Summary

リアルタイム電気生理学:プローブ神経ダイナミクスとその先にクローズド·ループ·プロトコルの使用

Published: June 24, 2015
doi:

Summary

Closed-loop protocols are becoming increasingly widespread in modern day electrophysiology. We present a simple, versatile and inexpensive way to perform complex electrophysiological protocols in cortical pyramidal neurons in vitro, using a desktop computer and a digital acquisition board.

Abstract

実験的神経科学は、新規の開発と応用への関心の高まりを目撃し、多くの場合、複雑な刺激が、システムの応答にリアルタイムに依存​​する適用、閉ループプロトコルれます。最近のアプリケーションは、光遺伝学3を使用して、皮質脳卒中後の発作の制御に、マウス1とゼブラフィッシュ2の両方の運動反応を研究するための仮想現実システムの実装の ​​範囲です。閉ループ技術の重要な利点は、直接アクセスすることはできませんまたは、同時に実験スループットを最大化しながら、このような神経細胞の興奮4や信頼性などの複数の変数に依存し、より高い次元の特性を探査する能力にあります。この貢献ではと細胞電気生理学との関連で、我々はREC、錐体皮質ニューロンの応答特性の研究に閉ループの様々なプロトコルを適用する方法について説明します若年ラットの体性感覚皮質から急性脳スライスにおけるパッチクランプ法で細胞内orded。何の市販またはオープンソースソフトウェアを効率的にここに記載の実験を行うために必要なすべての機能を提供しないように、LCG 5と呼ばれる新しいソフトウェアツールボックスは、そのモジュラー構造のコンピュータ·コードの再利用を最大化し、新たな実験パラダイムの実装を容易に、開発されました。刺激波形は、コンパクトなメタ記述を使用して指定されており、完全な実験プロトコルは、テキストベースの設定ファイルに記述されています。さらに、LCGは、試験の反復と実験プロトコルの自動化に適しているコマンドライン·インタフェースを備えています。

Introduction

近年、携帯電気生理学は、近代的な閉ループプロトコルに電圧および電流クランプ実験に用い、従来のオープンループパラダイムから進化してきました。最もよく知られている閉ループ技術は、おそらく神経細胞膜電位8を決定するために人工的な電位依存性イオンチャネルの合成注入を可能に動的クランプ6,7であり、非決定論的には、フリッカの影響の詳細な研究神経応答のダイナミクス9、ならびにシナプス背景活動10のようなvivo-で現実的なのin vitroでのレクリエーションのイオンチャネル。

提案されている他の閉ループパラダイムは、 インビトロ自立持続的活動の発生、及び応答は細胞機構を下にある神経細胞の興奮性を調査するために、4,12をクランプを研究するために、反応性クランプ11を含みます。

ontent ">ここでは、急性脳スライスで行われる全細胞パッチクランプ記録のコンテキストで閉ループ電気生理学の様々なプロトコルを適用することができる強力なフレームワークを記述している。我々は、パッチクランプ記録を用いて体細胞膜電圧を記録する方法を示しています若年ラットの体性感覚野からの錐体ニューロンでLCG、理論神経生物とNeuroengineeringの研究室で開発されたコマンドラインベースのソフトウェアツールボックスを使用して、3つの異なる閉ループプロトコルを適用します。

簡単に言えば、記載されたプロトコルは、アクティブおよびパッシブ膜特性の大きな集合の特性に関連する、電流クランプ刺激波形のシリーズの最初の自動注入されています。これらは、刺激波形の定型一連の応答特性の点で細胞の電気生理学的表現型を捕捉するために提案されています。セルの電子コードとして知られている( 例えば 、参照してください  13,14)が 、電気的応答のようなコレクションは、客観的に、それらの電気的特性に基づいて神経細胞を分類するためにいくつかの研究室で使用されます。これは、比例積分微分(PID)コントローラにより発火の速度の閉ループリアルタイム制御を含む革新的な技術によって、固定入出力伝達関係(FI曲線)の分析が含まれ、第二のインビトロ製剤10と、コンピュータでシミュレートされた仮想のGABA作動性介在ニューロンの手段により2同時に記録錐体ニューロンのリアルタイムで第人工接続で現実的なインビボの様な背景シナプス活性のレクリエーション。

さらに、LCGは、単一の電極を用いたダイナミッククランププロトコルを実装することができ、活性電極報酬(AEC)15、として知られる技術を実装しています。これは望ましくない影響を補償することができます(Aそれは、細胞内刺激を送達するために使用される場合に生じる記録電極のrtifacts)。この方法は、記録回路の等価電気特性のノンパラメトリック推定に基づいています。

このホワイトペーパーに記載された技術と実験プロトコルは、容易に従来のオープンループ電圧と電流クランプ実験に適用することができ、 生体内 17,18 、このような細胞外4,16のような他の製剤、または細胞内記録に拡張することができます。全細胞パッチクランプ電気生理学のセットアップの注意深いアセンブリは安定した高品質の記録のために非常に重要なステップです。以下では、そのような実験は、実験者に既に利用可能であることを前提とし、LCGの使用法を説明する上で私たちの注意を集中します。読者は、最適化とデバッグに関する追加のヒントについては、19〜22に指摘されています。

Protocol

ここで説明するプロトコルは、アントワープ大学の医歯薬学総合研究科の倫理委員会の勧告やガイドラインに準拠しています。このプロトコルは、承認された人道的な安楽死法により得られた幼若Wistarラットの外植脳からの非知覚材料の準備が必要です。 1.機器の準備データ収集と刺激システムをインストールして設定します。 信号を記録し、電気生理学?…

Representative Results

前のセクションでは、L5錐体細胞の電気生理学的特性を特徴づけるために、ソフトウェアツールボックスのLCGを使用して、スライス標本におけるインビボ様シナプス活性を再作成する方法を説明してきました。コマンド·ライン·インターフェースと半自動プロトコルの使用は、生成されたデータの出力および品質に大きな影響を持つことができ、実験の再現性及び効率性を好みます。?…

Discussion

このテキストリアルタイムの実施のための完全なプロトコルでは、閉ループ単一細胞電気実験はパッチクランプ法とLCGと呼ばれる最近開発されたソフトウェアツールボックスを使用して、説明しました。録音の品質を最適化するためには、記録の設定が正しく、接地シールドと振動しないことが重要である:これは、一緒に刺激プロトコルのセクション全体を自動化する可能性のある細胞へ?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Financial support from the Flanders Research Foundation FWO (contract n. 12C9112N to DL), the 7th Framework Programme of the European Commission (Marie Curie Network “C7”, contract n. 238214; ICT Future Emerging Technology “ENLIGHTENMENT” project, contract n. 306502), the Interuniversity Attraction Poles Program initiated by the Belgian Science Policy Office (contract n. IUAP-VII/20), and the University of Antwerp is kindly acknowledged.

Materials

Tissue slicer Leica VT-1000S
Pipette puller Sutter P-97
Pipettes WPI 1B150F-4 1.5/0.84 mm OD/ID, with filament
Vibration isolation table TMC 20 Series
Microscope Leica DMLFS 40X Immersion Objective
Manipulators Scientifica PatchStar
Amplifiers Axon Instruments MultiClamp 700B Computer controlled
Data acquisition card National Instruments PCI-6229 Supported by Comedi Linux Drivers
Desktop computer Dell Optiplex 7010 Tower OS: real-time Linux
Oscilloscopes Tektronix TDS-1002
Perfusion Pump Gibson MINIPULS3 Used with R4 Pump head (F117606)
Temperature controller Multichannel Systems TC02 PH01 Perfusion Cannula
Manometer Testo 510 Optional
Incubator Memmert WB14
NaCl Sigma 71376 ACSF
KCl Sigma P9541 ACSF, ICS
NaH2PO4 Sigma S3139 ACSF
NaHCO3 Sigma S6014 ACSF
CaCl2 Sigma C1016 ACSF
MgCl2 Sigma M8266 ACSF
Glucose Sigma G7528 ACSF
K-Gluconate Sigma G4500 ICS
HEPES Sigma H3375 ICS
Mg-ATP Sigma A9187 ICS
Na2-GTP Sigma 51120 ICS
Na2-Phosphocreatine Sigma P7936 ICS

Referencias

  1. Saleem, A. B., Ayaz, A., Jeffery, K. J., Harris, K. D., Carandini, M. Integration of visual motion and locomotion in mouse visual cortex. Nature neuroscience. 16, 1864-1869 (2013).
  2. Ahrens, M. B., Li, J. M., et al. Brain-wide neuronal dynamics during motor adaptation in zebrafish. Nature. 485 (7399), 471-477 (2012).
  3. Paz, J. T., Davidson, T. J., et al. Closed-loop optogenetic control of thalamus as a tool for interrupting seizures after cortical injury. Nature neuroscience. 16 (1), 64-70 (2013).
  4. Wallach, A., Eytan, D., Gal, A., Zrenner, C., Marom, S. Neuronal response clamp. Frontiers in neuroengineering. 3 (April), 3 (2011).
  5. Linaro, D., Couto, J., Giugliano, M. Command-line cellular electrophysiology for conventional and real-time closed-loop experiments. Journal of neuroscience. 230, 5-19 (2014).
  6. Sharp, A., O’Neil, M., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. Journal of neurophysiology. 69 (3), 992-995 (1993).
  7. Robinson, H. P., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. Journal of neuroscience methods. 49 (3), 157-165 (1993).
  8. Vervaeke, K., Hu, H., Graham, L. J., Storm, J. F. Contrasting effects of the persistent Na+ current on neuronal excitability and spike timing. Neuron. 49 (2), 257-270 (2006).
  9. White, J. A., Klink, R., Alonso, A., Kay, A. R. Noise from voltage-gated ion channels may influence neuronal dynamics in the entorhinal cortex. Journal of neurophysiology. 80 (1), 262-269 (1998).
  10. Destexhe, a., Rudolph, M., Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Fluctuating synaptic conductances recreate in vivo-like activity in neocortical neurons. Neurociencias. 107 (1), 13-24 (2001).
  11. Fellous, J. -. M. Regulation of Persistent Activity by Background Inhibition in an In Vitro Model of a Cortical Microcircuit. Cerebral Cortex. 13 (11), 1232-1241 (2003).
  12. Gal, A., Eytan, D., Wallach, A., Sandler, M., Schiller, J., Marom, S. Dynamics of excitability over extended timescales in cultured cortical neurons. The Journal of neuroscience. the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (48), 16332-16342 (2010).
  13. Wang, Y., Toledo-Rodriguez, M., et al. Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat. The Journal of physiology. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).
  14. Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex). Cerebral cortex (New York, N.Y). 12 (4), 395-410 (1991).
  15. Brette, R., Piwkowska, Z., et al. High-resolution intracellular recordings using a real-time computational model of the electrode. Neuron. 59 (3), 379-391 (2008).
  16. Rutishauser, U., Kotowicz, A., Laurent, G. A method for closed-loop presentation of sensory stimuli conditional on the internal brain-state of awake animals. Journal of neuroscience. 215 (1), 139-155 (2013).
  17. Margrie, T., Brecht, M., Sakmann, B. In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 444 (4), 491-498 (2002).
  18. Graham, L., Schramm, A. In Vivo Dynamic-Clamp Manipulation of Extrinsic and Intrinsic Conductances: Functional Roles of Shunting Inhibition and I BK in Rat and Cat Cortex. Dynamic Clamp: From Principles to Applications. , (2008).
  19. Sakmann, B., Neher, E. . Single-channel recording. , (1995).
  20. Molleman, A. . Patch Clamping. , (2002).
  21. Davie, J. T., Kole, M. H. P., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nature Protocols. 1 (3), 1235-1247 (2006).
  22. Gold, R. . The Axon Guide for Electrophysiolog., & Biophysics Laboratory Techniques... , (2007).
  23. Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. Reliability of spike timing in neocortical neurons. Science. 268 (5216), 1503-1506 (1995).
  24. Buzsáki, G. Action potential threshold of hippocampal pyramidal cells in vivo is increased by recent spiking activity. Neurociencias. 105 (1), 121-130 (2001).
  25. Koch, C., Segev, I. . Methods in Neuronal Modeling: From Synapses to Networks. , (1988).
  26. Silberberg, G., Markram, H. Disynaptic inhibition between neocortical pyramidal cells mediated by Martinotti cells. Neuron. 53 (5), 735-746 (2007).
  27. Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. Brief bursts self-inhibit and correlate the pyramidal network. PLoS biology. 8 (9), (2010).
  28. Tsodyks, M., Pawelzik, K., Markram, H. Neural networks with dynamic synapses. Neural computation. 10 (4), 821-835 (1998).
  29. Kapfer, C., Glickfeld, L. L., Atallah, B. Supralinear increase of recurrent inhibition during sparse activity in the somatosensory cortex. Nature. 10 (6), 743-753 (2007).
check_url/es/52320?article_type=t

Play Video

Citar este artículo
Linaro, D., Couto, J., Giugliano, M. Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond. J. Vis. Exp. (100), e52320, doi:10.3791/52320 (2015).

View Video