Методов оценки цитотоксичности и подавления иммунитета горючих Табачные компонентов Продукт
Summary
Using optimized human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) ex vivo assays, we showed that a combustible tobacco product preparation markedly suppresses receptor-mediated intracellularly secreted cytokines and cytolytic ability of effector PBMCs. These rapid assays may be useful in product evaluation and understanding the potential long-term effects of tobacco exposure.
Abstract
Среди других патофизиологических изменений, хроническое воздействие табачного дыма вызывает воспаление и подавление иммунитета, которые были связаны с повышенной восприимчивостью курильщиков микробных инфекций и возникновения опухолей. Экс естественных подавление рецепторов-опосредованной иммунной реакции в мононуклеарных клетках периферической крови человека (РВМС) обрабатывали компонентов дыма является привлекательным подходом для изучения механизмов и оценки вероятных долгосрочных последствий воздействия табачных изделий. Здесь мы оптимизировали методы для выполнения экс анализов крысах с МНПК, стимулированных бактериального липополисахарида, в Toll-подобных рецепторов 4 лиганда. Последствия всего табачного дыма кондиционированной среды (WS-КМ), подготовка горючих табачных изделий (ТЭС) и никотин были исследованы на секрецию цитокинов и убийства клетки-мишени путем МНПК в бывших естественных условиях анализов. Показано, что цитокины, секретируемые IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6, и IL-8 и внутриклеточные цитокины IFN-47 ;, TNF-α и MIP-1α были подавлены в WS-CM-инфицированными МНПК. Цитолитическая функции эффекторных РВМС, как определено в К562 клеток-мишеней погибли анализа также была снижена путем воздействия WS-МС; Никотин минимально эффективными в этих анализах. Таким образом, мы представляем набор усовершенствованных анализов для оценки последствий ТЭС в бывших естественных условиях анализов, и эти методы могут быть легко адаптированы для тестирования других продуктов, представляющих интерес.
Introduction
Значительный объем пунктов знаний к неблагоприятным последствиям для здоровья хронического курения сигарет, в том числе сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) и рак 1,2. Хронический курение, как известно, вызывают воспаление и подавление иммунитета, и эти изменения отражаются внести свой вклад с повышенным риском микробной инфекции и рака у курильщиков 3. В пробирке и бывших естественных условиях методы полезны при выяснении молекулярных основ патофизиологических эффектов сигаретный дым 4-9 (Таблица 1), и признаются в качестве важных инструментов для направления формирующегося регулирование различных табачных изделий 10,11.
Например, мы показали, что горючие вещества табачных изделий (ТЭС), такие как всей табачного дыма кондиционированной среды (WS-КМ) и общей твердых частиц (TPM) значительно более токсичным и разрушительным дляДНК, чем негорючих ТЭС или никотина 12,13. В соответствии с опубликованной работы, это было недавно сообщили, что горючие ТЭС или никотин 12,13. В соответствии с опубликованной работы, мы недавно сообщили, что горючие ТЭС вызвало заметное подавление иммунитета. Это свидетельствует подавлением Toll- подобный рецептор (TLR) -ligands, секрецию цитокинов и клеток-мишеней (K562) убийство по МНПК в Экс Vivo модели 14. Учитывая значимость воспаления в сигаретном болезненных процессов дыма, вызванного, дальнейшая оптимизация условий анализа для оценки иммунной модулирующие эффекты сигаретного дыма представлены в данном отчете.
Экс естественных условиях анализы обычно измеряют внутриклеточный и секретируется цитокины, а также цитолитическую функцию цитотоксических Т и NK клеток в К562 гибели клеток анализы 14. Анализы участвует предварительной инкубации с WS-МС и никотина и последующей стимуляцией РВМСс с TLR агонистов в течение 3 дней; окончательные показания выполняются с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) и / или проточной цитометрии. Мы использовали бактериального липополисахарида (ЛПС), который связывается с TLR-4 рецепторов и стимулирует РВМС в результате чего производство внутриклеточных цитокинов и секреции цитокинов. В дополнение к оптимизации различных аналитических шагов для оценки иммуномодулирующее действие ТЭС, мы также представляем методы выделения МНПК гибель клеток анализов и IL-8 количественной оценке. Эти методы могут быть применены для решения других вопросов исследования и уточнены оценки табачные изделия в контексте регулирования.
Таблица 1. Опубликованные отчеты в пробирке и бывших естественных условиях методы, используемые для изучения varilus патофизиологические эффекты препаратов табачных изделий CS, сигаретный дым средой.; CSC, сигаретный дым конденсата; CSE, сигаретный дым экстракт; ELISA, иммуноферментный анализ; GADPH, глицеральдегид 3-фосфатдегидрогеназы; КПЦР, количественной полимеразной цепной реакции; RT, в режиме реального времени количественной полимеразной цепной реакции; TS, табачного дыма.
| Автор (год обучения) | Лан и др. (2004) | Муди и др. (2004) | Олтманс и др. (2005) | Vayssier (1998) | Witherden и др. (2004) | Birrell и др. (2008) |
| Клетки используется | Человека бронхиальных клеток эндотелия (BEAS-2B), нейтрофилы человека | Человека эпителиальные клетки (А549) | Гладкой мускулатуры дыхательных путей клетки человека (HASMC) | Человека premonocytic U937 клетки, моноциты человека | Альвеолярного типа II эпителиальные клетки (ATII) | Человек моноцитовклеточной линии (ТНР-1), легочные макрофаги человека |
| ТЭЦ используется | CSE | CSC | CSE | TS | CSE | CS |
| Метод, используемый | ИФА, КПЦР, миграция, электромобилей сдвиг | Immunohisto, автохимия, электрофорез, ArrayScan комплект, RT-PCR, ELISA | ИФА, ПЦР, КПЦР, электрофорез | Сдвиг гель-мобильность | Световая микроскопия, электронная микроскопия, электрофорез, ELISA | КПЦР, ИФА, E-toxate комплект (Sigma), p65 планшете (TransAm), электрофорез, различные наборы для иммуноанализа |
| Мера | ИЛ-8, GM-CF, AP-1, NF-kB, миграция | Гистонов ацетилтрансферазы, гистондезацетилаз, NF-kB, IL-8, П. И. κB-α, GADPH | HO-1, GADPH, RANTES, ИЛ-8, эотаксин | Тепловой шок / стрессовые белки (HSP / Hsp70), HF транскрипционный фактор, NF-kB,ФНО-α | Поверхностно-активное вещество белок (SP-A, SP-C), ИЛ-8, МСР-1, GRO-α, ФНО-α, ИЛ-1β, IFN-γ | IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α, МАРК / JNK / ERK фосфорилирования, cJUN: связывание с ДНК, глутатион, p65: связывание с ДНК |
| Конечный результат | CSE вниз регулирует выработку цитокинов путем подавления AP-1 активации. | H 2 O 2 и CSC повышения ацетилирование гистонов белков, снижение гистонов дезацетилазы деятельность, дифференциально регулировать провоспалительных релиз цитокинов. | Сигаретный дым может вызвать высвобождение IL-8 из HASMC, усиливается TNF-α, 20% CSE меньше IL-8-релизе, подавление эотаксина и RANTES сигаретного дыма. | TS активированный фактор HF транскрипции, который был связан с Hsp70 гиперэкспрессией и торможения NFkB связывания активность и TNF-α-релиз. | Снижение ATII уровни хемокинов клеток получают компромисс AlveoLAR ремонт, способствуя сигаретного дыма, вызванного альвеолярного повреждения и эмфиземы. | Данные предоставить механистическое объяснение, почему курильщики обострение респираторных инфекций. Подавление врожденной ответ сопровождается увеличением IL-8. |
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы и другие ранее продемонстрировали, что лечение МНПК с ТЭС подавляет несколько ответов, в том числе экспрессии и секреции цитокинов и функциональных мер, таких как клетки-мишени убийство 14. Экспериментальные методы, описанные в предыдущей работе требуют более долгий инкубацио?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансируется RJ Reynolds Tobacco Company (RJRT) под соглашение о сотрудничестве исследований с Wake Forest University школы медицины. GL Прасад полный рабочий день сотрудник RJRT.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 12 X 75 tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| 2 mL Microtubes | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 3R4F reference cigarettes | Univ. of Kentucky, College of Agriculture | 3R4F | |
| 50 ml conical tubes | Corning | 430828 | |
| 500 ml bottle | Corning | 430282 | |
| 7AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| 96 well flat bottom plate | Termo Nunc | 439454 | |
| 96 well round bottom plates | BD Falcon | 353077 | |
| Cell culture hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 58110R | |
| CFSE | Molecular Probes Life Technologies | C34554 | |
| Cluster tubes | Corning | 4401 | Harmful if swallowed, carcinogen |
| Cytofix/Cytoperm (Permwash) | BD Biosciences | 555028 | Flammable |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide ) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FCAP Array | BD Biosciences | 652099 | Software analyzes CBA data |
| Filter unit | Nalgene | 156-4020 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Canto II | 8 colors, at Ex 405 and Em785. |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Calibur | 4 colors at Ex 495 and Em 785. |
| Flow cytometry analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Freezing Container | Nalgene | 5100-0001 | Contains DMSO, irritant |
| GogliPlug | BD Biosciences | 555029 | Carcinogen, Irritant, Corrosive |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Human Inflammatory Cytokine Kit | BD Biosciences | 551811 | |
| IFN-γ V-500 Antibody | BD Horizon | 561980 | skin sensitizer |
| IL-8 ELISA Kit | R and D Systems | DY208 | |
| Isolation Buffer | Isolymph, CTL Scientific Corp. | 1114868 | Flammable liquid, Irritant |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| L-Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| MIP1-α PE Antibody | BD Pharmingen | 554730 | Acute toxicity, Oral |
| Monensin | Sigma-Aldrich | M5273 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | Acute toxicity, Environmental hazard |
| Parafilm | Bemis | “M” | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Flammable, Skin irritation |
| Pen/strep | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Running buffer | MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech | 130-091-221 | |
| Th1/Th2 CBA Kit | BD Biosciences | 551809 | |
| TNF-α Alexa Fluor 488 Antibody | BioLegend | 502915 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
Referencias
- . . How Tobacco Smoke Causes Disease: The Biology and Behavioral Basis for Smoking-Attributable Disease, A Report of the Surgeon General. , (2010).
- Zeller, M., Hatsukami, D. The Strategic Dialogue on Tobacco Harm Reduction: a vision and blueprint for action in the US. Tob. Control. 18, 324-332 (2009).
- Sopori, M. Effects of cigarette smoke on the immune system. Nature Reviews Immunology. 2, 372-377 (2002).
- Birrell, M. A., Wong, S., Catley, M. C., Belvisi, M. G. Impact of tobacco-smoke on key signaling pathways in the innate immune response in lung macrophages. J. Cell Physiol. 214, 27-37 (2008).
- Laan, M., Bozinovski, S., Anderson, G. P. Cigarette smoke inhibits lipopolysaccharide-induced production of inflammatory cytokines by suppressing the activation of activator protein-1 in bronchial epithelial cells. J. Immunol. 173, 4164-4170 (2004).
- Moodie, F. M., et al. Oxidative stress and cigarette smoke alter chromatin remodeling but differentially regulate NF-kappaB activation and proinflammatory cytokine release in alveolar epithelial cells. Faseb J. 18, 1897-1899 (2004).
- Oltmanns, U., Chung, K. F., Walters, M., John, M., Mitchell, J. A. Cigarette smoke induces IL-8, but inhibits eotaxin and RANTES release from airway smooth muscle. Respir. Res. 6, 74 (2005).
- Vayssier, M., Favatier, F., Pinot, F., Bachelet, M., Polla, B. S. Tobacco smoke induces coordinate activation of HSF and inhibition of NFkappaB in human monocytes: effects on TNFalpha release. Biochem. Biophys. Res. Commun. 252, 249-256 (1998).
- Witherden, I. R., Vanden Bon, E. J., Goldstraw, P., Ratcliffe, C., Pastorino, U., Tetley, T. D. Primary human alveolar type II epithelial cell chemokine release: effects of cigarette smoke and neutrophil elastase. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 30, 500-509 (2004).
- Hatsukami, D. K., Biener, L., Leischow, S. J., Zeller, M. R. Tobacco and nicotine product testing. Nicotine Tob. Res. 14, 7-17 (2012).
- Ashley, D. L., Backinger, C. L., van Bemmel, D. M., Neveleff, D. J. Tobacco Regulatory Science: Research to Inform Regulatory Action at the Food and Drug Administration’s Center for Tobacco Products. Nicotine Tob. Res. , (2014).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Bombick, B., Borgerding, M. F., Prasad, G. L. Evaluation of cytotoxicity of different tobacco product preparations. Regul. Toxicol. Pharmacol. 64, 350-360 (2012).
- Gao, H., Prasad, G. L., Zacharias, W. Differential cell-specific cytotoxic responses of oral cavity cells to tobacco preparations. Toxicol In Vitro. , (2012).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Prasad, G. L. Combustible and non-combustible tobacco product preparations differentially regulate human peripheral blood mononuclear cell functions. Toxicol. In Vitro. 27, 1992-2004 (2013).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research. Cryo Letters. 33, 376-384 (2012).
- Schmid, I., Krall, W. J., Uittenbogaart, C. H., Braun, J., Giorgi, J. V. Dead cell discrimination with 7-amino-actinomycin D in combination with dual color immunofluorescence in single laser flow cytometry. Cytometry. 13, 204-208 (1992).
- Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J. Immunol. Methods. 325, 51-66 (2007).
- Taga, K., Yamauchi, A., Kabashima, K., Bloom, E. T., Muller, J., Tosato, G. Target-induced death by apoptosis in human lymphokine-activated natural killer cells. Blood. 87, 2411-2418 (1996).
