ラットにおける超音波検査技術を用いた薬剤誘発性腎血行動態機能障害の早期発見

アメリカ獣医師会（AVMA）のガイドラインおよび承認された施設内動物管理使用委員会（IACUC）プロトコルを使用してに従い、チャールズ・リバー・ラボラトリーズから購入した雄のSprague Dawleyラットのすべての手順を実行します。 1.動物の準備および外科的処置任意の実験手順の前に1週間のすべての動物を順応させます。 イソフルランを用いて動物を麻酔（2-3％が誘導する、および1.0％を維持するために）と乾燥、刺激や潰瘍を防ぐために、両眼に眼軟膏を適用します。 ＃40ブレードと、必要に応じて脱毛クリームを使用して、動物の胸から髪を削除します。我々は腹側の撮影を行い、得られた良好な画像データを持つことができない場合は、動物の背中の形の髪を削除する必要があります。 2.腎毒性ラットモデルシスプラチン誘発腎毒性モデルでは、プロトコルAを使用して、シスプラチンを投与Sは、前述の図15に ベースライン、24時間シスプラチンの投与前（0日目）で超音波検査を行います。 （ステップ3を参照してください、イメージングプロトコル） ラットをランダム（n = 6）が2グループに。 1日目に、（腹腔内に試験群と生理食塩水で、シスプラチン、動物の体重により計算（10 mg / mlで）（10mg / kgの体重、単一用量の腎毒性誘導）、注入量（1ミリリットル/ Kg体重））を投与します対照群ではNS）。 24でステップ1.2、48、72、96、120、シスプラチン投与後144時間などの動物を麻酔。 動物の安定した麻酔段下（材料および装置表を参照してください）​​、高解像度の超音波システムを使用して画像を取ります。完全な回復を介して麻酔導入から撮像中に動物の基本的な生理機能を監視し続けます。 ラット-温度：35.9から37.5、呼吸数：66から144 /分、心拍数：250から600 /分イメージング手順の間に動物のバイタルサインを監視します。提案研究で読んで最適なバイタルサインは、次のとおりです。温度：36.5から37.0、呼吸速度：80-100 /分、心拍数：450〜550 /分。 注：使用する静脈内輸液、加熱ランプは、手術や麻酔の影響を最小限に抑えるために、動物の正常な生理学的状態を維持します。必要に応じて、手順の間に人工呼吸器で呼吸を補助します。しかし、機械換気はほとんどこの実験では必要ありません。 3.イメージングプロトコル注：超音波マシンプロバイダが長い撮像手順のために加熱されたプラットフォームを提供します。それだけで5〜15分かかりますのでしかし、我々は我々の実証実験で加熱されたプラットフォームを使用しないでください。その生理学制御スイッチに接続された直腸温度計で監視され、体温のために制御されます。 腎臓の横断画像（Bモード）： 21メガヘルツの中心周波数とMS 250超音波を使用して接続しますアクティブ・ポートへのedは、「一般的なイメージング」へのアプリケーションのプリセットを設定します。 プラットフォーム上の動物仰臥位と、レールシステムを使用して、21 MHzの超音波プローブを配置し、動物上の正中線と大動脈を隔離します。この位置では、プローブの角度は、左胸骨傍線（横軸）に対して90度（ 図1A、B）です。 この位置からプローブは、腎動脈のレベルに今あるように、動物とのプラットフォームをスライド（左または右のいずれかの時の画像1缶）。 マイクロマニピュレーターを使用して、右または左腎動脈のいずれかを表示します。 画面中央の完全な腎臓ビューを取得するために、プローブのy軸に沿ってわずかに傾けることによって、プローブの角度を調整します。 図1CおよびD、シネストア用いたプローブで許可される最高フレームレートを使用して画像に示すように、適切なランドマーク（腎盂、腎動脈）が識別されると。 </l私> 腎臓の横断画像（カラードップラービュー）： キーボード上のカラードップラーキーを使用して、カラードップラー音響窓をオンにします。これは、腎動脈と腎静脈（ 図1D）を単離するのに役立ちます。 （ブルー色は、動脈の流れを示し、赤色は、静脈の流れを示しています）。 （Y軸上と黄色の矢印で示される）、焦点深度が腎臓の中心にあることを確認してください。シネストアとデータを記録します。 可能な限り最高の可能なフレームレートでの記録がデータ（> 200フレーム/秒）を確認してください。 腎臓の横断画像（パルス波またはPWビュー）： カラードップラーモードでは、画面（ 図1F）上の黄色のインジケータライン（パルス波ドプラサンプルボリューム）を起動する一方で、PW]キーをクリックします。 PW角キーを使用して血管を通る流れの方向に平行な角度で、腎動脈内の黄色の線を配置します。 <li>は、フロー評価のために右腎動脈で、流れの方向で腎動脈に沿ってPW黄色のインジケータラインを配置する（これは図1 のDとEに青色で示されている）ドップラー角が60度以下である保証します。 このモードでは、アコースティックウィンドウは上部および下部のセクションに分割されます。 ピーク収縮期および拡張期における動脈流の速度を示す波形の画像をキャプチャするためにシネ・ストアを使用します。 イメージングの後4.動物の取り扱い 0日目から5日目に、イメージング後に胸骨横臥位の位置に（寝具に清潔なペーパータオルで）きれいなリカバリ領域に動物を配置します。私たちは動物等の積極的な動物のための「テール・ホールディング」方法で細心の注意を払ってすべての動物を扱うことに注意してください麻酔から回復します。 麻酔リカバリ時に、外部ょんで動物の体温を保ちますトン源と動物が麻酔から完全に回復するまでの電気生理学的プローブを用いて、動物のバイタルサインを監視します。 彼らは、アラートとアクティブであるときに戻り、施設の収容室に動物を回復しました。 6日目、収穫腎臓に制度ガイドラインに従ってすべてのラットを安楽死させるステップ4.5と同様、組織学的評価のため（ステップ4.7を参照してください）​​。 腎機能をチェックするためにクレアチニン検査のために代謝ケージに取り付けられた採取管から動物の尿を収集します。 動物の腎臓のパラフィン切片を行い、かつ腎毒性を（詳細はステップ4.7を参照）をチェックする染色HE（ヘマトキシリン​​およびエオシン）を行います。 動物を犠牲にし、左心室を介して10％緩衝ホルマリン固定、続いて0.9％NaCl溶液で放血。 0.9％NaCl溶液で放血した後、組織学的評価の16のために、ラットの腎臓を削除します。 パラフィンは、腎臓のモルフォリンを観察するために6 mmのセクションを埋め込みます術や腎毒性。 4ºCで48時間、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の30％スクロース中の腎組織を脱水。そして、4ºCで24〜48時間、10％緩衝ホルマリン中でセクションを修正します。 次に、パラフィンに腎臓組織を埋め込み、切片化するまで室温で組織パラフィンブロックを格納します。さらに、セクション組織ブロックパラフィン切片機を使用し、コーティングされたガラススライド上にセクションを配置。 セクションをDeparrafinizeし、再水和し、3分間エオシン続いて10分間ヘマトキシリン​​で染色しました。スライド上のセクションをマウントし、それらは、げっ歯類病理学者によって評価しました。 5.データの計算と分析ステップ3.2から得られたカラードプラ画像から腎動脈ピーク速度を計算します。収縮期および拡張期速度のピークを追跡する速度の時間積分（VTI）ツールを選択します。 equatioを使用して計算抵抗指数（RI）と脈動指数（PI）以下のナノ秒。 RI =（ピーク収縮期速度、拡張末期速度）/ピーク収縮期速度 PI =（ピーク収縮期速度エンド拡張期速度）/速度を意味します。 3サイクルの測定値の平均からの標準偏差とRIとPI結果の統計解析を実行します。他の標準的なパラメータについては、（材料および装置表を参照してください）​​独自のソフトウェアを使用してデータ分析を実行するには、メーカーからのマニュアルを参照してください。