-scaffold formation on differentiation and survival in human neural progenitor cells. Biomed Eng Online. 9 (1), 70 (2010).
  15. Saha, K., Pollock, J. F., Schaffer, D. V., Healy, K. E. Designing synthetic materials to control stem cell phenotype. Curr Opin Chem Biol. 11 (4), 381-387 (1016).
  16. Knight, E., Murray, B., Carnachan, R., Przyborski, S. Alvetex(R): polystyrene scaffold technology for routine three dimensional cell culture. Methods Mol Biol. 695, 323-340 (2011).
  17. Bokhari, M., Carnachan, R. J., Przyborski, S. A., Cameron, N. R. Emulsion- templated porous polymers as scaffolds for three dimensional cell culture: effect of synthesis parameters on scaffold formation and homogenity. J. Mater. Chem. 17, 4088-4094 (2007).
  18. Bokhari, M., Carnachan, R. J., Cameron, N. R., Przyborski, S. A. Novel cell culture device enabling three-dimensional cell growth and improved cell function. Biochem Biophys Res Commun. 354 (4), 1095-1100 (2007).
  19. Stevanato, L., Sinden, J. D. The effects of microRNAs on human neural stem cell differentiation in two- and three-dimensional cultures. Stem Cell Res Ther. 5 (2), 49 (2014).
  20. Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number. J Vis Exp. (45), (2010).
  21. Chen, K., Rajewsky, N. Natural selection on human microRNA binding sites inferred from SNP data. Nat Genet. 38 (12), 1452-1456 (2006).
  22. Krek, A., et al. Combinatorial microRNA target predictions. Nat Genet. 37 (5), 495-500 (2005).
  23. Maragkakis, M., et al. Accurate microRNA target prediction correlates with protein repression levels. BMC Bioinformatics. 10, 295 (2009).
  24. Lewis, B. P., Burge, C. B., Bartel, D. P. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets. Cell. 120 (1), 15-20 (2005).
  25. Aldred, S. F., Collins, P., Trinklein, N. Identifying targets of human micrornas with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3’UTR-reporter constructs and a microRNA mimic in adherent cells. J Vis Exp. (55), (2011).
  26. Ponnio, T., Conneely, O. M. nor-1 regulates hippocampal axon guidance, pyramidal cell survival, and seizure susceptibility. Mol Cell Biol. 24 (20), 9070-9078 (2004).
  27. Martinez-Morales, P. L., Quiroga, A. C., Barbas, J. A., Morales, A. V. SOX5 controls cell cycle progression in neural progenitors by interfering with the WNT-beta-catenin pathway. EMBO Rep. 11 (6), 466-472 (2010).
  28. Kwan, K. Y., et al. SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (41), 16021-16026 (2008).
  29. Lai, T., et al. SOX5 controls the sequential generation of distinct corticofugal neuron subtypes. Neuron. 57 (2), 232-247 (2008).

Tags

Human Neural Stem Cells3D CultureDifferentiationMicroRNATarget GenesSOX5NR4A3Axon OutgrowthMiRNA ExpressionComputational AnalysisDual Luciferase Assay

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Stevanato, L., Hicks, C., Sinden, J. D. Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes. J. Vis. Exp. (98), e52410, doi:10.3791/52410 (2015).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image