הכנה ואפיון של SDF-1α-Chitosan-Dextran סולפט חלקיקים
Summary
The objective of this protocol is to incorporate SDF-1α, a stem cell homing factor, into dextran sulfate-chitosan nanoparticles. The resultant particles are measured for their size and zeta potential, as well as the content, activity, and in vitro release rate of SDF-1α from the nanoparticles.
Abstract
Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under appropriate conditions. The glycan nanoparticles are useful carriers for protein factors, which facilitate the in vivo delivery of the proteins and sustain their retention in the targeted tissue. The glycan polyelectrolyte complexes are also ideal for protein delivery, as the incorporation is carried out in aqueous solution, which reduces the likelihood of inactivation of the proteins. Proteins with a heparin-binding site adhere to dextran sulfate readily, and are, in turn, stabilized by the binding. These particles are also less inflammatory and toxic when delivered in vivo. In the protocol described below, SDF-1α (Stromal cell-derived factor-1α), a stem cell homing factor, is first mixed and incubated with dextran sulfate. Chitosan is added to the mixture to form polyelectrolyte complexes, followed by zinc sulfate to stabilize the complexes with zinc bridges. The resultant SDF-1α-DS-CS particles are measured for size (diameter) and surface charge (zeta potential). The amount of the incorporated SDF-1α is determined, followed by measurements of its in vitro release rate and its chemotactic activity in a particle-bound form.
Introduction
סולפט dextran (DS) וchitosan (CS) הם סוכרים עם מטען שלילי בין מספר קבוצות החליפו סולפט (בDS), או קבוצות האמינים טעונות חיובי (deacetylated CS). כאשר מעורב בתמיסה מימית, שני סוכרים יצירת קומפלקסי polyelectrolyte דרך אינטראקציות אלקטרוסטטיות. המתחמים וכתוצאה מכך עלולים ליצור אגרגטים גדולים שיהיה לשלב מופרדים מהתמיסה המימית (משקעים), או חלקיקים קטנים שמים מסיסים (קולואידים). התנאים הספציפיים שתורמים לתוצאות אלה נחקרו רבים, וכבר סיכמו ומאוירים בפירוט בביקורת האחרונה 1. בין תנאים אלה, שתי דרישות בסיסיות לייצור חלקיקים מסיסים מים חייבים 1) יש לי הפולימרים הטעונים ההפוך מסה טוחנת שונה באופן משמעותי; ו -2) להיות מעורב ביחס הלא stoichiometric. תנאים אלה יאפשר מגזרי פולימרי complexed תשלום ניטראלי שנוצרו על ידי תשלוםנטרול להפריד ויוצר את הליבה של החלקיקים, והפולימרים העודפים כדי ליצור את המעטפת החיצונית 1. חלקיקי הסוכרים שתוארו בפרוטוקול זה נועדו למסירת ריאתי, ונועדו להיות נקי טעונים שלילי, וממדי ננומטר. תשלום המשטח השלילי מפחית את הסבירות של ספיגה התאית של החלקיקים 2,3. חלקיקים של ממד ננומטר להקל על המעבר בדרך נשימת דיסטלי. כדי להשיג מטרה זו, הסכום של DS בשימוש בתכשיר זה הוא בעודף של CS (יחס משקל 3: 1); וגבוה מולקולרי משקל-DS (MW משקל הממוצע 500,000) ומשקל מולקולרי נמוך CS (טווח MW 50-190 kDa, 75-85% deacetylated) משמש.
SDF-1α הוא גורם ביות של תאי גזע, אשר מפעיל את פונקצית הביות באמצעות פעילות chemotactic. SDF-1α ממלאים תפקיד חשוב בביות ותחזוקה של תאי גזע hematopoietic במח העצם, ובגיוס של progeתאי nitor לרקמה ההיקפית ל4,5 תיקון פציעה. יש SDF-1α אתר מחייב הפרין ברצף החלבון שלה, המאפשר לחלבון להיקשר להפרין / הפאראן גופרתי, הדימרים צורה, להיות מוגן מפני פרוטאז (CD26 / DPPIV) איון, ואינטראקציה עם תאי מטרה באמצעות קולטנים בתא השטח 6-8. יש DS תכונות מבניות דומות להפרין / הפאראן גופרתי; כך, המחייב של SDF-1α לDS יהיה דומה לזה של ligands פולימרים הטבעי שלה.
בפרוטוקול הבא, אנו מתארים את ההכנה של ננו-חלקיקי SDF-1α-DS-CS. הנהלים מייצגים את אחד הניסוחים שנחקרו בעבר 9. הפרוטוקול מותאם במקור מחקירה של חלקיקי VEGF-DS-CS 10. הכנה בקנה מידה קטנה מתוארת, אשר ניתן לשנותם בקלות עם אותו פתרונות המניות ותנאי הכנה. לאחר הכנה, החלקיקים מאופיינים בy בחינת גודלם, פוטנציאל זטה, התאגדות SDF-1α מידה, במבחנה זמן שחרור, ופעילות של SDF-1α המשולבים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כפי שצוין לעיל, נוצרים חלקיקי DS-CS באמצעות נטרול מטען בין polyanion (DS) וpolycation מולקולות (CS). מאז האינטראקציה תשלום מתרחשת בקלות במהלך ההתנגשות המולקולרית, הריכוז של פתרונות הפולימר ומהירות ערבוב במהלך הערבוב הוא קריטי לגודל של החלקיקים שנוצר. מגמה כללית היא שיותר מדוללת פת?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH: HL671795, HL048743, וHL108630.
Materials
| Name | Company | Catalog number |
| Dextran sulfate | Fisher | BP1585-100 |
| Chitosan, low molecular weight | Sigma | 448869 |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma | 204986 |
| D-Mannitol | Sigma | M9546 |
| UltraPure water | Invitrogen | 10977-023 |
| SDF-1α | Prepared according to reference 8. | |
| Syringe filter, PES membrane 0.22 um. | Millipore | SLGP033RS |
| Magnetic Micro Stirring Bars (2 x 7 mm) | Fisher | 14-513-63 |
| Glass vial Kit; SUN-SRi | Fisher | 14-823-182 |
| Delsa Nano C Particle Analyzer | Backman Coulter | |
| Eppendorf UVette Cuvets | Eppendorf | 952010069 |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Gel | Bio-Rad | 456-1096 |
| GelCode Blue Safe Protein Stain | Fisher | PI-24592 |
| Molecular Imager VersaDoc MP 4000 System | BioRad | 170-8640 |
| Corning Transwell Permeable Supports | Corning | 3421 |
| Accuri C6 Flow Cytometer | BD Biosciences | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Sigma | D8537 |
| Pyrogent plus kit | Fisher | NC9753738 |
Referencias
- Delair, T. Colloidal polyelectrolyte complexes of chitosan and dextran sulfate towards versatile nanocarriers of bioactive molecules. Eur J Pharm Biopharm. 78 (1), 10-18 (2011).
- Morachis, J. M., Mahmoud, E. A., Almutairi, A. Physical and chemical strategies for therapeutic delivery by using polymeric nanoparticles. Pharmacol Rev. 64 (3), 505-519 (2012).
- Yue, Z. G., et al. Surface charge affects cellular uptake and intracellular trafficking of chitosan-based nanoparticles. Biomacromolecules. 12 (7), 2440-2446 (2011).
- Ghadge, S. K., Muhlstedt, S., Ozcelik, C., Bader, M. SDF-1alpha as a therapeutic stem cell homing factor in myocardial infarction. Pharmacol Ther. 129 (1), 97-108 (2011).
- Sharma, M., Afrin, F., Satija, N., Tripathi, R. P., Gangenahalli, G. U. Stromal-derived factor-1/CXCR4 signaling: indispensable role in homing and engraftment of hematopoietic stem cells in bone marrow. Stem Cells Dev. 20 (6), 933-946 (2011).
- Sadir, R., Baleux, F., Grosdidier, A., Imberty, A., Lortat-Jacob, H. Characterization of the stromal cell-derived factor-1alpha-heparin complex. J Biol Chem. 276 (11), 8288-8296 (2001).
- Amara, A., et al. Stromal cell-derived factor-1alpha associates with heparan sulfates through the first beta-strand of the chemokine. J Biol Chem. 274 (34), 23916-23925 (1999).
- Sadir, R., Imberty, A., Baleux, F., Lortat-Jacob, H. Heparan sulfate/heparin oligosaccharides protect stromal cell-derived factor-1 (SDF-1)/CXCL12 against proteolysis induced by CD26/dipeptidyl peptidase IV. J Biol Chem. 279 (42), 43854-43860 (1074).
- Yin, T., et al. SDF-1alpha in glycan nanoparticles exhibits full activity and reduces pulmonary hypertension in rats. Biomacromolecules. 14 (11), 4009-4020 (2013).
- Huang, M., Vitharana, S. N., Peek, L. J., Coop, T., Berkland, C. Polyelectrolyte complexes stabilize and controllably release vascular endothelial growth factor. Biomacromolecules. 8 (5), 1607-1614 (2007).
- McCall, R. L., Sirianni, R. W. PLGA nanoparticles formed by single- or double-emulsion with vitamin E-TPGS. J Vis Exp. (82), 51015 (2013).
- Carrillo-Conde, B. R., Roychoudhury, R., Chavez-Santoscoy, A. V., Narasimhan, B., Pohl, N. L. High-throughput synthesis of carbohydrates and functionalization of polyanhydride nanoparticles. J Vis Exp. (65), 3967 (2012).
- Xu, J., Amiji, M. Therapeutic gene delivery and transfection in human pancreatic cancer cells using epidermal growth factor receptor-targeted gelatin nanoparticles. J Vis Exp. (59), e3612 (2012).
- Lauten, E. H., et al. Nanoglycan complex formulation extends VEGF retention time in the lung. Biomacromolecules. 11 (7), 1863-1872 (2010).
- Schatz, C., Domard, A., Viton, C., Pichot, C., Delair, T. Versatile and efficient formation of colloids of biopolymer-based polyelectrolyte complexes. Biomacromolecules. 5 (5), 1882-1892 (2004).
