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Medicina

Valutazione non invasiva della efficacia di nuove terapie per patologie intestinali Utilizzando Serial Imaging endoscopica Live Mice

Published: March 10, 2015
doi:
10.3791/52383
, ,
1The Walter and Eliza Hall Institute for Medical Research, 2The Department of Medical Biology,University of Melbourne, 3Olivia Newton-John Cancer Research Institute

Summary

We describe methods for longitudinal monitoring of the efficacy of therapeutics for the treatment of colonic pathologies in mice using a rigid endoscope. This protocol can be readily used for the characterization of the therapeutic response of an individual tumor in live mice and also for monitoring potential disease relapse.

Abstract

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic mechanisms that contribute to the onset and progression of intestinal diseases. The identification of new molecules that promote these pathologies has led to a flurry of activity focused on the development of potential new therapies to inhibit their function. As a result, various pre-clinical mouse models with an intact immune system and stromal microenvironment are now heavily used. Here we describe three experimental protocols to test the efficacy of new therapeutics in pre-clinical models of (1) acute mucosal damage, (2) chronic colitis and/or colitis-associated colon cancer, and (3) sporadic colorectal cancer. We also outline procedures for serial endoscopic examination that can be used to document the therapeutic response of an individual tumor and to monitor the health of individual mice. These protocols provide complementary experimental platforms to test the effectiveness of therapeutic compounds shown to be well tolerated by mice.

Introduction

Il cancro colorettale (CRC) è la 4 ° causa più comune di tumore maligno in tutto il mondo 1. Nonostante i significativi progressi nella nostra comprensione della base familiare di questa malattia, predisposizione genetica contribuisce solo al ~ 20% dei casi CRC 2. Il resto sono attribuiti a numerosi fattori estrinseci e ambientali, tra cui l'infiammazione cronica. Negli esseri umani, il legame tra infiammazione cronica e il cancro del colon è evidente nella colite ulcerosa (UC) pazienti, che hanno un rischio maggiore di sviluppare il cancro del colon-colite associata (CAC), a seconda della durata, l'estensione e la gravità della malattia infiammatoria 3 -5. Di conseguenza, nuove terapie sono in sviluppo per controllare la risposta immunitaria e la produzione di fattori di crescita associato promuovere dal tumore microambiente infiammatorio 6-8. Vi è una richiesta crescente di appropriati modelli animali pre-clinici per caratterizzare l'efficacia terapeutica diquesti farmaci contro lo sviluppo e la progressione della malattia.

Modelli murini hanno inequivocabilmente dimostrato che il microambiente infiammatorio contribuisce CRC progressione, anche in assenza di infiammazione palese 9,10. Questi modelli includono l'uso di sodio polisaccaride destrano solfato (DSS), disponibile in acqua potabile di topi, per modellare danno epiteliale e malattia acuta e cronica infiammatoria intestinale (IBD) 11,12. Anche se il meccanismo con cui DSS induce danno della mucosa e colite non è completamente noto, alcuni studi suggeriscono che DSS inibisce le attività della trascrittasi inversa e ribonucleasi cellulari all'interno delle cellule, o promuove la formazione di complessi nano-lipidico, che si fondono con la membrana del colon che porta al danno epiteliale 13,14. Le modifiche al modello di serie DSS hanno inoltre fornito informazioni significative sui meccanismi con cui le cellule epiteliali del colon mantenere l'omeostasi tissutale e regolaritàritardo mucose risposte immunitarie 15.

La somministrazione intraperitoneale di azoxymethane (AOM) da solo, o in combinazione con DSS, fornisce un modello per l'esame l'interazione tra mutazioni somatiche nella mucosa epiteliale e il microambiente infiammatorio e stromale 16,17. AOM è un metabolita della sostanza cancerogena 1,2-dimetilidrazina (DMH) che non derivano direttamente in mutazioni del DNA. Invece, AOM è idrolizzato a methylazoxymethanol (MAM) dalla isoforma citocromo CYP2E1 nel fegato, dove MAM è coniugato con acido glucuronico e poi trasportato nell'intestino attraverso le secrezioni biliari 18. Si pensa che il batterica β-glucuronidasi contribuisce al degrado della MAM conseguente alchilazione DNA e l'accumulo di mutazioni in cellule epiteliali 19. La maggior parte dei tumori del colon-AOM indotta porto mutazioni missense nel gene codificante β-catenina, rendendo la proteina resistente alla degradati proteasomail che si traduce in aberrante attivazione del pathway Wnt canonica di segnalazione 20. Quando l'attività di AOM è combinata con il danno della mucosa suscitato dal DSS, la guarigione della ferita conseguente risposta crea un microambiente che favorisce la crescita e l'espansione dell'epitelio mutagenizzato. In una variante di questo modello, la somministrazione ripetuta di AOM solo per un periodo di diverse settimane può essere usata per modellare cancro colorettale sporadica, in assenza di DSS-indotta colite 10,17. Questi due modelli gratuiti forniscono impostazioni sperimentali per studiare rispettivamente CAC e sporadici CRC, entrambi associati a un microambiente tumorale pro-infiammatoria 10.

L'uso dell'endoscopia seriale nei topi è stato lanciato da Becker e colleghi 21, e consente il monitoraggio longitudinale della colite e la progressione tumorale. Qui forniamo tre protocolli pre-clinici sulla base di DSS-indotta danno della mucosa e / o AOM-mediata tumor induzione per indurre riproducibile specifiche patologie del colon. Il primo protocollo descrive indurre danno della mucosa acuta in risposta alla somministrazione DSS a suscitare molte delle caratteristiche istopatologiche associate a IBD. Il secondo protocollo si basa su tre cicli consecutivi di somministrazione DSS per imitare i razzi di infiammazione comunemente osservato nei pazienti IBD, e può essere eseguito in combinazione con mutazioni AOM-indotta. Il protocollo finale si basa su sporadiche mutazioni epiteliali AOM-indotta. Per ciascuno di questi protocolli, espandiamo sulle procedure standard rilevanti per comprendere i metodi di intervento profilattici e terapeutici che abbiamo sviluppato per monitorare l'efficacia di nuovi farmaci.

Protocol

L'Istituto Walter e Eliza Hall of Medical Research commissione etica degli animali approvato ciascuna delle procedure descritte in questi protocolli. 1. Preparazione di topi sperimentale Comporre coorti sperimentali di almeno 4 genere abbinati 6-8 settimane di età C57BL / 6 topi (M. musculus) che vengono allevati e ospitati nello stesso patogeno specifico gratuito (SPF) stabulario / stanza, di un'alimentazione autoclave e acqua. L'uso di topi femmina permetterà co-housing di topi da diverse linee, numeri di casella limite, e ridurre la variazione della gabbia a gabbia. Assicurarsi che i topi sono almeno 6 settimane di età per consentire le procedure endoscopiche con guaina di diametro endoscopia 3,0 millimetri. Utilizzare topi dello stesso background genetico, e, se possibile, da gabbie memorizzati sul stesso rack per ridurre variazioni associate con la microflora intestinale. Variazioni nella microflora tra strutture di polizia dovrebbero essere presi in considerazione when determinare i pertinenti topi di controllo e genotipi per ogni esperimento 22. Mark topi ritagli orecchio / punta, tatuaggi, o simili per consentire una facile identificazione. Pesare topi il giorno 0, per determinare i pesi di base sperimentale. Eseguire endoscopia (vedi sezione 5) di topi al giorno 0 per registrare fenotipi colon di base. 2. Pre-Trial clinico in un danno epiteliale e acuta Colite Modello Preparare una soluzione dell'agente terapeutico da testare. Per therapeutics forniti da gavage orale (po), preparare soluzioni per un volume massimo di 100 microlitri. Per therapeutics forniti da intraperitoneale (ip) iniezione, preparare soluzioni per un volume massimo di 200 microlitri. NOTA: ripetuta ip o po somministrazione del farmaco per periodi prolungati di tempo può portare a comportamenti alterato mouse. Alternare il sito di iniezione ip per evitare disagi prolungati. Per la somministrazione po, fornire i topi con AUTOCsemi di girasole bagnai come 'festa' per ridurre al minimo l'associazione avversa con la procedura di sonda gastrica. Il giorno 1, amministrare il terapeutico di interesse (preparata al punto 2.1) e adeguati controlli del veicolo. Nell'esempio fornito (Figura 6A), 5 mg di umana ricombinante (rh) iInterleukin (IL) -11 proteina è stato sciolto in 200 microlitri tampone fosfato (PBS) e somministrato ip Determinare i tempi e la frequenza delle amministrazioni, che saranno dipendenti dal profilo farmacocinetico stabilito per il reagente terapeutico che viene testato. Figura 1 delinea trattamento profilattico utilizzando iniezioni ip due volte al giorno nel corso dell'esperimento. Monitor, compresi consistenza delle feci e la presenza di sangue, e pesare ciascun topo giornaliera. Nei giorni di trattamento, di peso dovrebbe coincidere con la somministrazione del farmaco terapeutico per minimizzare stress per i topi provocati da manomissione ripetuta. </li> Il giorno 3, preparare 2,5% (2,5 g / 100 ml) soluzione DSS in acqua potabile regolarmente fornito ai topi dal stabulario. Circa 5 ml / mouse / è necessaria giorno di soluzione DSS per l'esperimento. Il consumo dell'acqua DSS può cambiare se la temperatura ambiente del stabulario oscilla. NOTA: DSS è un irritante e devono essere maneggiati secondo le istruzioni MSDS. Fornire DSS fresco al topi ad libitum in bottiglie di acqua pulita per 5 giorni consecutivi. La sera del giorno 5, fornire acqua potabile normale in aggiunta a pellet cibo purè e un integratore proteico fornito in piccole capsule di Petri (100 g pellet alimentari / 10 g frullato di proteine ​​/ 10 ml acqua). Questo previene la disidratazione e assiste minimizzando grave perdita di peso. Euthanize topi di CO 2 intossicazione e raccogliere i tessuti per la successiva analisi istologica, la mattina del giorno 8, o quando i topi vivono ≥15% perdita di peso per più di tre cgiorni onsecutive, a seconda di quale si verifica prima. NOTA: regolare la dose DSS tra il 1-4% (w / v) a seconda della microflora del stabulario e il lotto DSS. Effettuare, analisi per lotti di routine per stabilire il dosaggio DSS appropriato e variazione aggirare da lotto a lotto. Il dosaggio adeguato dovrebbe essere basata sulla perdita di peso (non superiore al 15% del peso originale) e confermato la colite istopatologia. 3. Pre-Trial clinico in una colite cronica o colite associata Cancer Modello Per il modello colite cronica cominciare dal punto 3.7. Per il modello di cancro colite associata (CAC), il giorno 1, iniettare ogni mouse con 10 mg / kg (w / w) azoxymethane (AOM, 250 ml, ip). NOTA: AOM è una sostanza cancerogena e deve essere maneggiato secondo le istruzioni MSDS. Le soluzioni madre di OMA sono preparati come 10 mg / ml aliquote e conservati a -20 ° C. Il giorno dell'iniezione, la soluzione madre AOM viene scongelato e diluito a 1 mg / ml in PBS. Congelamenti e scongelamenti ripetuti della soluzione madre AOM dovrebbero essere evitati. La dose AOM può essere regolato tra 8-12 mg / kg. Prove per lotto di routine è necessario per stabilire il dosaggio appropriato AOM per aggirare tossicità per topi a causa di variazioni da lotto a lotto. Durante i giorni 1-7 seguenti pesi amministrazione AOM saranno stabili e per questo motivo il monitoraggio di peso può essere omessi durante Giorni 1-7 per evitare manipolazione degli animali che espellono metaboliti citotossici nelle loro feci. Il giorno 7 tutte le lenzuola deve essere cambiato secondo procedure citotossici. Una volta che il cambio biancheria è completo, gli animali non richiedono più procedure di gestione citotossici, in quanto non saranno più solo eliminando i metaboliti citotossici. Il giorno 8, preparare 2,5% (2,5 g / 100 ml) soluzione DSS (come descritto nel passo 2.5) e fornire ai topi ad libitum. Pesare topi giornaliera tutto l'esperimento e monitor per segni di malattia, tra cui fu increspator, incurvando, feci sanguinolente e movimento ridotta. Il giorno 13, rimuovere la soluzione DSS e fornire i topi con acqua potabile normale fino al giorno 28. Giorni 8-28 costituiscono un 'ciclo' del protocollo cronica colite / CAC. Nei giorni 13-28, quando i topi sono dati normale acqua potabile, fornire i topi con pellet cibo purè e un integratore proteico fornito in piccole capsule di Petri (100 g pellet cibo / 10 g frullato di proteine ​​/ 10 ml acqua). Questo previene la disidratazione e assiste minimizzando grave perdita di peso. NOTA: Gli integratori di proteine ​​in poltiglia non devono essere fornite quando i topi stanno ricevendo DSS-contenente acqua potabile, al fine di garantire la coerenza dei consumi DSS. Il giorno 20 eseguire il secondo esame endoscopico per monitorare la salute individuale del mouse (vedi sezione 5). Il giorno 29 la ripetizione del ciclo di DSS (Ciclo 2: 2,5% (w / v) DSS fornito durante giorni 29-33 e acqua potabile normale durante giorni 34-50). Il giorno 40 eseguire il Third esame endoscopico per monitorare la salute individuale del mouse e determinare carico tumorale (vedi sezione 5). Se non tumori sono visibili mediante endoscopia il giorno 40, iniziare un terzo ciclo DSS nei giorni 50-72 (Ciclo 3: 2,5% (w / v) DSS fornito durante giorni 50-55 e acqua potabile normale durante giorni 56-72). Generalmente, i tumori sono visibili dal giorno 40 e quindi il terzo ciclo di DSS può essere omesso. Una volta che i tumori diventano visibili con l'esame endoscopico, assegnare ogni mouse un punteggio tumore endoscopica (vedi sezione 5) e assegnare singoli topi coorti con simili massa tumorale di base. Il giorno 42 (o quando i tumori sono visibili), gestire il composto terapeutico o controllo del veicolo in questione (vedi sezione 2.2). La tempistica delle dosi dipenderà dal profilo farmacocinetico della terapeutica. Un esempio di un trattamento di intervento iniettato ip tre volte alla settimana in topi con tumori stabiliti sono fornite (Figura 2). Eseguire eesami ndoscopic una volta a settimana per la durata del trattamento terapeutico di monitorare il carico tumorale. Generalmente, 4 settimane di un trattamento terapeutico è sufficiente osservare una risposta al trattamento obiettiva. Dopo la cessazione del trattamento, una coorte di topi può anche essere controllato da endoscopia per recidiva del tumore. Euthanize topi di CO 2 intossicazione e raccogliere i tessuti per l'analisi biochimica e / o istologico, la mattina del giorno 72 o quando i topi vivono ≥15% perdita di peso per più di tre giorni consecutivi, a seconda di quale si verifica prima. 4. Pre-Trial clinico in una sporadica cancro colorettale Modello Il giorno 1, iniettare ogni ip mouse con 10 mg / kg AOM (vedi punto 3.2). La dose AOM può essere regolato tra 8-12 mg / kg. Prove per lotto di routine è necessario per stabilire il dosaggio appropriato AOM per aggirare tossicità per topi a causa di variazioni da lotto a lotto. Ripetere l'iniezione il primo giorno di ogni settimanaper i seguenti 5 settimane (Figura 3). I topi devono essere trattati secondo le procedure di sicurezza citotossici per l'intero 6 settimane. Pesare ogni mouse sul giorno dell'iniezione AOM per ridurre al minimo disagio per i topi causati da un utilizzo ripetuto. NOTA: AOM è una sostanza cancerogena e deve essere maneggiato secondo le istruzioni MSDS. Tutti gli animali devono essere trattati secondo le procedure di sicurezza citotossici per le 6 settimane di AOM iniezioni ip necessari per questo protocollo. Durante la settimana 8 eseguire un esame endoscopico per monitorare i tumori emergenti (vedi sezione 5). L'esame endoscopico dovrebbe essere effettuata ogni due settimane fino a quando i tumori diventano visibili. In generale, wild-type C57Bl / 6 animali cominciano a sviluppare tumori di circa 40 settimane dopo la somministrazione iniziale di OMA. Una volta che i tumori diventano visibili con l'esame endoscopico, assegnare ogni mouse un punteggio tumore endoscopica (vedi sezione 5) e assegnare topi individuo a una coorte di simile massa tumorale prima dell'inizio del trattamento terapeutico. Durante la settimana 40 (o quando i tumori sono la prima visibile), gestire il composto terapeutico o il controllo del veicolo in questione. La tempistica delle dosi dipenderà dal profilo farmacocinetico della terapeutica (vedere la fase 2.1). Un esempio di un trattamento di intervento iniettato ip 3 volte alla settimana in topi con tumori stabiliti sono fornite (Figura 3). Eseguire endoscopica esame settimanale per la durata dei periodi di trattamento terapeutico per monitorare il carico tumorale. Generalmente, 4 settimane di un trattamento terapeutico è sufficiente per una risposta trattamento obiettivo. Dopo la sospensione del trattamento, una coorte di topi può anche essere controllato da endoscopia per recidiva del tumore. Euthanize topi di CO 2 intossicazione e raccogliere i tessuti per l'analisi biochimica e / o istologico del colon e tumori durante la settimana 45, oa seguito di 4 settimane di terapia. ve_title "> 5. esami endoscopici L'apparecchiatura endoscopia deve essere montato secondo le procedure standard 16. Sterilizzare e pulire la sonda dell'endoscopio con il 70% di etanolo o un lubrificante antibatterico. I video possono essere registrati con un computer portatile o desktop e il software multimediale standard, come iMovie. Un monitor di computer standard, piuttosto che un monitor grado medico, è sufficiente a visualizzare il colon durante la procedura endoscopica (Figura 4). Anestetizzare gruppi di 5-6 topi simultaneamente in una camera con 3% isoflurano in 100% O 2 ad una velocità di 0,2-0,4 L / min. Una volta che i topi sono anestetizzati, che è confermato da pizzico punta; i livelli di isoflurano dovrebbero essere modificate per 0,5-2% per la manutenzione. Rimuovere un individuo del mouse dalla camera, e posizionarlo lato ventrale con la testa fissata in un naso-cono. Anestesia complete devono essere monitorati e le zampe posteriori devono essere regolati in modo che siano stretched dietro il mouse. Mettere una pomata veterinario sugli occhi dei topi per prevenire la secchezza. Tenere la coda del topo dove incontra la colonna vertebrale inferiore a rivelare chiaramente l'ano. Inserire la guaina endoscopio rigido in un bicchiere di acqua e regolare il flusso d'aria per consentire lo svincolo di una piccola bolla alla volta. Il flusso d'aria permetterà colon per gonfiare. Se il flusso d'aria è troppo forte, l'aria viene pompata nello stomaco del mouse. Non è necessaria alcuna ulteriore lubrificazione. Inserire con cautela la guaina endoscopio rigido nel retto. In generale, l'endoscopio può essere inserito fino a 3 cm, a quel punto i due punti in curve topi e non è accessibile al endoscopio rigido. Una difficoltà comune durante le procedure di endoscopia è il blocco di accesso al lume del colon a causa di materia fecale. Evitare questo delicatamente massaggiare la pancia di topi prima della procedura per incoraggiare la defecazione, o accuratamente manovrando l'endoscopio intorno al Fecaquestione l durante la procedura. Peristalsi può anche verificare, durante la quale l'endoscopio deve essere tenuto in posizione fino muscolatura colon rilassa. Avviare la registrazione video in qualsiasi fase della procedura di endoscopia. Punteggio malattia può essere registrato da un assistente esperto durante la procedura, o in un punto secondo momento dai file video. Dopo l'esame endoscopico, restituire i topi alla loro gabbia e monitorarli durante il recupero dall'anestesia. Gli animali sono generalmente svegli e mobili entro 2 minuti dopo la rimozione dal isoflurane amministrare naso cono. Assicurarsi che queste procedure sono eseguite da uno scienziato esperto. Ogni procedura di endoscopia dura circa 2 min per mouse. 6. Malattia Scoring Per monitorare la colite, segnare video per la murino endoscopica Indice di colite Gravità (MEICS) 16, che documenta i cambiamenti nel (i) lo spessore della parete del colon indicato dalla trasparenza, (Ii) la consistenza delle feci, (iii) l'integrità dei vasi sanguigni e la presenza, (iv) ulcere e aree di rigenerazione che presentano in modo granulare, (v) sanguinamento indicati da fibrina depositi (figura 5a). Per monitorare il carico tumorale, segnare video per incidenza di tumori e le dimensioni. La dimensione del tumore è determinata dal diametro del lume del colon occupati dal tumore 16 (figura 5b). E 'comune usare entrambi i parametri colite e tumore punteggio per un singolo mouse. Utilizzando l'endoscopia, tumori individuali e la salute della mucosa del colon può essere monitorata nel tempo, fornendo una lettura-out per il successo di nuove terapie in un singolo animale. (Opzionale) I fermi immagine possono essere estratti dal video per la generazione di figure rappresentative (Figura 6).

Representative Results

La perdita di peso viene utilizzato come parametro standard per monitorare malattia associata con colite, che viene normalmente utilizzato per monitorare la salute generale dei topi. Gli animali in genere mantengono il loro peso, mentre DSS-contenente acqua viene somministrato, e cominciano solo a perdere peso quando sono restituiti ad acqua potabile normale. Parametri accettabili di perdita di peso devono essere fissati secondo comitato etico animali dell'istituzione. Per evitare disidratazione associata a diarrea prolungata, utilizzare la fornitura di routine di mash (pellets alimentari schiacciate e mescolato con acqua potabile) integrato con un frullato di proteine ​​in aggiunta alla normale acqua potabile. Come si possono utilizzare una anestesia alternativa, ketamina / xylazina o agenti similari, se l'apparecchiatura isoflurano non è disponibile. A causa della natura rigida dell'endoscopio, queste procedure consentono solo per la visualizzazione dei più distali 3 cm di colon mouse. Endoscopi più recenti con capacità (inclusi flessibilità e fluorescenza) sono disponibili a seconda delle esigenze dell'esperimento. Tuttavia, dato che gli effetti deleteri di DSS sono limitati principalmente al colon distale di topi, con lieve patologia osservata nel colon mezzo, l'endoscopio rigida non ostacoli controllo della salute mucosa dei singoli topi. Anche se si descrive un protocollo per il trattamento profilattico di acuta colite DSS-indotta, questo protocollo può essere facilmente modificato per testare strategie di trattamento di intervento. L'efficacia di un farmaco progettato per alleviare danno epiteliale e colite può essere monitorato longitudinalmente in singoli topi e quantificati in base ai parametri descritti punteggio (Figura 5). Questo è vantaggioso rispetto ai modelli tradizionali sperimentali, che richiedono abbattimento dei topi in punti temporali specifici durante il protocollo sperimentale, e non consente la caratterizzazione della risposta malattia ad un trattamento nel tempo. t "> studi clinici sull'uomo hanno evidenziato una notevole variabilità come diversi tumori in un singolo paziente rispondere ai trattamenti. Le procedure descritte qui forniscono un mezzo per controllare il carico tumorale complessiva, nonché la risposta al trattamento di tumori individuali nel corso di un esperimento. E 'importante considerare che i protocolli di intervento che si descrivono per i modelli di cancro non tengono conto degli effetti di una terapia su tumore iniziazione. protocolli di profilassi, con il trattamento previsto prima di quando i tumori diventano visibili mediante endoscopia, sono necessarie per ottenere tali informazioni. I protocolli descritti qui forniscono informazioni sugli effetti terapeutici sul sulla progressione (misurati dimensione del tumore) di singoli tumori. Tumor regressione può essere indicato anche da una riduzione del numero di tumori visibili. g "/> Figura 1:. Monitorare l'efficacia di una terapia trattamento profilattico in un modello di danno acuta del colon Il protocollo sperimentale (a) richiede otto giorni dall'inizio alla fine. Therapeutics vengono somministrati (b) dal giorno 1 per i trattamenti profilattici. DSS è fornita in acqua potabile (c) dal giorno 3 del protocollo sperimentale. Endoscopia viene eseguita (d) per monitorare la progressione della malattia negli animali. Timepoints suggerite includono Giorno 0 (non trattato) e 2 ° giorno (sorveglianza sanitaria), giorno 5 e 8 (per determinare il carico di malattia). L'esperimento viene terminato (e) al mattino del giorno 8. In un topo wild-type (f) la progressione della malattia aumenta nel tempo. Figura 2: Monitoraggio l'efficacia della terapia di intervento in un modello of colite associato cancro. Il protocollo sperimentale (a) richiede 72 giorni dall'inizio alla fine. Therapeutics (B) vengono somministrati a topi con tumori stabiliti dal Day 46 per i trattamenti di intervento. AOM (c) viene iniettato il giorno 1 e DSS è fornito in acqua potabile nel corso di tre cicli del protocollo sperimentale, iniziando il giorno 8. endoscopia (d) viene eseguita per monitorare la progressione della malattia in animali. Timepoints suggerite includono Giorno 0 (non trattato), Day 20 (sorveglianza sanitaria), e il giorno 40 (per gli animali del gruppo secondo il carico tumorale). Endoscopia viene eseguita settimanale nel corso del trattamento terapeutico per monitorare esiti della malattia. L'esperimento (e) termina la mattina del giorno 72. In una wild-tipo di mouse (f) il carico tumorale aumenta dal giorno 40 in poi. <img alt="Figura 3"src = "/ files / ftp_upload / 52.383 / 52383fig3highres.jpg" /> Figura 3:. Monitorare l'efficacia della terapia di intervento in un modello di cancro colorettale spontanea Il protocollo sperimentale (a) richiede> 50 settimane dall'inizio alla fine. Therapeutics (B) vengono somministrati a topi con tumori stabiliti per i trattamenti di intervento. AOM (c) viene iniettato il Giorno 1, e poi settimanalmente per 6 iniezioni consecutive nel corso del protocollo sperimentale. Endoscopia (d) viene eseguita per monitorare la progressione della malattia in animali. Timepoints suggerite includono Giorno 0 (non trattato) e Settimana 8 (monitoraggio del tumore) e bisettimanale lì dopo (per stabilire il carico tumorale). Endoscopia viene eseguita settimanale nel corso del trattamento per monitorare risultati terapeutici. L'esperimento (e) termina in settimana 50. In una wild-tipo di mouse (f) il carico tumorale aumenta da Settimana 40 in poi. </p> Figura 4:. Attrezzatura set-up The (a) set-up sperimentale per l'unità endoscopica, con i singoli pezzi di attrezzature indicati. L'endoscopio rigido (b), con i singoli componenti indicati. Scala bar = 2,5 centimetri. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 5:. Punteggio parametri di malattia di endoscopia Un profilo (a) del Murine endoscopica Indice di colite Gravità (MEICS). Cenni (b) dei singoli parametri del tumore di punteggio.es / ftp_upload / 52.383 / 52383fig5highres.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 6: trattamenti terapeutici Rappresentante Rappresentante di perdita di peso, immagini endoscopiche e spartiti per:. (A) Acute DSS-indotta danno della mucosa (b) I tumori che si sono sviluppate seguendo il protocollo / DSS AOM (c) I tumori che si sono sviluppate in seguito alla sequenziale.. protocollo AOM. N = 3 topi per gruppo. * P <0.05, *** P <0,001 (T-test di Student). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

I tre protocolli descritti metodi contorno di induzione affidabile e riproducibile di colon patologia malattia nei topi. In combinazione con il controllo endoscopico di routine e le strategie di intervento delineate qui, questi protocolli forniranno potente visione pre-clinico sull'efficacia di terapie. I nostri laboratori di routine usano tutti questi protocolli per monitorare il successo delle nuove terapie 10,23,24.

Ci sono una serie di considerazioni per la scelta di un modello animale preclinico per testare nuove terapie. Questi includono pertinenza del modello per la malattia umana, e il contributo del microambiente tumorale all'azione proposta del bersaglio terapeutico. Qui forniamo tre protocolli per un intervento terapeutico in modelli di malattia intestinale stabiliti. Questi modelli sono riproducibili e la consegna dei reagenti per indurre la malattia è facile da gestire. È importante sottolineare che i modelli sono molto importantia più sfaccettature e le fasi di colite insorgenza, e di iniziazione e la progressione tumorale. I ricercatori dovrebbero prendere in considerazione la background genetico dei ceppi di topi utilizzati nella progettazione di esperimenti, come la suscettibilità alla malattia indotta da DSS e / o AOM può variare notevolmente 25. Inoltre, diverse comunità microbiche possono avere capacità metaboliche differenti nel contesto di AOM, che viene metabolizzato dai batteri. Si avverte di non usare diverse coorti di topi che sono nati in diverse strutture di animali (compresi i fornitori commerciali) in un singolo esperimento. Allo stesso modo, la diversa microflora nei topi utilizzati da strutture diverse può suscitare diverse reazioni host DSS-indotta danni barriera epiteliale 11. Inoltre, l'analisi del caso di tessuto (per esempio la purificazione RNA) dovrebbe essere considerato, in quanto la capacità di DSS di inibire la trascrittasi inversa avrà un impatto sulla successiva analisi molecolare 26,27.

<p class = "jove_content"> endoscopia Mouse è una tecnica all'avanguardia per monitorare ripetutamente l'insorgenza della malattia e la progressione in un individuo mouse. La possibilità di registrare video e estrarre le immagini ancora permette un facile monitoraggio di molteplici parametri di malattia e tumori. Oltre a migliorare il benessere degli animali, controllo endoscopico riduce anche la necessità di più coorti di topi sperimentali, che tradizionalmente sono stati abbattuti a diversi punti temporali per monitorare esito della malattia. Il sistema di punteggio MEICS non è un sostituto per l'analisi istopatologica, ma fornisce un mezzo alternativo per monitorare danni alla salute degli animali e delle mucose in topi vivi. Endoscopia Mouse è una tecnica di laboratorio specializzato, e tutte le procedure deve essere eseguita da personale specializzato per garantire manipolazione e di trattare i topi, così da fornire una qualità costante nelle immagini utilizzate per il punteggio malattia. Nelle mani di personale qualificato, abbiamo scoperto che l'endoscopia induce poco o nessun danno al Tumors che causerebbero emorragia intra-tumorale. Per i protocolli terapeutici delineati, consideriamo endoscopia molto vantaggioso, in quanto fornisce un modo per determinare il carico tumorale iniziale, e ci permette di coorti di gruppo di animali con massa tumorale simili prima della somministrazione di un farmaco terapeutico. Monitoraggio sequenziale dei topi consente ai ricercatori di determinare l'efficacia di nuove terapie presto, con la possibilità di terminazione esperimenti falliti in modo tempestivo.

Come la nostra comprensione della malattia infiammatoria intestinale e tumori del colon-retto anticipo, saranno individuati nuovi bersagli per la terapia. Modelli animali appropriati saranno parte integrante di garantire che i nuovi più promettenti terapie sono spostati verso le sperimentazioni cliniche.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank CSL Ltd. for supporting the purchase of the endoscopy equipment. The research in the laboratory of ME is supported by the Ludwig Institute for Cancer Research, and the laboratories of TP and ME are supported by the Victorian State Government Operational Infrastructure Support and the National Health and Medical Research Council of Australia. ME is an NHMRC Senior Research Fellow.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Dextran Sulfate Sodium (MW 36,000-50,000) MP Biochemicals 160110 Requires batch testing.
Azoxymethane Sigma A5486-100MG Requires batch testing.
Vanilla Protein Shake N/A N/A Available from hospital pharmacies.
Isoflourane PPC M60303 This is a restricted reagent, which should be stored under lock and key.
70% Ethanol N/A N/A Standard lab reagent.
Coloview miniendoscopic system
Endovision Tricam Karl Storz 20212001-020
Xenon 175 light source with anti-fog pump Karl Storz 20134001
HOPKINS straight Forward Telescope Karl Storz 64301AA
Endoscopic Sheath (total diameter 3 mm) Kalr Stroz 61029C
Fubre Optic Light Cable Kalr Stroz 69495ND
Computer and media player software MAC, imovies
Scale Any Any scale suitable for weighing mice.
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Referencias

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Ernst, M., Preaudet, A., Putoczki, T. Non-invasive Assessment of the Efficacy of New Therapeutics for Intestinal Pathologies Using Serial Endoscopic Imaging of Live Mice. J. Vis. Exp. (97), e52383, doi:10.3791/52383 (2015).
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