A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.
Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.
近年来,我们的神经元和神经元电路功能的理解已经彻底改变了由该控制神经元兴奋性的几个光遗传学工具。一种这样的工具是光激活的阳离子通道,channelrhodopsin-2(的ChR2):神经元表达的ChR2火动作电位响应于光刺激1-3。由于神经元通常不怕光,这种非凡的能力,开辟了新的途径,神经元4的基因特定人群的活动的确切时间和空间的控制,并大大加快脑功能的研究。的ChR2已经应用到干细胞研究用于不同的目的,从监测神经元发育5至调节神经网络6的活性。
在这里,我们使用的ChR2增加神经元共培养系统的效用。共培养系统使不同细胞类型之间的相互作用的评价。共培养的神经元和神经胶质的,神经系统的主要细胞类型,通常被用来研究这些不同细胞类型之间的信令,以及评估该信令对生理反应的意义,损害的繁殖和检查这潜在地参与了这一信令7的分子机制。先前的研究显示,人类iPSC非常迅速分化成神经元的大鼠皮质初级含有培养的神经元,星形胶质细胞,少突胶质细胞,小胶质细胞和8的存在。
在这个协议中,我们证明了利用的ChR2在共培养体系审问从人类诱导多能干细胞(iPS细胞)衍生的大鼠皮层神经元和神经元之间的突触连接的方法。我们描述的步骤来剖析和收获脑组织9以及维持和分化小鼠神经祖细胞(NPC的)为星形胶质细胞和人类的NPC诠释Ò神经元来创建共培养体系。建立这一共培养体系中,我们使用由Okita 等人描述的一体化的无重编程方法。10,以产生人类iPSC。这些iPS细胞然后有效地分化成的NPC在化学成分确定的条件下,使用小分子抑制剂如由Li 等人 11
在该共培养,神经元的不同种群可以通过在皮层神经元的检测的ChR2表达的源自iPSC的神经元和标记通过荧光蛋白,串联二聚体番茄(tdTomato)识别。组合电生理记录从源自iPSC的神经元与皮质神经元的光遗传学光刺激允许这两种类型的神经元,以形成彼此电路的能力的评估。具体来说,的ChR2表达皮层神经元光刺激唤起已经形成突触电路源自iPSC的神经元突触反应与光激励皮层神经元网络。我们表明,增加的突触后电流在源自iPSC的神经元确实检测到这样的条件下进行。该协议允许突触电路的评估在各种实验条件,包括不同的神经系统疾病的模型通过使用来自患者的成纤维细胞衍生的iPSC概括。
光遗传学提供了激活神经元13的特定人群的时间和空间的精度。在我们的实验中,显微镜物镜的整个领域被照射30秒,以光刺激仅皮层神经元表达的ChR2。这使我们能够确定是否突触连接进行的联合培养的神经元内不同群体之间形成。我们的研究结果表明,光刺激增加的PSC频率在源自iPSC的神经元,这表明这些神经元接收从突触前皮质神经元表达的ChR2突触输入。这,反过来,确定,源自iPSC的神经元成功掺入与皮质神经元的电路。
有此共培养体系的产生几个关键步骤。确保了小鼠NPC来源星形细胞培养是健康的,具有最小的细胞死亡,在进行电镀之前是很重要其它类型的细胞。皮层神经元和人类的NPC以及附着到健康的星形胶质细胞和电生理记录在很大程度上取决于文化的条件。在这个协议中的其他关键步骤是电和皮层神经元电镀到星形胶质细胞的文化。作为大量细胞的电穿孔后死亡,它确保至少6000000皮层神经元是电穿孔在24孔板上镀星形细胞培养是很重要的。我们已观察到,当少于600万细胞电穿孔,即生存的神经元的数量并没有形成致密的神经网络,其中受影响的电生理记录。电穿孔的皮层神经元的数目也应该是一致的每个共培养实验,以允许不同研究之间的比较。对于涉及酶促消化的所有步骤,必须不离开细胞在消化溶液太久,因为它可能导致细胞死亡。
此方法可用于筛选从患者特异性的成纤维细胞衍生的,以形成与其他神经元突触联系的神经元的能力。来自于成纤维细胞,从患者的神经发育紊乱雷特综合症(RTT)患有神经元表现出突触传递的缺陷:RTT神经元表现出,大概是由于以下突触连接14一显著降低的PSC的频率和幅度相对于健康的神经元。我们的共同培养系统允许检查对神经元显示发育缺陷的药物的效果。这可以通过加入感兴趣化合物的患病的人的NPC播种期间以及连续暴露于化合物在整个神经元分化的时间期间进行。
虽然这种共培养系统也可以被用来作为一种模式用于药物测试,这种方法的限制是,调查每一个候选化合物的效果的方法可以是长期的,乏味的它不是一个高通量筛选方法。以下用候选化合物处理,源自iPSC的神经元必须单独修补以确定的PSCs各化合物的作用。此外,目前有从患者没有许多可用的成纤维细胞和iPS细胞。因此,这将是在不久的将来的兴趣有更多的患者的细胞,也以适应该协议用于高通量筛选。例如,通过标记源自iPSC的神经元的活动的指标,如离子或膜电位的基因编码的传感器,将有可能通过侧步进耗时电过程大幅提高吞吐率。作为产生该共培养体系,从重新编程的成纤维细胞,以进行电生理记录的整个过程中,需要90天以上,则建议无论是人类iPSC或NPC的扩大,重新编程和神经诱导步骤后分别并冷冻保存,以减少所需要的未来实验的时间。
在我们的实验中,我们在下面的synapsin1子皮层神经元表达的ChR2。因为这是促进泛神经元,我们大概是photostimulating既抑制和兴奋皮层神经元。如果未来的实验的目的是为了具体询问或者抑制或兴奋性的电路,更具体的启动子也可以使用。可替代地,皮质神经元可以从转基因(或病毒注射的小鼠),其中的ChR2表达被特异性地靶向神经元的基因定义的亚群来获得。例如,来自小鼠具有Cre重组收获皮质组织表达在含小清蛋白-的interneurons(PV的interneurons),其越过一个鼠标两侧装接loxP的ChR2将产生一种情况,唯一的皮层神经元表达的ChR2将光伏的interneurons 15。使用这样的ChR2表达在我们的interneurons共立方米的lture系统将使修补源自iPSC的神经元是否能够将与PV的interneurons电路的决心。
根据先前的研究9,皮层神经元的成熟与后体外 14天重叠树突。因此,如果光刺激不引起从修补源自iPSC的神经元的响应,它应表明,神经元不具有以与皮质神经元突触连接的能力。一个源自iPSC的神经元能够接收或者从其他源自iPSC的神经元或皮质神经元突触输入。如果采用传统的膜片钳记录,它不可能分辨其中所述突触输入是来自。我们的系统的优点是,从皮质突触前输入突触后的反应,可以选择性地诱发和鉴定。这里列出的程序提供了一个简单的方法来评估整合源自iPSC的神经元的能力成神经细胞定义网络。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢K.戴瑟罗特和S.济的的ChR2和Synapsin1-tdTomato慢病毒结构分别C.柴上的iPSC代共享专业知识和协议,WY丰隆技术支持,吴作栋实验室分享试剂和专长的成员。雅培营养与卓越学术中心(ACE)从葛兰素史克公司(GSK)研究奖,以ELG根据其竞争研究计划(NRF 2008 NRF-CRP 002-082),以ELG这项工作是支持的,由国家研究基金会和新加坡GJA,并通过世界级协会(WCI)计划韩国国家研究基金会(NRF)受教育,科学和韩国的技术(MEST)部资助(NRF授权号:2009-003 WCI),以GJA
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Neurocult Proliferation Kit (Mouse) | STEMCELL Technologies | 5702 | Contains NSC Basal Medium and NSC Proliferation Supplement |
Epi5 Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | |
DMEM/F12 | Lonza | 12719F | |
Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
MEM without glutamine | Invitrogen | 11090081 | |
N2 | Invitrogen | 17502048 | |
B27 | Invitrogen | 17504044 | |
L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
GlutaMAX supplement | Invitrogen | 35050061 | |
PenStrep | Invitrogen | 15140122 | |
BSA | Sigma | A7906 | |
Human LIF | Invitrogen | PHC9484 | |
CHIR99021 | Miltenyi Biotech | 130103926 | |
SB431542 | Sigma | S4317 | |
Compound E | Merck Millipore | 565790 | |
EGF | Merck Millipore | 324856 | |
FGF2 | R&D Systems | 233FB025 | |
Research Grade FBS | Thermo Scientific | SV30160.03 | For astrocyte differentiation medium |
Defined FBS | Thermo Scientific | SH30070.03 | For primary neuron medium |
PBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
Glucose | Sigma | G8270 | For primary neuron medium |
Sucrose | Sigma | S0389 | |
Heparin | EMD Millipore | 375095 | |
Papain | Worthington | 3126 | |
HBSS | Invitrogen | 14175095 | |
DNase I | Roche | 10104159001 | |
Dispase II | STEMCELL Technologies | 7923 | |
HEPES | Gibco | 15630080 | For harvesting brains |
EBSS | Invitrogen | 14155063 | |
L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
70 µm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
20 µm filter unit | Sartorius Stedim | 16534K | |
NaCl | Sigma | S7653 | |
KCl | Sigma | P5405 | |
NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
NaH2PO4 | Fluka | 71505 | |
MgCl2 | Sigma | M8266 | |
CaCl2 | Sigma | C1016 | |
D(+)-Glucose | Sigma | G7520 | For electrophysiological studies |
K-gluconate | Sigma | P1847 | |
KOH | KANTO Chemical | 3234400 | |
HEPES | Sigma | H3375 | For electrophysiological studies |
EGTA | Sigma | E3889 | |
Na2ATP | Sigma | A7699 | |
Na3GTP | Sigma | G8877 | |
Borosilicate glass capillaries | World precision instruments, Inc | 1604323 | |
15 ml centrifuge tube | BD Biosciences | 352096 | |
50 ml centrifuge tube | BD Biosciences | 352070 | |
24-well plates | Corning | 9761146 | |
6-well plates | Corning | 720083 | |
T25 flasks | Corning | 430641 | |
12 mm cover glasses | Marienfeld-Superior | 111520 | |
AMAXA Rat Neuron Nucleofector Kit | Lonza | VPG1003 | For electroporation of primary cortical neurons |
Neon Transfection System | Invitrogen | MPK5000 | For electroporation of human fibroblasts |
Mini Analysis | Synaptosoft | Mini Analysis v.6 | For measurement of PSCs |
Normal Dermal Human Fibroblasts | PromoCell | C12300 | |
pLenti-Synapsin-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE | Addgene | 20945 | |
Mercury short-arc lamp | OSRAM | HBO 103 W/2 | |