Summary

אלקטרופיזיולוגיה בזמן אמת: שימוש בפרוטוקולי לולאה סגורה לDynamics עצבי בדיקה ומעבר

Published: June 24, 2015
doi:

Summary

Closed-loop protocols are becoming increasingly widespread in modern day electrophysiology. We present a simple, versatile and inexpensive way to perform complex electrophysiological protocols in cortical pyramidal neurons in vitro, using a desktop computer and a digital acquisition board.

Abstract

מדעי מוח ניסיוניים עדים עניין מוגבר בפיתוח והיישום של רומן ופרוטוקולים לעתים קרובות מורכבים, לולאה סגורה, שבו הגירוי מיושם תלוי בזמן אמת על התגובה של המערכת. היישומים אחרונים נעים בין יישום מערכות מציאות מדומה ללימוד תגובות מנוע הן בעכברי 1 ובדג הזברה 2, לשלוט בהתקפים הבאים שבץ קליפת המוח באמצעות optogenetics 3. יתרון עיקרי של טכניקות לולאה סגורה מתגורר ביכולת של חיטוט תכונות ממדיות גבוהות יותר שאינן נגישים באופן ישיר או שתלויות במשתנים רבים, כגון רגישות עצבית 4 ואמינות, ואילו באותו הזמן למקסם את התפוקה הניסיונית. בתרומה זו ובהקשר של אלקטרופיזיולוגיה הסלולרית, אנו מתארים כיצד ליישם מגוון רחב של פרוטוקולי לולאה סגורה לחקר מאפייני התגובה של תאי עצב בקליפת המוח, rec פירמידהorded intracellularly עם טכניקת מהדק תיקון בפרוסות מוח חריפות מהקליפה החושית של חולדות צעירות. כמו שאף תוכנת קוד זמינה מסחרי או פתוחה מספקת את כל התכונות הנדרשות ליעילות ביצוע הניסויים שתוארו כאן, ארגז כלים תוכנה חדש בשם LCG 5 פותחו, שמודולרי מבנה למקסימום שימוש חוזר של קוד מחשב ומאפשר היישום של פרדיגמות ניסוי רומן. גל גירוי מצוין באמצעות מטא-תיאור קומפקטי ופרוטוקולי ניסוי מלאים מתוארים בקבצי תצורה מבוסס טקסט. בנוסף, יש LCG ממשק שורת הפקודה שמתאים לחזרה של ניסויים ואוטומציה של פרוטוקולי ניסוי.

Introduction

בשנים האחרונות, אלקטרופיזיולוגיה הסלולרית התפתחה מהפרדיגמה הלולאה הפתוחה המסורתית מועסקות בניסויי מתח ומהדק הנוכחי לפרוטוקולים לולאה סגורה מודרניים. טכניקת הלולאה סגורה הידועה ביותר היא אולי המהדק הדינמי 6,7, שאיפשר ההזרקה סינתטית של תעלות יונים מתח מגודרת מלאכותיות כדי לקבוע את מתח הקרום העצבי 8, הלימוד המעמיק של תופעות של אי-דטרמיניסטי מהבהבים ב תעלות יונים על דינמיקת תגובה עצבית 9, כמו גם הבילוי במבחנה של מציאותי בvivo- כמו פעילות רקע הסינפטית 10.

פרדיגמות לולאה סגורה אחרות שהוצעו כוללות את המהדק תגובתי 11, ללמוד במבחנה הדור של פעילות מתמשכת עצמית מתמשך, והתגובה לצבוט 4,12, כדי לחקור את המנגנונים התאיים רגישות עצבית בסיסית.

ontent "> כאן אנו מתארים מסגרת רבת עוצמה המאפשרת יישום מגוון רחב של פרוטוקולי אלקטרו לולאה סגורה בהקשר של הקלטות מהדק תיקון כל התא מתבצעות בפרוסות מוח חריפות. אנו מראים כיצד להקליט מתח קרום גופני באמצעות הקלטות מהדק התיקון בתאי עצב פירמידה מהקליפה החושית של חולדות צעירות וליישם שלושה פרוטוקולי לולאה סגורה שונים באמצעות LCG, ארגז כלים תוכנה מבוססת שורת פקודה שפותחו במעבדה לנוירוביולוגיה התיאורטית וNeuroengineering.

בקצרה, הפרוטוקולים המתוארים הם, ראשון ההזרקה האוטומטית של סדרה של צורות גל גירוי המהדק הנוכחיים, רלוונטיים לאפיון של קבוצה גדולה של תכונות קרום אקטיביות ופסיביות. אלה הציעו ללכוד את הפנוטיפ אלקטרו של תא במונחים של הנכסים את תגובתה לסדרה סטריאוטיפית של צורות גל גירוי. ידוע כדואר הקוד של תא (לדוגמא, ראה & #160; 13,14), אוסף כזה של תגובות חשמליות משמש על ידי מספר מעבדות לסווג אובייקטיבי נוירונים על בסיס התכונות החשמלית שלהם. זה כולל ניתוח של יחסי העברת קלט-פלט הנייח (עקומת Fi), על ידי טכניקה חדשנית המערב את הלולאה הסגורה, השליטה בזמן אמת של קצב הירי באמצעות בקר פרופורציונאלי נפרד נגזרים (PID) , שני הבילוי של in vivo דמוי פעילות הסינפטית רקע מציאותי בהכנות במבחנה 10 ו, החיבור המלאכותי שלישי בזמן אמת של שני נוירונים פירמידה נרשמו בו זמנית באמצעות interneuron GABAergic וירטואלי, אשר הוא מדומה על ידי המחשב.

בנוסף, LCG מיישם את הטכניקה המכונית אלקטרודה פעילה פיצויים (AEC) 15, המאפשר יישום פרוטוקולי מהדק דינמיים באמצעות אלקטרודה אחת. זה מאפשר פיצוי השפעות לא רצויות (rtifacts) של האלקטרודה ההקלטה שמתעוררות כאשר הוא משמש להעברת גירויים תאיים. השיטה מבוססת על הערכה שאינה פרמטרית של התכונות חשמליות שווי ערך של מעגל ההקלטה.

הטכניקות ופרוטוקולי ניסוי מתוארים במאמר זה יכולים להיות מיושמים בקלות במתח לולאה הפתוחה קונבנציונלי וניסויים מהדק הנוכחיים וניתן להרחיב את תכשירים אחרים, כגון 4,16 תאיים או הקלטות תאיות in vivo 17,18. ההרכבה זהירה של ההתקנה לאלקטרופיזיולוגיה מהדק תא כל תיקון היא צעד חשוב מאוד להקלטות באיכות יציבה, גבוהות. בחלק הבא תניח שהגדרה כזו ניסיונית כבר זמינה לנסיין, ולמקד את תשומת הלב שלנו על המתאר את השימוש של LCG. הקורא הצביע על 19-22 לטיפים נוספים על אופטימיזציה וניפוי שגיאות.

Protocol

הפרוטוקול המתואר כאן תואם את ההמלצות וההנחיות של ועדת האתיקה של המחלקה למדעים ביו-רפואיים מאוניברסיטת אנטוורפן. פרוטוקול זה דורש ההכנה של חומר שאינו חיים מהמוח של חולדות explanted Wistar לנוער, שהושג על ידי טכניקות המתת חסד הומניות אושרו. <p class="jove_title" style=";text-align:right;direction:rtl…

Representative Results

בסעיפים הקודמים, שתארנו כיצד להשתמש בארגז הכלים LCG תוכנה כדי לאפיין את תכונות אלקטרו של תאי פירמידה L5 ולשחזר in vivo דמוי פעילות הסינפטית בהכנת פרוסה. השימוש בממשק שורת הפקודה ופרוטוקול חצי אוטומטי להעדיף את שחזור ויעילות של הניסוי, אשר יכולה להיות השפעה גדולה על ה?…

Discussion

בטקסט זה פרוטוקול מלא ליישום בזמן אמת, ניסויי אלקטרו תא בודד לולאה סגורה תוארו, באמצעות טכניקת מהדק תיקון וארגז כלים תוכנה שפותח לאחרונה בשם LCG. כדי לייעל את האיכות של הקלטות זה קריטי, כי הגדרת ההקלטה להיות מוארקת כהלכה, מוגן ורטט חופשי: זה מבטיח גישה כל התא יציבה וברה-?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Financial support from the Flanders Research Foundation FWO (contract n. 12C9112N to DL), the 7th Framework Programme of the European Commission (Marie Curie Network “C7”, contract n. 238214; ICT Future Emerging Technology “ENLIGHTENMENT” project, contract n. 306502), the Interuniversity Attraction Poles Program initiated by the Belgian Science Policy Office (contract n. IUAP-VII/20), and the University of Antwerp is kindly acknowledged.

Materials

Tissue slicer Leica VT-1000S
Pipette puller Sutter P-97
Pipettes WPI 1B150F-4 1.5/0.84 mm OD/ID, with filament
Vibration isolation table TMC 20 Series
Microscope Leica DMLFS 40X Immersion Objective
Manipulators Scientifica PatchStar
Amplifiers Axon Instruments MultiClamp 700B Computer controlled
Data acquisition card National Instruments PCI-6229 Supported by Comedi Linux Drivers
Desktop computer Dell Optiplex 7010 Tower OS: real-time Linux
Oscilloscopes Tektronix TDS-1002
Perfusion Pump Gibson MINIPULS3 Used with R4 Pump head (F117606)
Temperature controller Multichannel Systems TC02 PH01 Perfusion Cannula
Manometer Testo 510 Optional
Incubator Memmert WB14
NaCl Sigma 71376 ACSF
KCl Sigma P9541 ACSF, ICS
NaH2PO4 Sigma S3139 ACSF
NaHCO3 Sigma S6014 ACSF
CaCl2 Sigma C1016 ACSF
MgCl2 Sigma M8266 ACSF
Glucose Sigma G7528 ACSF
K-Gluconate Sigma G4500 ICS
HEPES Sigma H3375 ICS
Mg-ATP Sigma A9187 ICS
Na2-GTP Sigma 51120 ICS
Na2-Phosphocreatine Sigma P7936 ICS

Referencias

  1. Saleem, A. B., Ayaz, A., Jeffery, K. J., Harris, K. D., Carandini, M. Integration of visual motion and locomotion in mouse visual cortex. Nature neuroscience. 16, 1864-1869 (2013).
  2. Ahrens, M. B., Li, J. M., et al. Brain-wide neuronal dynamics during motor adaptation in zebrafish. Nature. 485 (7399), 471-477 (2012).
  3. Paz, J. T., Davidson, T. J., et al. Closed-loop optogenetic control of thalamus as a tool for interrupting seizures after cortical injury. Nature neuroscience. 16 (1), 64-70 (2013).
  4. Wallach, A., Eytan, D., Gal, A., Zrenner, C., Marom, S. Neuronal response clamp. Frontiers in neuroengineering. 3 (April), 3 (2011).
  5. Linaro, D., Couto, J., Giugliano, M. Command-line cellular electrophysiology for conventional and real-time closed-loop experiments. Journal of neuroscience. 230, 5-19 (2014).
  6. Sharp, A., O’Neil, M., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. Journal of neurophysiology. 69 (3), 992-995 (1993).
  7. Robinson, H. P., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. Journal of neuroscience methods. 49 (3), 157-165 (1993).
  8. Vervaeke, K., Hu, H., Graham, L. J., Storm, J. F. Contrasting effects of the persistent Na+ current on neuronal excitability and spike timing. Neuron. 49 (2), 257-270 (2006).
  9. White, J. A., Klink, R., Alonso, A., Kay, A. R. Noise from voltage-gated ion channels may influence neuronal dynamics in the entorhinal cortex. Journal of neurophysiology. 80 (1), 262-269 (1998).
  10. Destexhe, a., Rudolph, M., Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Fluctuating synaptic conductances recreate in vivo-like activity in neocortical neurons. Neurociencias. 107 (1), 13-24 (2001).
  11. Fellous, J. -. M. Regulation of Persistent Activity by Background Inhibition in an In Vitro Model of a Cortical Microcircuit. Cerebral Cortex. 13 (11), 1232-1241 (2003).
  12. Gal, A., Eytan, D., Wallach, A., Sandler, M., Schiller, J., Marom, S. Dynamics of excitability over extended timescales in cultured cortical neurons. The Journal of neuroscience. the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (48), 16332-16342 (2010).
  13. Wang, Y., Toledo-Rodriguez, M., et al. Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat. The Journal of physiology. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).
  14. Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex). Cerebral cortex (New York, N.Y). 12 (4), 395-410 (1991).
  15. Brette, R., Piwkowska, Z., et al. High-resolution intracellular recordings using a real-time computational model of the electrode. Neuron. 59 (3), 379-391 (2008).
  16. Rutishauser, U., Kotowicz, A., Laurent, G. A method for closed-loop presentation of sensory stimuli conditional on the internal brain-state of awake animals. Journal of neuroscience. 215 (1), 139-155 (2013).
  17. Margrie, T., Brecht, M., Sakmann, B. In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 444 (4), 491-498 (2002).
  18. Graham, L., Schramm, A. In Vivo Dynamic-Clamp Manipulation of Extrinsic and Intrinsic Conductances: Functional Roles of Shunting Inhibition and I BK in Rat and Cat Cortex. Dynamic Clamp: From Principles to Applications. , (2008).
  19. Sakmann, B., Neher, E. . Single-channel recording. , (1995).
  20. Molleman, A. . Patch Clamping. , (2002).
  21. Davie, J. T., Kole, M. H. P., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nature Protocols. 1 (3), 1235-1247 (2006).
  22. Gold, R. . The Axon Guide for Electrophysiolog., & Biophysics Laboratory Techniques... , (2007).
  23. Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. Reliability of spike timing in neocortical neurons. Science. 268 (5216), 1503-1506 (1995).
  24. Buzsáki, G. Action potential threshold of hippocampal pyramidal cells in vivo is increased by recent spiking activity. Neurociencias. 105 (1), 121-130 (2001).
  25. Koch, C., Segev, I. . Methods in Neuronal Modeling: From Synapses to Networks. , (1988).
  26. Silberberg, G., Markram, H. Disynaptic inhibition between neocortical pyramidal cells mediated by Martinotti cells. Neuron. 53 (5), 735-746 (2007).
  27. Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. Brief bursts self-inhibit and correlate the pyramidal network. PLoS biology. 8 (9), (2010).
  28. Tsodyks, M., Pawelzik, K., Markram, H. Neural networks with dynamic synapses. Neural computation. 10 (4), 821-835 (1998).
  29. Kapfer, C., Glickfeld, L. L., Atallah, B. Supralinear increase of recurrent inhibition during sparse activity in the somatosensory cortex. Nature. 10 (6), 743-753 (2007).
check_url/es/52320?article_type=t

Play Video

Citar este artículo
Linaro, D., Couto, J., Giugliano, M. Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond. J. Vis. Exp. (100), e52320, doi:10.3791/52320 (2015).

View Video