현지화 된 조직 병리학 적 분석을위한 망막 보철물로 이식 된 가공 눈을위한 기술 : 파트 망막 끌어 올릴 2 망막 임플란트
Summary
Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.
Abstract
Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.
Introduction
색소 성 망막염 (RP)는 신경 활동으로, 광자의 형태로, 광 열 변환 할 책임이 망막의 최 외층에있는 광 수용체 세포의 광범위한 손실을 일으키는 유전 질환이다. 중요한 것은, RP 환자는 일반적으로 여전히 작동 그들의 망막의 다른 층에 잔류 신경 세포가있다. 망막 보철물 시각적 통로 1,2- 활성화와 전기 자극이 신경 세포 생존을 대상으로 환자에게 어떤 시각을 복원 할 수있다. 임상 시험에서 지각 결과는 초기 결과를 약속 보여 최근 일부 장치는 상업적 목적으로 승인되었습니다. subretinally 5, 6 및 suprachoroidally 7,8 epiretinally 3,4 : 현재 세 가지 주요 해부학 임상 망막 보철이 배치되어있는 위치가있다. 다른 장치는 다른 재료를 활용하여 자신의 양식은 사용자 정의됩니다그들은 주입되는 위치. 하지만, 그들 모두는 전기 펄스와 망막 뉴런의 잔류를 활성화하여 시각적 지각 표상을 만든다.
어떤 의료 보철물 때문에 초기 배치의 영향이나 기계적 이후 지속적인 힘 주변 조직 손상시킬 수있는 가능성이있다. 망막 이식 보철물 같은 자극의 경우에서, 전기 파라미터는 안전 한계 내에 있어야 추가적인 고려 사항이있다. 환자의 안전이 가장 중요하므로 장치는 엄격하게 임상은 9-15 설정에 진출하기 전에 임상 연구에서 테스트해야합니다. 우리 컴패니언 글에서는 맥락막 상강 공간 (16) 내에 위치 임플란트 주변의 눈 국소 조직 병리학을 평가하기위한 방법을 설명했다. 본 논문에서는 (FE를 임상에서 epiretinally 망막 식은 전극 어레이를 둘러싸는 눈 조직 시각화 기법을 서술라인) 모델 (그림 1).
망막 위치는 시각적 보철물을 찾기위한 가장 일반적으로 이용되는 위치이다. 여기에 위치한 전극 어레이는 전형적으로 17-20 눈의 모든 층을 관통하는 금속 압정 망막에 부착된다. 앞서 본 원고에 기재된 기술로, 정확하게 망막 즉시 압정을 둘러싼 다른 조직을 평가하기 어려웠다. 중성 포르말린을 사용하여 표준 눈을 고정으로 인해 택의 고정 점에 대한 망막과 공막의 차동 운동에 인공적인 망막 손상의 결과. 따라서 택 및 망막 배열로 인해 발생한 실제 손해를 정확하게 관찰 할 수 없습니다. 금속 물체가 용이하게 기존의 조직 학적 장치로 절단 할 수 없으므로 또한, 눈 조직 절편 것은 시츄 망막 압정 수행 될 수 없었다; 조직 학적 처리도되기 전에 택을 제거이것은 또한 인공적인 망막 손상에지도로 바람직하지 않은.
본 연구의 목적은 두 가지였다 : 택 및 망막 임플란트 배열로 인한 손상이 안정적으로 평가 될 수 있도록 1) 망막 박리의 유물을 줄이기 위해; 2) 삭제하지 않고 압정에 인접한 망막 구조를 시각화. 인공적 망막 박리를 감소시키고, (컴패니언 제 16의 설명 참조) 한 목적을 달성하기 위해, 새로운 고정술들이 이용 하였다. 이 목적을 달성하기 위해, 우리는 연삭, 원래 인공 와우 전극 21-23 원위치 관찰에 대한 기술 개발을, 연마, 임베딩 변성. 인공적 망막 손상을 최소화하고, 따라서 망막 택 및 배열로 인한 잠재적 인 손상의 정확한 평가를 허용하면서,이 원고에 기재된 방법은 반응계 내에서 가용 접 주변 망막의 가시화를 허용 인접.
Protocol
Representative Results
Discussion
표준 조직 학적 기법으로 인해 금속, 유리 또는 다이아몬드 블레이드 이러한 개체를 절단의 제한 현장에서 하드 금속 임플란트를 처리 할 수 없습니다. 우리 컴패니언 용지 (16)에서는 개질 전체 눈 고정술의 사용은 인공적 망막 박리를 낮출 수있는 것으로 나타났다. 현재 원고에서, 연삭 설립 및 현장에서 21 ~ 23 망막 보철에 대한 수정 된 인공 와우 이식을 시각화 기술을 연마. 망막에 전극 배열을 확보하는 데 사용되는 티타늄 압정은, epiretinally, 주변의 눈 조직과 함께 에폭시에 포함되었다. 이 수지 블록이어서 금속 압정에 바로 인접 조직 형태를 공개하기 위해 적절히 방향이 점진적 접지 / 연마 하였다. 다양한 깊이에서 블록의 광택 표면의 이미지는 강력한 해부 현미경으로 촬영되었다. 비쥬얼과 evaluat :이 기술은 유용하다망막 임플란트에 인접한 조직 반응을 보내고; 임플란트의 이식과 관련된 수술 외상을 평가하는 단계; 경질 금속 성분에 생물학적 반응을 결정하는 단계; 임플란트 및 망막의 표면 사이의 거리를 측정한다.
이 기술은 눈의 망막 또는 다른 하드 압정 (예, 금속) 개체에 인접한 영역의 동일계 시각화에 대한 미래의 안전성 시험에서 유용 할 것이다. 이 epiretinally 망막에 압정으로 고정 보철물의 전임상 안전성 평가에 직접 응용 프로그램을 가지고있다. 또한 서브 망막 위치에 임플란트 접촉 영역에서 망막 조직 손상을 평가하기에 유용 할 수있다.
기술이 제대로 수행되었는지 확인하는 방법은 여러 가지가 있습니다. 각 단계에서, 망막은 눈의 외부 층에 부착 된 상태로 유지한다. 총 인공적 망막 박리가 발생했을 경우는 인도어 수도고정에 문제를 먹었다. 샘플 및 매립 블록의 연삭면 직교에 가까워 야 망막을 차단 최종 수지에 다시 지향 경우; 이 경사 절단을 최소화 할 수 있습니다. 그것은 (예 : 망막 압정으로) 객체를 통과하는 데 필요한 (공지의 스텝 사이즈) 증분 연삭 단계 번호가 개체의 크기와 상관 따라서 확인하는 것이 유용하다.
이 기술은 여러 방식으로 최적화 될 수있다. 연삭 공정과 관련된 에폭시 블록의 표면에 미세한 흠집이 점진적으로 연마 급 감소 될 수있다. 본 연구를 위해, 우리는 800, 1000, 1200, 2400 및 4000 등급 실리콘 카바이드 종이를 사용했다. 다이아몬드 페이스트는 표면 마무리를 향상시키기 위해 사용될 수있다. 미세한 표면이 더 높은 품질의 이미지를 제공하지만 추가 연마 시간의 비용. 이 기술의 결과를 개선하기위한 또 다른 중요한 고려 사항은 OPTI의 선택과 품질CS 및 조명 이미지 캡처에 사용. 기타 기본적인 조직학 얼룩 – 특히 얼룩 Nissl, 톨루이딘 블루 대신에 사용될 수 있지만, 더 최적화를 필요로 할 수있다. 일부 얼룩이 수지뿐만 아니라 조직 (예, 에오신), 따라서 얕은 광택제 배경 변색을 제거하는 염색 후에 요구 될 수 얼룩 것이다. 전문 얼룩, 형광 염료 및 면역 조직 화학 염색은 시도되지되었지만 매우 특정한 결과가 요구되지 않는 한, 각각의 연삭 단계에서 이러한 얼룩을 수행하는 데 필요한 시간은 금지 될 가능성이있다. 그러나, 매립 단계 (단계 3.4) (24) 전에 전체 조직을 염색하는 것이 가능할 수있다.
이 기술의 주요 제한은 따라서, 연삭 및 연마의 각 단계에서의 배율 다양한에서 많은 (아마도 중복) 이미지를 캡처하기 위해 신중한, 관심 영역이 얻어 접지되면,이를 검색 할 수 없다는 것이다. 그것은이다또한 중요한 각 연삭 깊이 조정을 위해 작은 단위를 사용합니다. 이 기술의 다른 제한은 그 조직 유리 슬라이드 상에 장착되고 표준 (송신) 광학 현미경으로 볼에 비해 광학 해상도의 배율. 프로토 타입 및 신규 한 임플란트 장치의 안전성을 측정하기위한 목적으로, 병리학 적 평가는 주요 관심사이다. 이 기술은 망막 점착성과 관련된 임상 적 손상을 관찰하기위한 효율적인 방법을 제공한다. 실제로, 갈기, 폴란드어를 수집하고 (한 번 포함) 지정된 표본을 촬영하는 데 필요한 전체 시간으로이 섹션에 파라핀 블록 또는 동결 절편을 걸리는 시간 비교입니다.
망막 임플란트의 범위 밖의 애플리케이션으로 확장 될 수있는 본 기술에 대한 가능성이있다. 이 기법은 주입 추출 feasib없는 하드 임플란트에 인접한 조직을 평가하기에 적합제작 또는 인터페이스에 손상을 것입니다. 예를 들어,이 기술은 약물 전달을위한 일부 깊은 뇌 또는 말초 신경 전극, 캐 뉼러로 종래의 조직 학적 기법을 절단 할 수없는 금속 (예, 백금, 니티놀, 등)에서 만든 임플란트를 평가하기 위해 확장 될 수있는, 혈관 스텐트 또는 정형 외과 보철.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nicole Vella (Macquarie University) for providing reagents; Alexia Saunder (Bionics Institute; BI), Michelle McPhedran (BI), Chris Williams (BI) for experimental support; the Royal Victorian Eye and Ear Hospital (RVEEH) Biological Research Centre staff for animal care; Sue Pierce (RVEEH) for veterinary advice; Anthony Burkitt (Bionic Vision Australia; BVA), Tamara Brawn (BVA) and the BVA staff for administrative support.
This research was supported by the Australian Research Council (ARC) through its Special Research Initiative (SRI) in Bionic Vision Science and Technology grant to Bionic Vision Australia (BVA). The Bionics Institute receives Operational Infrastructure Support from the Victorian Government and also acknowledges support from the Bertalli Family Trust and the J T Reid Charitable Trust. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
The Bionic Vision Australia Consortia authors for this manuscript are (a-z):
Penelope J. Allen, Owen Burns, Kate E. Fox, Kumaravelu Ganesan, David J. Garret, Hamish Meffin, Joel Villalobos, and Jonathan Yeoh.
Materials
| Name of the reagent / equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Acetone | Chem-Supply | AA008 | Propanone BHD Medical grade |
| Epo-Tek 301 Epoxy | Epoxy Technology | Part A 1675-54-3 Part B 9046-10-0 | |
| Ethanol 70-75% v/v | Merck PTY LTD | 4.10261 | Alcohol |
| Ethanol | Merck PTY LTD | 90143 | Alcohol |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| TegraPol grinding/polishing machine | Struers | TegraPol-25 | |
| AccuStop specimen holder | Struers | Accustop | |
| Light microscope | Leica | MZ16 | |
| Objective lens | Leica | 2.0x Planapo Objective | |
| Digital Microscope Camera | Leica | DFC-420C | |
| Microscope Software | Leica | Application Suite v4.1.0 |
Referencias
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