En tiempo real Electrofisiología: Usando protocolos de bucle cerrado para sondear neuronales Dinámica y allá
Summary
Closed-loop protocols are becoming increasingly widespread in modern day electrophysiology. We present a simple, versatile and inexpensive way to perform complex electrophysiological protocols in cortical pyramidal neurons in vitro, using a desktop computer and a digital acquisition board.
Abstract
Neurociencia experimental está siendo testigo de un creciente interés en el desarrollo y aplicación de la novela y, protocolos de circuito cerrado a menudo complejas, donde el estímulo aplicado depende, en tiempo real sobre la respuesta del sistema. Aplicaciones recientes van desde la implementación de sistemas de realidad virtual para el estudio de las respuestas motoras, tanto en ratones 1 y 2 en el pez cebra, para controlar de convulsiones después del accidente cerebrovascular cortical utilizando optogenética 3. Una ventaja clave de las técnicas de bucle cerrado reside en la capacidad de sondeo propiedades dimensionales superiores que no son directamente accesibles o que dependen de múltiples variables, como la excitabilidad neuronal 4 y fiabilidad, mientras que al mismo tiempo, maximizar el rendimiento experimental. En esta contribución y en el contexto de la electrofisiología celular, se describe cómo aplicar una variedad de protocolos de bucle cerrado para el estudio de las propiedades de respuesta de las neuronas corticales piramidal, recorded intracelularmente con la técnica de patch clamp en rodajas de cerebro agudas de la corteza somatosensorial de ratas jóvenes. Como ningún software de código abierto disponibles comercialmente o proporciona todas las características necesarias para llevar a cabo de manera eficiente los experimentos descritos aquí, una nueva caja de herramientas de software llamado LCG 5 fue desarrollado, cuya estructura modular maximiza la reutilización de código informático y facilita la implementación de nuevos paradigmas experimentales. Formas de onda de estimulación se especifican mediante un pacto meta-descripción y protocolos experimentales completos se describen en los archivos de configuración basados en texto. Además, LCG tiene una interfaz de línea de comandos que es adecuado para la repetición de los ensayos y la automatización de los protocolos experimentales.
Introduction
En los últimos años, la electrofisiología celular ha evolucionado desde el paradigma tradicional de bucle abierto empleado en los experimentos de tensión y corriente a los protocolos de fijación de bucle cerrado modernos. La técnica de circuito cerrado más conocido es quizás la pinza dinámica 6,7, lo que permitió la inyección sintética de los canales iónicos dependientes de voltaje artificiales para determinar el voltaje de la membrana neuronal 8, el estudio en profundidad de los efectos de la no-determinista parpadeo en canales iónicos en la dinámica de respuesta neuronal 9, así como la recreación in vitro de realistas en Vivo- como actividad de fondo sináptica 10.
Otros paradigmas de circuito cerrado que se han propuesto incluyen la abrazadera reactiva 11, para estudiar in vitro la generación de actividad persistente autosostenida, y la respuesta sujetar 4,12, para investigar los mecanismos celulares excitabilidad neuronal subyacente.
ONTENIDO "> Aquí se describe un potente marco que permite la aplicación de una variedad de protocolos electrofisiológicos de bucle cerrado en el contexto de grabaciones de patch clamp de células enteras realizadas en rodajas de cerebro agudas. Mostramos cómo grabar voltaje de la membrana somática por medio de grabaciones de patch clamp en las neuronas piramidales de la corteza somatosensorial de ratas jóvenes y aplicar tres protocolos de bucle cerrado diferentes utilizando LCG, una caja de herramientas de software basado en línea de comandos desarrollado en el laboratorio de Neurobiología y Teórica Neuroingeniería.En pocas palabras, los protocolos descritos son, en primer lugar de la inyección automática de una serie de formas de onda de estímulo pinza actuales, relevantes para la caracterización de un gran conjunto de propiedades de la membrana activa y pasiva. Estos se han sugerido para capturar el fenotipo electrofisiológico de una célula en términos de sus propiedades de respuesta a una serie de patrón de formas de onda de estímulo. Conocido como el código e de una célula (por ejemplo, ver & #160; 13,14), una colección de respuestas eléctricas tales es utilizado por varios laboratorios para clasificar objetivamente neuronas sobre la base de sus propiedades eléctricas. Esto incluye el análisis de la relación de transferencia estacionaria de entrada-salida (curva fI), por una técnica innovadora que implica la de lazo cerrado, el control en tiempo real del tipo de cocción por medio de un controlador proporcional-integral-derivativo (PID) , segundo la recreación de realista vivo -como la actividad sináptica es el fondo en preparaciones in vitro 10 y tercero, la conexión artificial en tiempo real de dos neuronas piramidales registradas simultáneamente por medio de un interneuron virtual GABAérgicas, que se simula por el ordenador.
Además, LCG implementa la técnica conocida como activo de electrodo de Compensación (AEC) 15, que permite la aplicación de protocolos de sujeción dinámicos utilizando un solo electrodo. Esto permite compensar los efectos no deseados (unartifacts) del electrodo de registro que surgen cuando se usa para la entrega de estímulos intracelulares. El método se basa en una estimación no paramétrica de las propiedades eléctricas equivalentes del circuito de grabación.
Las técnicas y los protocolos experimentales descritas en el presente documento pueden aplicarse fácilmente en el voltaje de circuito abierto convencional y experimentos corriente con la pinza y se puede extender a otras preparaciones, como extracelular 4,16 o grabaciones intracelulares in vivo 17,18. El montaje cuidadoso de la configuración de la electrofisiología de pinzamiento zonal de célula completa es un paso muy importante para, grabaciones estables de alta calidad. En lo que sigue se supone que una instalación como experimental ya está disponible para el experimentador, y centramos nuestra atención en describir el uso de LCG. El lector se refirió a 19-22 para obtener consejos adicionales acerca de la optimización y depuración.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este texto un protocolo completo para la aplicación de tiempo real, de circuito cerrado unicelulares experimentos electrofisiológicos fue descrito, utilizando la técnica de patch clamp y una caja de herramientas de software desarrollado recientemente llamado LCG. Para optimizar la calidad de las grabaciones es crucial que la configuración de la grabación sea correctamente conectado a tierra, protegido y libre de vibraciones: esto garantiza el acceso de células enteras estable y duradera de la célula, lo que, j…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financial support from the Flanders Research Foundation FWO (contract n. 12C9112N to DL), the 7th Framework Programme of the European Commission (Marie Curie Network “C7”, contract n. 238214; ICT Future Emerging Technology “ENLIGHTENMENT” project, contract n. 306502), the Interuniversity Attraction Poles Program initiated by the Belgian Science Policy Office (contract n. IUAP-VII/20), and the University of Antwerp is kindly acknowledged.
Materials
| Tissue slicer | Leica | VT-1000S | |
| Pipette puller | Sutter | P-97 | |
| Pipettes | WPI | 1B150F-4 | 1.5/0.84 mm OD/ID, with filament |
| Vibration isolation table | TMC | 20 Series | |
| Microscope | Leica | DMLFS | 40X Immersion Objective |
| Manipulators | Scientifica | PatchStar | |
| Amplifiers | Axon Instruments | MultiClamp 700B | Computer controlled |
| Data acquisition card | National Instruments | PCI-6229 | Supported by Comedi Linux Drivers |
| Desktop computer | Dell | Optiplex 7010 Tower | OS: real-time Linux |
| Oscilloscopes | Tektronix | TDS-1002 | |
| Perfusion Pump | Gibson | MINIPULS3 | Used with R4 Pump head (F117606) |
| Temperature controller | Multichannel Systems | TC02 | PH01 Perfusion Cannula |
| Manometer | Testo | 510 | Optional |
| Incubator | Memmert | WB14 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | ACSF |
| KCl | Sigma | P9541 | ACSF, ICS |
| NaH2PO4 | Sigma | S3139 | ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | ACSF |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | ACSF |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | ACSF |
| Glucose | Sigma | G7528 | ACSF |
| K-Gluconate | Sigma | G4500 | ICS |
| HEPES | Sigma | H3375 | ICS |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | ICS |
| Na2-GTP | Sigma | 51120 | ICS |
| Na2-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | ICS |
Referencias
- Saleem, A. B., Ayaz, A., Jeffery, K. J., Harris, K. D., Carandini, M. Integration of visual motion and locomotion in mouse visual cortex. Nature neuroscience. 16, 1864-1869 (2013).
- Ahrens, M. B., Li, J. M., et al. Brain-wide neuronal dynamics during motor adaptation in zebrafish. Nature. 485 (7399), 471-477 (2012).
- Paz, J. T., Davidson, T. J., et al. Closed-loop optogenetic control of thalamus as a tool for interrupting seizures after cortical injury. Nature neuroscience. 16 (1), 64-70 (2013).
- Wallach, A., Eytan, D., Gal, A., Zrenner, C., Marom, S. Neuronal response clamp. Frontiers in neuroengineering. 3 (April), 3 (2011).
- Linaro, D., Couto, J., Giugliano, M. Command-line cellular electrophysiology for conventional and real-time closed-loop experiments. Journal of neuroscience. 230, 5-19 (2014).
- Sharp, A., O’Neil, M., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. Journal of neurophysiology. 69 (3), 992-995 (1993).
- Robinson, H. P., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. Journal of neuroscience methods. 49 (3), 157-165 (1993).
- Vervaeke, K., Hu, H., Graham, L. J., Storm, J. F. Contrasting effects of the persistent Na+ current on neuronal excitability and spike timing. Neuron. 49 (2), 257-270 (2006).
- White, J. A., Klink, R., Alonso, A., Kay, A. R. Noise from voltage-gated ion channels may influence neuronal dynamics in the entorhinal cortex. Journal of neurophysiology. 80 (1), 262-269 (1998).
- Destexhe, a., Rudolph, M., Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Fluctuating synaptic conductances recreate in vivo-like activity in neocortical neurons. Neurociencias. 107 (1), 13-24 (2001).
- Fellous, J. -. M. Regulation of Persistent Activity by Background Inhibition in an In Vitro Model of a Cortical Microcircuit. Cerebral Cortex. 13 (11), 1232-1241 (2003).
- Gal, A., Eytan, D., Wallach, A., Sandler, M., Schiller, J., Marom, S. Dynamics of excitability over extended timescales in cultured cortical neurons. The Journal of neuroscience. the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (48), 16332-16342 (2010).
- Wang, Y., Toledo-Rodriguez, M., et al. Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat. The Journal of physiology. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).
- Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex). Cerebral cortex (New York, N.Y). 12 (4), 395-410 (1991).
- Brette, R., Piwkowska, Z., et al. High-resolution intracellular recordings using a real-time computational model of the electrode. Neuron. 59 (3), 379-391 (2008).
- Rutishauser, U., Kotowicz, A., Laurent, G. A method for closed-loop presentation of sensory stimuli conditional on the internal brain-state of awake animals. Journal of neuroscience. 215 (1), 139-155 (2013).
- Margrie, T., Brecht, M., Sakmann, B. In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 444 (4), 491-498 (2002).
- Graham, L., Schramm, A. In Vivo Dynamic-Clamp Manipulation of Extrinsic and Intrinsic Conductances: Functional Roles of Shunting Inhibition and I BK in Rat and Cat Cortex. Dynamic Clamp: From Principles to Applications. , (2008).
- Sakmann, B., Neher, E. . Single-channel recording. , (1995).
- Molleman, A. . Patch Clamping. , (2002).
- Davie, J. T., Kole, M. H. P., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nature Protocols. 1 (3), 1235-1247 (2006).
- Gold, R. . The Axon Guide for Electrophysiolog., & Biophysics Laboratory Techniques... , (2007).
- Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. Reliability of spike timing in neocortical neurons. Science. 268 (5216), 1503-1506 (1995).
- Buzsáki, G. Action potential threshold of hippocampal pyramidal cells in vivo is increased by recent spiking activity. Neurociencias. 105 (1), 121-130 (2001).
- Koch, C., Segev, I. . Methods in Neuronal Modeling: From Synapses to Networks. , (1988).
- Silberberg, G., Markram, H. Disynaptic inhibition between neocortical pyramidal cells mediated by Martinotti cells. Neuron. 53 (5), 735-746 (2007).
- Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. Brief bursts self-inhibit and correlate the pyramidal network. PLoS biology. 8 (9), (2010).
- Tsodyks, M., Pawelzik, K., Markram, H. Neural networks with dynamic synapses. Neural computation. 10 (4), 821-835 (1998).
- Kapfer, C., Glickfeld, L. L., Atallah, B. Supralinear increase of recurrent inhibition during sparse activity in the somatosensory cortex. Nature. 10 (6), 743-753 (2007).
