幹細胞由来の中枢神経系ニューロンのネットワーク化培養における生物学的神経毒の機能評価

ESCの1。適応は、無細胞浮遊培養をフィーダ 37℃で融解したESC氷のスライバーが残るまで。 10 6は、予め温めESC培地10mlを含有する非組織培養処理皿にESCの解離×2.5 – P1000ピペットを用いて、穏やかに1を転送する。 37℃で20時間、5％CO 2加湿組織培養インキュベーター中でインキュベートする。 20時間後、静かに10ミリリットルの血清学的ピペットを用いて15ミリリットルコニカルチューブに懸濁培養を転送することによって細胞を洗浄。 200×gで3分間ペレットのESC。スピン中、低接着性ディッシュに戻って新鮮なESC培地10mlを追加します。 上清を吸引し、細胞ペレットを追い出し回避し、細胞ペレットに1ミリリットル新鮮なESC培地を追加するように注意しながら。 P1000ピペットを用いて細菌の皿に細胞を移し、インキュベーターに戻す。 凝集体が肉眼で（通常は4に見えるようになるまで毎日細胞を守って – 8日間（d）前記凝集体は0.2になります- 0.5ミリメートル）。凝集体が4日後に明らかでない場合は、ステップ1.3を繰り返します。凝集体が見えたら第2節で説明したように、ESCのを解離し、維持する。 2. ESC継代とメンテナンス ESCは、滅菌10ミリリットルピペットを用いて、15​​ミリリットルコニカルチューブに集約し転送し、凝集体がコンパクトなペレットにセトリングさせる（通常は3から5分）。 、上清を吸引し、細胞ペレットを破壊しないように注意しながら、そして5ミリリットルのPBSで凝集体を洗う。重力沈降が2.5分間100×gで、代わりにペレット細胞を推奨しますが代わりに時間を節約する。 吸引しPBSおよび500μlのトリプシンを追加します。 37℃の水浴中で3分間、トリプシン中で凝集体をインキュベートする。トリプシンを希釈し、ゆっくりと凝集体を破壊するためにP1000ピペットで10回粉砕するために500μlのESC培地を追加します。血球計数器を用いて細胞を数える。 ペレットを、1.0の最終濃度で200×gで再懸濁した細胞で3分間、細胞を解離ESC培地中×10 7細胞/ ml。 10センチメートル細菌皿に新鮮なESC培地10mlに150μlの（1.5×10 6細胞）を移し、48時間組織培養インキュベーターに戻す。過剰のESCを区別することができる、1で凍結保存- 90％のESC培地中の5×10 6細胞/ mlの10％DMSOを補充し、または廃棄した。 通路は48時間ごとに集約します。通過させるための準備ができて凝集体は、直径が0.5mmを超えると、はっきりと見えるようになります。 注： – 1.4凍結保存し、サスペンション適応細胞の解凍と文化はステップ1.2あたりに達成される。 72時間 – 凝集体は、48内に継代するための準備が整います。 3.神経分化注： – 正午後に事前の正午とステップ3.7に3.5行動は3.1を繰り返します。分化手順の概要は、 図1Aに示されている。 2.5 – 手順2.1のようにESCのを解離。解離の譲渡を350μl（3.5×10 6）25ミリリットル分化培地を含む10センチメートル低接着ディッシュにdのESCは。 5％のCO 2で37℃で組織培養インキュベーター内部の45回転- 30に設定オービタルシェーカー上に置きます。これは、分化の最初の日、 体外 （DIV） で呼ばれる日です-8。 注：超低付着性皿の使用は、方法のコストを増加させるが、凝集体が時折ペトリ皿に付着することができるので、細菌のペトリ皿よりも僅かに大きな収量を生じる。別の皿のサイズが好ましい場合、培地容積および細胞数はそれに応じてスケーリングすることができる。 48時間（DIV -6）した後、50ミリリットルコニカルチューブに分化細胞集合体を転送するために25ミリリットルピペットを使用しています。すぐにペトリ皿に分化培地の新鮮な25ミリリットルを追加します。 深さ2mm – 1で目に見えるペレットを生産、5分 – 凝集体は2オーバーを解決できるようにします。単一細胞または懸濁液中に残っている小さな凝集を無視します。慎重に培地を吸引し、CEを転送LLバックP1000を使用してペトリ皿にペレット。組織培養インキュベーター中でロータリーシェーカー上に置きます。 DIV -4繰り返しステップ3.2で。 4mmの深い – ペレットは2になります。ペトリ皿に6μMオールトランスレチノイン酸（RA）を補充した30ミリリットルの分化培地を交換してください。さらに48時間、組織培養インキュベーター中でロータリーシェーカーに戻る。 DIV -2繰り返しステップ3.3で。この時点で、深さ8mm – ペレットは4になります。 DIV -1で、第4節のように、めっき表面を準備する。 組織培養フード中で10分間置き – DIV 0、5、37℃で等分し、事前および凍結NPCのトリプシン処理培地5mlを解凍する。 50ミリリットルコニカルチューブに凝集体を区別する25ミリリットルピペット、転送を使用して。凝集体が沈降し、慎重に培地を吸引できるようにします。ウォッシュは、凝集体が洗浄の間に沈降させ、10ミリリットルPBSで2回ペレット。 第二PBS洗浄した後、ペレットにNPCのトリプシン処理培地5mlを追加し、37でインキュベート6; 5分間C。静かに2.5分後にチューブをフリック。 トリプシンを不活性化し、反転させて混合する0.1％ダイズトリプシンインヒビター（STI）の5ミリリットルを追加します。比較的均質な細胞懸濁液が生成されるまで10ミリリットルの血清学的ピペットで15回 – 優しく10を粉砕する。 ゆっくりと50ミリリットルコニカルチューブの上部に配置された40μm以上70μmのセルストレーナーに細胞懸濁液を移す。すべての懸濁液を濾過された後、フィルタを介して、残りの細胞を洗浄し、200×gで6分間の解離細胞懸濁液をペレット化するN2培地の1ミリリットルを追加します。 ペレットを乱すことなく、培地を吸引。 200×gで5分間、細胞をペレット化し、P1000と洗浄の間に粉砕する、10ミリリットル、N2培地で2回細胞を洗浄。第二の洗浄に先立ち、血球計数器を用いて細胞を数える。 200,000細胞/ cm 2を – 150,000細胞密度でミリリットルとプレートのESNあたり1×10 7細胞でのN2培地中で細胞を再懸濁。 PLAT新たに転送加湿した37℃の組織培養インキュベーターと5％のCO 2へのEDのESNと第5節のように維持する。 4. DIV 0でメッキ神経前駆細胞の培養表面の準備メッキに少なくとも1日の前に、組織培養処理した料理を準備します。でN /組織培養処理プラスチック皿をカバーし、Oをインキュベートするか、またはポリ-D-リジン（滅菌H 2 O中の100μg/ mlのPDL）;十分なポリエチレンイミン（滅菌H 2 O中の25μgの/ mlのPEI）を追加37℃。 メッキの朝は、二重蒸留H 2 Oで二回皿を洗うと一回PBSで。最終洗浄後、ディッシュ（ 例えば、12ウェル皿のウェル当たり1mlまたは6 cmディッシュあたり4 mL）をカバーするのに十分なN2培地を加える。 少なくとも一日前ニューロンメッキに18ミリメートルのカバーガラスを準備します。 4分間のプラズマクリーニングによるクリーンカバースリップ。 すぐに底部にエタノール洗浄パラフィルムに清掃カバースリップを転送大型無菌皿に、ステップ4.1のように調製PEIまたはPDL溶液400μLを、追加します。組織培養インキュベーター中、37℃でO / Nインキュベートする。 午前中に、洗浄水で3回カバースリップ1 PBS中5μg/ mlのラミニンを追加 – 37°Cで3時間。ニューロンを解離する前に、上に向けて処理面を維持することを確認され、NPC培地1mlを含む12ウェル皿のウェルにカバースリップを転送し、すぐにラミニンを吸引して。 37℃での店舗の料理とカバーガラスのNPCをプレートに準備ができるまで。 ニューロンの5.メンテナンスとDIV 1、吸引媒体では、N2培地と交換してください。 DIV 2時と4、吸引媒体及びB27培地と交換してください。 DIV 8、吸引中でと非神経細胞を汚染除去するために有糸分裂阻害剤を含有するB27培地と交換してください。 DIV 12で、B27培地と交換してください。 DIVを削除しないでください直前まで、5％のCO 2から12 +のESNに使用する。 ミニチュア興奮ポストシナプス電流を定量化するためのシナプス伝達（MIST）アッセイの6の測定阻害 注意 ： – 1 NG / kgのクロストリジウム神経毒は、0.1と低く、推定人間LD 50値で、知られている最も有毒物質である。これらの毒素を使用して、適切な予防策を使用する前に必要な承認を取得します。 慎重のBoNT / AがESN培地と37ºCに暖かいで所望の最終濃度を100倍に希釈する。 、DIV 21 + ESN培養物に毒素の適切なボリュームを追加し、培養皿を旋回し、インキュベーターに戻す。 細胞は中毒後に4つ以上の時間を解析する場合には、そのような直接インキュベーターのように、または一定のCO 2チャンバー内で、5％のCO 2から取り外すことなく、料理やスワールに毒素を追加します。 適切な時点で、ASPIRAテESN培養培地および細胞外の記録液（ERB）で2回洗浄する。 ERBの4ミリリットルを追加します。それぞれ、活動電位を遮断し、GABA A受容体の活性に拮抗する、5.0μMテトロドトキシン及び10μMのビククリンを補った。 電気生理学リグに料理を転送します。どちら灌流も温度制御はMISTアッセイに必要とされる。 抵抗の5-10mΩの持つ記録ピペットを生成し、細胞内記録用緩衝液で埋めるためにマイクロピペットプラーを使用してホウケイ酸ガラスを引き出します。静かに記録前に試薬をシリコン処理で満たされた記録ピペットを浸し。 記録ピペットがERBに低下するように空気で満たされた注射器を用いて、正の圧力を提供する。優しく記録するニューロンの細胞体上の記録ピペットを着陸した後、正の圧力を削除し、ギガシールを形成する。 mVの-70に保持電圧を下げる。全細胞構成に侵入する負圧を慎重に適用する。 監視し、静止膜電位記録するために、電流クランプに切り替えます。液体ジャンクショ​​ン電位の調整がなければ、静止膜電位は-67 -82 mVの間であろう。 ミニチュア興奮性シナプス後電流（mEPSCs）を検出するために5分 – 4連続-70 mVの電圧クランプ記録を行います。 次の設定でスパイク検出ソフトウェアを使用してmEPSC検出のための記録されたデータの4分の分析：しきい値、5;期間が極大を検索するには、万秒。ベースラインのピークまでの時間、5000マイクロ秒。減衰時間を検索する期間は20,000秒。ピークの割合は、0.37の減衰時間を見つけるために。ベースライン、千秒を平均化する時代。面積閾値、20;平均ピークにポイント数、1。ピークの方向、負。 収集し、検出されたイベントについての情報を保存します。 HzでmEPSC周波数を決定するために240によって4分で検出されたイベントの数を割ります。 12 CONT – 8 mEPSC周波数を収集rolsと8 – 各露光条件のための12のBoNT処理サンプル。年齢および多くをマッチさせた対照に対して周波数を分析します。一方向ANOVA試験及びDunnettの事後試験を用いてシナプス活性の阻害％の統計的有意性を決定します。