Électrophysiologie en temps réel: en utilisant des protocoles en boucle fermée à la sonde neuronaux Dynamics et au-delà
Summary
Closed-loop protocols are becoming increasingly widespread in modern day electrophysiology. We present a simple, versatile and inexpensive way to perform complex electrophysiological protocols in cortical pyramidal neurons in vitro, using a desktop computer and a digital acquisition board.
Abstract
Neurosciences expérimentales est témoin d'un intérêt accru dans le développement et l'application de nouveaux protocoles et souvent complexes, en boucle fermée, où le stimulus appliqué dépend en temps réel sur la réponse du système. Les applications récentes vont de la mise en œuvre de systèmes de réalité virtuelle pour étudier les réponses motrices à la fois chez la souris et chez le poisson zèbre 1 2, pour contrôler des crises après un AVC corticale en utilisant l'optogénétique 3. Un des principaux avantages des techniques à boucle fermée réside dans la capacité de palpage caractéristiques dimensionnelles plus élevées qui ne sont pas directement accessibles ou qui dépendent de plusieurs variables, telles que l'excitabilité neuronale 4 et la fiabilité, tout en maximisant le débit expérimentale. Dans cette contribution, et dans le contexte de l'électrophysiologie cellulaire, nous décrivons comment appliquer une variété de protocoles en boucle fermée à l'étude des propriétés des pyramidale neurones corticaux, rec réponseorded intracellulaire avec la technique de patch-clamp en tranches de cerveau aiguë du cortex somatosensoriel de jeunes rats. Comme aucun logiciel à code source disponible dans le commerce ou ouverte offre toutes les fonctionnalités nécessaires pour effectuer efficacement les expériences décrites ici, une nouvelle boîte à outils logicielle appelée LCG 5 a été développé, dont la structure modulaire optimise la réutilisation de code informatique et facilite la mise en œuvre de nouveaux paradigmes expérimentaux. formes d'onde de stimulation sont spécifiées en utilisant une méta-description compacte et protocoles expérimentaux complets sont décrits dans les fichiers de configuration à base de texte. En outre, LCG dispose d'une interface de ligne de commande qui est adapté à la répétition des essais et de l'automatisation des protocoles expérimentaux.
Introduction
Au cours des dernières années, l'électrophysiologie cellulaire a évolué à partir du paradigme en boucle ouverte traditionnelle utilisée dans les expériences de tension et de serrage courant des protocoles en boucle fermée modernes. La technique en boucle fermée le plus connu est peut-être la pince dynamique 6,7, qui a permis l'injection synthétique de canaux voltage-dépendants artificiels ion pour déterminer la tension de la membrane neuronale 8, l'étude approfondie des effets de la non-déterministe vacillante sur canaux ioniques sur la dynamique de réponse neuronale 9, ainsi que la récréation in vitro de réaliste dans vivo- comme activité de fond synaptique 10.
D'autres paradigmes en boucle fermée qui ont été proposées comprennent la pince réactive 11, pour étudier in vitro la génération de l'activité persistante auto-entretenue, et la réponse serrer 4,12, pour enquêter sur les mécanismes cellulaires de l'excitabilité neuronale sous-jacente.
ontenu "> Ici, nous décrivons un cadre puissant qui permet l'application d'une variété de boucle fermée protocoles électrophysiologiques dans le cadre d'enregistrements patch clamp de cellules entières effectuées dans des tranches de cerveau aigus. Nous montrons comment enregistrer la tension de la membrane somatique au moyen d'enregistrements de patch-clamp dans les neurones pyramidaux du cortex somatosensoriel de rats juvéniles et appliquer trois protocoles en boucle fermée à l'aide de différents LCG, une boîte à outils de logiciels basés sur la ligne de commande développé dans le laboratoire de neurobiologie théorique et Neuroengineering.En bref, les protocoles décrits sont, d'abord l'injection automatique d'une série de formes d'onde pince de relance actuelles, pertinentes pour la caractérisation d'un grand ensemble de propriétés des membranes actives et passives. Ceux-ci ont été suggérées pour capturer le phénotype électrophysiologique d'une cellule en termes de ses propriétés de réponse à une série stéréotypée de formes d'onde de relance. Connu comme le e-code d'une cellule (par exemple, voir & #160; 13,14), une telle collection de réponses électriques est utilisé par plusieurs laboratoires de classer objectivement neurones sur la base de leurs propriétés électriques. Cela comprend l'analyse de la relation de transfert d'entrée-sortie fixe (courbe FI), par une technique innovante qui consiste à boucle fermée, le contrôle en temps réel de la vitesse de mise à feu au moyen d'un dispositif de commande (PID) proportionnel-intégral-dérivé , deuxième de la récréation vivo -comme activité réaliste de fond synaptique dans les préparations in vitro et 10, troisième la connexion artificielle en temps réel de deux neurones pyramidaux enregistrées simultanément au moyen d'un interneurone GABAergique virtuel, qui est simulé par l'ordinateur.
En outre, LCG met en œuvre la technique dite électrode active rémunération (AEC) 15, qui permet la mise en œuvre des protocoles de serrage dynamiques en utilisant une seule électrode. Ceci permet de compenser les effets indésirables (artifacts) de l'électrode d'enregistrement qui se pose lorsqu'il est utilisé pour délivrer des stimuli intracellulaires. La méthode est basée sur une estimation non paramétrique des caractéristiques électriques équivalentes du circuit d'enregistrement.
Les techniques et les protocoles expérimentaux décrits dans le présent document peuvent être facilement appliquées dans la tension en boucle ouverte conventionnelle et expériences de serrage actuels et peuvent être étendus à d'autres préparations, comme extracellulaire 4,16 ou enregistrements intracellulaires in vivo 17,18. L'assemblée attentive de la configuration pour le patch de cellules entières pince électrophysiologie est une étape très importante pour la stabilité, des enregistrements de haute qualité. Dans ce qui suit, nous supposons qu'un tel dispositif expérimental est déjà disponible à l'expérimentateur, et concentrons notre attention sur la description de l'utilisation du LCG. Le lecteur est pointé à 19-22 pour obtenir des conseils supplémentaires sur l'optimisation et le débogage.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce texte, un protocole complet pour la mise en œuvre en temps réel, en boucle fermée monocellulaires expériences électrophysiologiques ont été décrits, en utilisant la technique du patch clamp et une boîte à outils du logiciel développé récemment appelé LCG. Pour optimiser la qualité des enregistrements, il est crucial que la configuration de l'enregistrement soit correctement mise à la terre, à l'abri et sans vibration: ce qui garantit l'accès à cellules entières stable et durable ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financial support from the Flanders Research Foundation FWO (contract n. 12C9112N to DL), the 7th Framework Programme of the European Commission (Marie Curie Network “C7”, contract n. 238214; ICT Future Emerging Technology “ENLIGHTENMENT” project, contract n. 306502), the Interuniversity Attraction Poles Program initiated by the Belgian Science Policy Office (contract n. IUAP-VII/20), and the University of Antwerp is kindly acknowledged.
Materials
| Tissue slicer | Leica | VT-1000S | |
| Pipette puller | Sutter | P-97 | |
| Pipettes | WPI | 1B150F-4 | 1.5/0.84 mm OD/ID, with filament |
| Vibration isolation table | TMC | 20 Series | |
| Microscope | Leica | DMLFS | 40X Immersion Objective |
| Manipulators | Scientifica | PatchStar | |
| Amplifiers | Axon Instruments | MultiClamp 700B | Computer controlled |
| Data acquisition card | National Instruments | PCI-6229 | Supported by Comedi Linux Drivers |
| Desktop computer | Dell | Optiplex 7010 Tower | OS: real-time Linux |
| Oscilloscopes | Tektronix | TDS-1002 | |
| Perfusion Pump | Gibson | MINIPULS3 | Used with R4 Pump head (F117606) |
| Temperature controller | Multichannel Systems | TC02 | PH01 Perfusion Cannula |
| Manometer | Testo | 510 | Optional |
| Incubator | Memmert | WB14 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | ACSF |
| KCl | Sigma | P9541 | ACSF, ICS |
| NaH2PO4 | Sigma | S3139 | ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | ACSF |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | ACSF |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | ACSF |
| Glucose | Sigma | G7528 | ACSF |
| K-Gluconate | Sigma | G4500 | ICS |
| HEPES | Sigma | H3375 | ICS |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | ICS |
| Na2-GTP | Sigma | 51120 | ICS |
| Na2-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | ICS |
Referencias
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