Preparación y caracterización de SDF-1α-quitosano-sulfato de dextrano Nanopartículas
Summary
The objective of this protocol is to incorporate SDF-1α, a stem cell homing factor, into dextran sulfate-chitosan nanoparticles. The resultant particles are measured for their size and zeta potential, as well as the content, activity, and in vitro release rate of SDF-1α from the nanoparticles.
Abstract
Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under appropriate conditions. The glycan nanoparticles are useful carriers for protein factors, which facilitate the in vivo delivery of the proteins and sustain their retention in the targeted tissue. The glycan polyelectrolyte complexes are also ideal for protein delivery, as the incorporation is carried out in aqueous solution, which reduces the likelihood of inactivation of the proteins. Proteins with a heparin-binding site adhere to dextran sulfate readily, and are, in turn, stabilized by the binding. These particles are also less inflammatory and toxic when delivered in vivo. In the protocol described below, SDF-1α (Stromal cell-derived factor-1α), a stem cell homing factor, is first mixed and incubated with dextran sulfate. Chitosan is added to the mixture to form polyelectrolyte complexes, followed by zinc sulfate to stabilize the complexes with zinc bridges. The resultant SDF-1α-DS-CS particles are measured for size (diameter) and surface charge (zeta potential). The amount of the incorporated SDF-1α is determined, followed by measurements of its in vitro release rate and its chemotactic activity in a particle-bound form.
Introduction
El sulfato de dextrano (DS) y quitosano (CS) son polisacáridos con múltiples grupos sulfato cargados negativamente sustituidos (en DS), o grupos amino cargados positivamente (desacetilado CS). Cuando se mezcla en una solución acuosa, los dos polisacáridos forman complejos de polielectrolitos a través de interacciones electrostáticas. Los complejos resultantes pueden formar grandes agregados que se separación de fases de la solución acuosa (precipitados), o pequeñas partículas que son dispersables en agua (coloides). Las condiciones específicas que contribuyen a estos resultados han sido ampliamente estudiados, y se han resumido y se ilustra en detalle en una reciente revisión 1. Entre estas condiciones, dos requisitos básicos para la producción de partículas dispersables en agua son los polímeros de carga opuesta deben 1) tienen significativamente diferente masa molar; y 2) ser mezclado en una relación no estequiométrica. Estas condiciones permitirán que los segmentos poliméricos acomplejados carga neutra generados por la carganeutralización para segregar y forman el núcleo de la partícula, y el exceso de polímero para formar la cubierta exterior 1. Las partículas de glicanos descritos en este protocolo se pretende para la administración pulmonar, y están diseñados para ser neta de carga negativa, y de dimensiones nanométricas. La carga superficial negativa reduce la probabilidad de la captación celular de las partículas de 2,3. Las partículas de dimensión nanométrica facilitan el paso a través de las vías respiratorias distales. Para lograr este objetivo, la cantidad de DS utilizado en esta preparación es en exceso de CS (relación en peso 3: 1); y de alto peso molecular-DS (promedio en peso MW 500.000) y de bajo peso molecular CS (rango MW 50-190 kDa, 75-85% desacetilado) se utilizan.
SDF-1α es un factor homing de células madre, que ejerce la función de toma de referencia a través de su actividad quimiotáctica. SDF-1α juega un papel importante en homing y mantenimiento de las células madre hematopoyéticas en la médula ósea, y en el reclutamiento de progecélulas NITOR a los tejidos periféricos a 4,5 reparación de lesiones. SDF-1α tiene un sitio de unión a heparina en su secuencia de la proteína, que permite que la proteína se une a la heparina / heparán sulfato, formar dímeros, ser protegido de la proteasa (CD26 / DPPIV) inactivación, e interactuar con las células diana a través de los receptores de la superficie celular 6-8. DS tiene propiedades estructurales similares a la heparina / heparán sulfato; Por lo tanto, la unión de SDF-1α a DS sería similar a la de sus ligandos poliméricos naturales.
En el siguiente protocolo, se describe la preparación de nanopartículas SDF-1α-DS-CS. Los procedimientos representan una de las formulaciones que se han estudiado previamente 9. El protocolo está adaptado originalmente de una investigación de nanopartículas de VEGF-DS-CS 10. Una preparación a pequeña escala se describe, que se puede escalar fácilmente con las mismas soluciones madre y condiciones de preparación. Después de la preparación, las partículas se caracterizan by el examen de su tamaño, el potencial zeta, grado de incorporación SDF-1α, in vitro tiempo de liberación, y la actividad de la SDF-1α incorporado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como se mencionó anteriormente, las nanopartículas DS-CS se forman a través de neutralización de la carga entre el polianión (DS) y policatión (CS) moléculas. Dado que la interacción de carga se produce fácilmente durante la colisión molecular, la concentración de las soluciones de polímero y la velocidad de agitación durante la mezcla es crítica para el tamaño de las partículas resultantes. Una tendencia general es que las soluciones de DS y CS 15 y mayor resultado velocidad de agitación en …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por becas del NIH: HL671795, HL048743 y HL108630.
Materials
| Name | Company | Catalog number |
| Dextran sulfate | Fisher | BP1585-100 |
| Chitosan, low molecular weight | Sigma | 448869 |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma | 204986 |
| D-Mannitol | Sigma | M9546 |
| UltraPure water | Invitrogen | 10977-023 |
| SDF-1α | Prepared according to reference 8. | |
| Syringe filter, PES membrane 0.22 um. | Millipore | SLGP033RS |
| Magnetic Micro Stirring Bars (2 x 7 mm) | Fisher | 14-513-63 |
| Glass vial Kit; SUN-SRi | Fisher | 14-823-182 |
| Delsa Nano C Particle Analyzer | Backman Coulter | |
| Eppendorf UVette Cuvets | Eppendorf | 952010069 |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Gel | Bio-Rad | 456-1096 |
| GelCode Blue Safe Protein Stain | Fisher | PI-24592 |
| Molecular Imager VersaDoc MP 4000 System | BioRad | 170-8640 |
| Corning Transwell Permeable Supports | Corning | 3421 |
| Accuri C6 Flow Cytometer | BD Biosciences | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Sigma | D8537 |
| Pyrogent plus kit | Fisher | NC9753738 |
Referencias
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