वास्तविक समय इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी: जांच Neuronal गतिशीलता और परे करने के लिए बंद लूप प्रोटोकॉल का उपयोग
Summary
Closed-loop protocols are becoming increasingly widespread in modern day electrophysiology. We present a simple, versatile and inexpensive way to perform complex electrophysiological protocols in cortical pyramidal neurons in vitro, using a desktop computer and a digital acquisition board.
Abstract
प्रायोगिक तंत्रिका विज्ञान प्रोत्साहन प्रणाली की प्रतिक्रिया पर वास्तविक समय में निर्भर करता है लागू किया जहां विकास और उपन्यास के आवेदन और अक्सर जटिल, बंद लूप प्रोटोकॉल, में वृद्धि हुई ब्याज देखी जा रही है। हाल के अनुप्रयोगों optogenetics 3 का उपयोग कॉर्टिकल स्ट्रोक निम्नलिखित बरामदगी के नियंत्रित करने के लिए, चूहों 1 में और zebrafish 2 में दोनों मोटर प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए आभासी वास्तविकता प्रणाली के कार्यान्वयन से लेकर। बंद लूप तकनीक की एक प्रमुख लाभ सीधे सुलभ नहीं हैं या एक ही समय में प्रयोगात्मक throughput को अधिकतम जबकि, इस तरह के न्यूरोनल excitability के 4 और विश्वसनीयता के रूप में कई चर, पर निर्भर करती है कि उच्च आयामी संपत्तियों की जांच कर की क्षमता में रहता है। इस योगदान में और सेलुलर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के संदर्भ में, हम पिरामिड cortical न्यूरॉन्स, आरईसी की प्रतिक्रिया गुणों का अध्ययन करने के लिए बंद लूप प्रोटोकॉल की एक किस्म को लागू करने के लिए कैसे का वर्णनकिशोर चूहों के somatosensory प्रांतस्था से तीव्र मस्तिष्क के स्लाइस में पैच दबाना तकनीक के साथ intracellularly orded। कोई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है या खुला स्रोत सॉफ्टवेयर कुशलता से यहाँ वर्णित प्रयोगों प्रदर्शन के लिए आवश्यक सभी सुविधाओं को प्रदान करता है के रूप में, LCG 5 नामक एक नया सॉफ्टवेयर उपकरण बॉक्स जिसका मॉड्यूलर संरचना कंप्यूटर कोड का पुन: उपयोग के अधिकतम और उपन्यास प्रयोगात्मक मानदंड के कार्यान्वयन की सुविधा विकसित किया गया था। उत्तेजना waveforms के एक कॉम्पैक्ट मेटा विवरण का उपयोग कर निर्दिष्ट कर रहे हैं और पूरी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल पाठ आधारित विन्यास फाइल में वर्णित हैं। इसके अतिरिक्त, LCG परीक्षणों की पुनरावृत्ति और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के स्वचालन के लिए अनुकूल है कि एक कमांड लाइन इंटरफेस है।
Introduction
हाल के वर्षों में, सेलुलर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी आधुनिक बंद लूप प्रोटोकॉल के लिए वोल्टेज और मौजूदा दबाना प्रयोगों में कार्यरत पारंपरिक खुले पाश प्रतिमान से विकसित किया गया है। सबसे अच्छा ज्ञात बंद लूप तकनीक शायद न्यूरोनल झिल्ली वोल्टेज 8 निर्धारित करने के लिए कृत्रिम वोल्टेज-गेटेड आयन चैनल का सिंथेटिक इंजेक्शन सक्षम है, जो गतिशील दबाना 6,7, है, गैर नियतात्मक पर चंचल के प्रभावों का गहन अध्ययन आयन न्यूरोनल प्रतिक्रिया गतिशीलता 9 पर चैनलों, साथ ही अन्तर्ग्रथनी पृष्ठभूमि गतिविधि 10 की तरह vivo- में यथार्थवादी के लिए इन विट्रो में मनोरंजन।
प्रस्तावित किया गया है कि अन्य बंद लूप लद सेलुलर तंत्र अंतर्निहित न्यूरोनल excitability के जांच करने के लिए, 4,12 दबाना प्रतिक्रियाशील दबाना 11, इन विट्रो आत्मनिर्भर लगातार गतिविधि की पीढ़ी में अध्ययन करने के लिए, और प्रतिक्रिया शामिल हैं।
"ontent> यहाँ हम तीव्र मस्तिष्क के स्लाइस में प्रदर्शन पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग के संदर्भ में बंद लूप electrophysiological प्रोटोकॉल की एक किस्म को लागू करने की अनुमति देता है कि एक शक्तिशाली ढांचे का वर्णन है। हम पैच दबाना रिकॉर्डिंग के माध्यम से दैहिक झिल्ली वोल्टेज रिकॉर्ड करने के लिए कैसे दिखाने किशोर चूहों के somatosensory प्रांतस्था और से पिरामिड न्यूरॉन्स में LCG, सैद्धांतिक तंत्रिका जीव विज्ञान और Neuroengineering की प्रयोगशाला में विकसित एक कमांड लाइन आधारित सॉफ्टवेयर उपकरण बॉक्स का उपयोग करते हुए तीन अलग-अलग बंद लूप प्रोटोकॉल लागू होते हैं।संक्षेप में, वर्णित प्रोटोकॉल सक्रिय और निष्क्रिय झिल्ली गुण का एक बड़ा सेट के लक्षण वर्णन के लिए प्रासंगिक वर्तमान दबाना प्रोत्साहन तरंग, की एक श्रृंखला के पहले स्वचालित इंजेक्शन, कर रहे हैं। ये प्रोत्साहन waveforms के एक टकसाली श्रृंखला के लिए अपनी प्रतिक्रिया गुण के मामले में एक सेल के electrophysiological फेनोटाइप कब्जा करने के लिए सुझाव दिया गया है। एक सेल का ई-कोड के रूप में जाना जाता है (उदाहरण के लिए, देखें & #160, 13,14), बिजली प्रतिक्रियाओं के इस तरह के एक संग्रह निष्पक्ष उनके बिजली के गुणों के आधार पर न्यूरॉन्स वर्गीकृत करने के लिए कई प्रयोगशालाओं द्वारा प्रयोग किया जाता है। यह एक आनुपातिक-अभिन्न व्युत्पन्न (पीआईडी) नियंत्रक के माध्यम से फायरिंग की दर से बंद लूप, वास्तविक समय नियंत्रण शामिल है कि एक नवीन तकनीक से स्थिर इनपुट, आउटपुट स्थानांतरण रिश्ता (Fi वक्र) का विश्लेषण भी शामिल इन विट्रो तैयारी के 10 और, कंप्यूटर से प्रेरित है जो एक आभासी GABAergic interneuron, के माध्यम से दो एक साथ दर्ज पिरामिड न्यूरॉन्स के वास्तविक समय में तीसरे कृत्रिम संबंध में यथार्थवादी इन विवो की तरह पृष्ठभूमि synaptic गतिविधि के दूसरे मनोरंजन।
इसके अतिरिक्त, LCG एक एकल इलेक्ट्रोड का उपयोग कर गतिशील दबाना प्रोटोकॉल को लागू करने की अनुमति देता है जो सक्रिय इलेक्ट्रोड मुआवजा (एईसी) के 15, के रूप में जाना तकनीक लागू करता है। यह अवांछित प्रभाव प्रतिकारी अनुमति देता है (एकrtifacts) यह इंट्रासेल्युलर उत्तेजनाओं पहुंचाने के लिए प्रयोग किया जाता है उठता है कि जब रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड की। विधि रिकॉर्डिंग सर्किट के बराबर बिजली के गुणों की एक गैर पैरामीट्रिक अनुमान पर आधारित है।
इस पत्र में वर्णित तकनीकों और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल आसानी से पारंपरिक खुले पाश वोल्टेज और मौजूदा दबाना प्रयोगों में लागू किया जा सकता है और इन विवो 17,18 में इस तरह के बाह्य 4,16 के रूप में अन्य की तैयारी, या intracellular रिकॉर्डिंग करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। पूरे सेल पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए सेटअप के सावधान विधानसभा स्थिर, उच्च गुणवत्ता रिकॉर्डिंग के लिए एक बहुत ही महत्वपूर्ण कदम है। निम्नलिखित में हम इस तरह के एक प्रयोगात्मक स्थापना प्रयोगकर्ता के लिए पहले से ही उपलब्ध है कि मान, और LCG के उपयोग का वर्णन करने पर हमारा ध्यान केन्द्रित। पाठक अनुकूलन और डीबगिंग के बारे में अतिरिक्त सुझाव के लिए 19-22 की ओर इशारा कर रहा है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पाठ वास्तविक समय के कार्यान्वयन के लिए एक पूर्ण प्रोटोकॉल में, बंद लूप एकल कक्ष electrophysiological प्रयोगों पैच दबाना तकनीक और LCG नामक एक हाल ही में विकसित सॉफ्टवेयर उपकरण बॉक्स का उपयोग करते हुए बताया गया था। र…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financial support from the Flanders Research Foundation FWO (contract n. 12C9112N to DL), the 7th Framework Programme of the European Commission (Marie Curie Network “C7”, contract n. 238214; ICT Future Emerging Technology “ENLIGHTENMENT” project, contract n. 306502), the Interuniversity Attraction Poles Program initiated by the Belgian Science Policy Office (contract n. IUAP-VII/20), and the University of Antwerp is kindly acknowledged.
Materials
| Tissue slicer | Leica | VT-1000S | |
| Pipette puller | Sutter | P-97 | |
| Pipettes | WPI | 1B150F-4 | 1.5/0.84 mm OD/ID, with filament |
| Vibration isolation table | TMC | 20 Series | |
| Microscope | Leica | DMLFS | 40X Immersion Objective |
| Manipulators | Scientifica | PatchStar | |
| Amplifiers | Axon Instruments | MultiClamp 700B | Computer controlled |
| Data acquisition card | National Instruments | PCI-6229 | Supported by Comedi Linux Drivers |
| Desktop computer | Dell | Optiplex 7010 Tower | OS: real-time Linux |
| Oscilloscopes | Tektronix | TDS-1002 | |
| Perfusion Pump | Gibson | MINIPULS3 | Used with R4 Pump head (F117606) |
| Temperature controller | Multichannel Systems | TC02 | PH01 Perfusion Cannula |
| Manometer | Testo | 510 | Optional |
| Incubator | Memmert | WB14 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | ACSF |
| KCl | Sigma | P9541 | ACSF, ICS |
| NaH2PO4 | Sigma | S3139 | ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | ACSF |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | ACSF |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | ACSF |
| Glucose | Sigma | G7528 | ACSF |
| K-Gluconate | Sigma | G4500 | ICS |
| HEPES | Sigma | H3375 | ICS |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | ICS |
| Na2-GTP | Sigma | 51120 | ICS |
| Na2-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | ICS |
Referencias
- Saleem, A. B., Ayaz, A., Jeffery, K. J., Harris, K. D., Carandini, M. Integration of visual motion and locomotion in mouse visual cortex. Nature neuroscience. 16, 1864-1869 (2013).
- Ahrens, M. B., Li, J. M., et al. Brain-wide neuronal dynamics during motor adaptation in zebrafish. Nature. 485 (7399), 471-477 (2012).
- Paz, J. T., Davidson, T. J., et al. Closed-loop optogenetic control of thalamus as a tool for interrupting seizures after cortical injury. Nature neuroscience. 16 (1), 64-70 (2013).
- Wallach, A., Eytan, D., Gal, A., Zrenner, C., Marom, S. Neuronal response clamp. Frontiers in neuroengineering. 3 (April), 3 (2011).
- Linaro, D., Couto, J., Giugliano, M. Command-line cellular electrophysiology for conventional and real-time closed-loop experiments. Journal of neuroscience. 230, 5-19 (2014).
- Sharp, A., O’Neil, M., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. Journal of neurophysiology. 69 (3), 992-995 (1993).
- Robinson, H. P., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. Journal of neuroscience methods. 49 (3), 157-165 (1993).
- Vervaeke, K., Hu, H., Graham, L. J., Storm, J. F. Contrasting effects of the persistent Na+ current on neuronal excitability and spike timing. Neuron. 49 (2), 257-270 (2006).
- White, J. A., Klink, R., Alonso, A., Kay, A. R. Noise from voltage-gated ion channels may influence neuronal dynamics in the entorhinal cortex. Journal of neurophysiology. 80 (1), 262-269 (1998).
- Destexhe, a., Rudolph, M., Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Fluctuating synaptic conductances recreate in vivo-like activity in neocortical neurons. Neurociencias. 107 (1), 13-24 (2001).
- Fellous, J. -. M. Regulation of Persistent Activity by Background Inhibition in an In Vitro Model of a Cortical Microcircuit. Cerebral Cortex. 13 (11), 1232-1241 (2003).
- Gal, A., Eytan, D., Wallach, A., Sandler, M., Schiller, J., Marom, S. Dynamics of excitability over extended timescales in cultured cortical neurons. The Journal of neuroscience. the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (48), 16332-16342 (2010).
- Wang, Y., Toledo-Rodriguez, M., et al. Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat. The Journal of physiology. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).
- Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex). Cerebral cortex (New York, N.Y). 12 (4), 395-410 (1991).
- Brette, R., Piwkowska, Z., et al. High-resolution intracellular recordings using a real-time computational model of the electrode. Neuron. 59 (3), 379-391 (2008).
- Rutishauser, U., Kotowicz, A., Laurent, G. A method for closed-loop presentation of sensory stimuli conditional on the internal brain-state of awake animals. Journal of neuroscience. 215 (1), 139-155 (2013).
- Margrie, T., Brecht, M., Sakmann, B. In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 444 (4), 491-498 (2002).
- Graham, L., Schramm, A. In Vivo Dynamic-Clamp Manipulation of Extrinsic and Intrinsic Conductances: Functional Roles of Shunting Inhibition and I BK in Rat and Cat Cortex. Dynamic Clamp: From Principles to Applications. , (2008).
- Sakmann, B., Neher, E. . Single-channel recording. , (1995).
- Molleman, A. . Patch Clamping. , (2002).
- Davie, J. T., Kole, M. H. P., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nature Protocols. 1 (3), 1235-1247 (2006).
- Gold, R. . The Axon Guide for Electrophysiolog., & Biophysics Laboratory Techniques... , (2007).
- Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. Reliability of spike timing in neocortical neurons. Science. 268 (5216), 1503-1506 (1995).
- Buzsáki, G. Action potential threshold of hippocampal pyramidal cells in vivo is increased by recent spiking activity. Neurociencias. 105 (1), 121-130 (2001).
- Koch, C., Segev, I. . Methods in Neuronal Modeling: From Synapses to Networks. , (1988).
- Silberberg, G., Markram, H. Disynaptic inhibition between neocortical pyramidal cells mediated by Martinotti cells. Neuron. 53 (5), 735-746 (2007).
- Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. Brief bursts self-inhibit and correlate the pyramidal network. PLoS biology. 8 (9), (2010).
- Tsodyks, M., Pawelzik, K., Markram, H. Neural networks with dynamic synapses. Neural computation. 10 (4), 821-835 (1998).
- Kapfer, C., Glickfeld, L. L., Atallah, B. Supralinear increase of recurrent inhibition during sparse activity in the somatosensory cortex. Nature. 10 (6), 743-753 (2007).
