في الوقت الحقيقي الكهربية: استخدام البروتوكولات ذات الحلقات المغلقة للتحقيق العصبية حيوية وما بعدها
Summary
Closed-loop protocols are becoming increasingly widespread in modern day electrophysiology. We present a simple, versatile and inexpensive way to perform complex electrophysiological protocols in cortical pyramidal neurons in vitro, using a desktop computer and a digital acquisition board.
Abstract
علم الأعصاب التجريبي يشهد اهتماما متزايدا في تطوير وتطبيق الرواية وغالبا ما تكون معقدة والبروتوكولات حلقة مغلقة، حيث تطبق التحفيز يعتمد في الوقت الحقيقي على الاستجابة للنظام. وتتراوح التطبيقات التي صدرت مؤخرا عن تنفيذ نظم الواقع الافتراضي لدراسة الاستجابات الحركية في كل من الفئران 1 و 2 في الزرد، للسيطرة على النوبات التالية السكتة الدماغية القشرية باستخدام optogenetics 3. والميزة الرئيسية لتقنيات حلقة مغلقة تكمن في القدرة على سبر خصائص أعلى من الأبعاد التي لا يمكن الوصول إليها مباشرة أو التي تعتمد على متغيرات متعددة مثل استثارة الخلايا العصبية 4 والموثوقية، وفي الوقت نفسه تحقيق أقصى قدر من الإنتاجية التجريبية. في هذه المساهمة وفي سياق الكهربية الخلوية، ونحن تصف كيفية تطبيق مجموعة متنوعة من البروتوكولات حلقة مغلقة لدراسة خصائص استجابة الخلايا العصبية القشرية هرمي، التوصيةأورديد داخل الخلية مع تقنية المشبك التصحيح في شرائح الدماغ الحادة من القشرة الحسية الجسدية من الفئران الأحداث. كما لا يقدم أي برمجيات المصدر المتاحة تجاريا أو فتح جميع الميزات المطلوبة لأداء بكفاءة التجارب وصفها هنا، تم تطوير برنامج مربع أدوات جديدة تسمى LCG 5، الذي يعظم إعادة استخدام التعليمات البرمجية للكمبيوتر ويسهل تنفيذ النماذج التجريبية رواية هيكل وحدات. يتم تحديد الطول الموجي التحفيز باستخدام المدمجة الفوقية الوصف ويتم وصف البروتوكولات التجريبية الكاملة في ملفات التكوين يستند إلى نص. بالإضافة إلى ذلك، LCG لديه واجهة سطر الأوامر التي هي مناسبة لتكرار التجارب وأتمتة البروتوكولات التجريبية.
Introduction
في السنوات الأخيرة، تطورت الكهربية الخلوية من التقليدي نموذج حلقة مفتوحة العاملين في التيار الكهربائي والمشبك الحالي تجارب لحديثة بروتوكولات حلقة مغلقة. تقنية حلقة مغلقة أشهرها وربما كان المشبك دينامية 6،7، الأمر الذي مكن حقن الاصطناعية من القنوات ايون الجهد بوابات الاصطناعية لتحديد غشاء الخلايا العصبية الجهد 8، ودراسة متعمقة للآثار غير القطعية الخفقان على القنوات الأيونية على ديناميكيات استجابة الخلايا العصبية 9، فضلا عن الترفيه في المختبر من واقعية في vivo- مثل النشاط خلفية متشابك 10.
وتشمل غيرها من النماذج حلقة مغلقة التي تم اقتراحها المشبك رد الفعل 11، للدراسة في المختبر توليد النشاط المستمر مكتفية ذاتيا، والاستجابة المشبك 4،12، للتحقيق في الآليات الخلوية الكامنة استثارة الخلايا العصبية.
ontent "> هنا نحن تصف الإطار القوي الذي يسمح بتطبيق مجموعة متنوعة من البروتوكولات الكهربية المغلقة حلقة في سياق كامل الخلية التسجيلات المشبك التصحيح التي أجريت في شرائح الدماغ الحادة. نظهر كيفية تسجيل الجسدية غشاء الجهد عن طريق التسجيلات المشبك التصحيح في الخلايا العصبية الهرمية من القشرة الحسية الجسدية من الفئران الأحداث وتطبيق ثلاثة بروتوكولات مختلفة حلقة مغلقة باستخدام LCG، وهو برنامج الأدوات القائمة على سطر الأوامر نموا في مختبر البيولوجيا العصبية النظرية وNeuroengineering.لفترة وجيزة، والبروتوكولات المذكورة هي، أولا الحقن الآلي من سلسلة من الطول الموجي المشبك التحفيز الحالية، ذات الصلة لتوصيف مجموعة كبيرة من خصائص الغشاء الإيجابي والسلبي. وقد اقترحت هذه للقبض على النمط الظاهري الكهربية من خلية من حيث الخصائص ردها على سلسلة نمطية من الطول الموجي التحفيز. تعرف علي اكواد الإلكتروني للخلية (على سبيل المثال، انظر & #160؛ 13،14)، يتم استخدام هذه المجموعة من الاستجابات الكهربائية من قبل العديد من المختبرات لتصنيف موضوعي الخلايا العصبية على أساس خصائصها الكهربائية. ويشمل ذلك تحليل للعلاقة ثابتة نقل المدخلات والمخرجات (منحنى فاي)، بواسطة تقنية مبتكرة ينطوي على حلقة مغلقة، ومراقبة الوقت الحقيقي من معدل اطلاق النار عن طريق (PID) وحدة تحكم يتناسب-يتجزأ المشتقة والثانية في الترفيه واقعية في الجسم الحي تشبه خلفية النشاط متشابك في المختبر في الاستعدادات 10، والثالث على اتصال الاصطناعي في الوقت الحقيقي من اثنين من الخلايا العصبية الهرمية سجلت في وقت واحد عن طريق GABAergic عصبون الظاهري، الذي هو محاكاة بواسطة الكمبيوتر.
بالإضافة إلى ذلك، LCG تطبق تقنية تعرف باسم نشط الكهربائي التعويض (AEC) 15، والذي يسمح بتنفيذ البروتوكولات المشبك الديناميكية باستخدام قطب واحد. وهذا يسمح تعويض آثار غير مرغوب فيها (أrtifacts) من تسجيل الكهربائي التي تنشأ عندما يتم استخدامها لتقديم المحفزات داخل الخلايا. وتستند هذه الطريقة على تقدير غير حدودي من الخواص الكهربائية ما يعادل الدائرة تسجيل.
التقنيات والبروتوكولات التجريبية وصفها في هذه الورقة يمكن تطبيقها بسهولة في التقليدي المفتوح حلقة الجهد والتجارب المشبك الحالية ويمكن أن تمتد إلى الاستعدادات الأخرى، مثل الخلية 4،16 أو تسجيلات داخل الخلايا في الجسم الحي 17،18. الجمعية دقيق لالإعداد لالمشبك التصحيح خلية كاملة الكهربية هو خطوة مهمة للغاية بالنسبة مستقرة، تسجيلات عالية الجودة. في ما يلي افترضنا أن مثل هذا الإعداد التجريبية متاحة بالفعل للاختبارات، ونركز اهتمامنا على وصف استخدام LCG. وأشار القارئ إلى 19-22 للحصول على نصائح إضافية حول التحسين والتصحيح.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا النص بروتوكول الكامل للتنفيذ في الوقت الحقيقي، وصفت حلقة مغلقة خلية واحدة تجارب الكهربية، وذلك باستخدام تقنية المشبك التصحيح ومجموعة أدوات برنامج تم تطويره مؤخرا دعا LCG. لتحسين جودة التسجيلات فمن الأهمية بمكان أن الإعداد تسجيل أن ترتكز بشكل صحيح، محمية والاه…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financial support from the Flanders Research Foundation FWO (contract n. 12C9112N to DL), the 7th Framework Programme of the European Commission (Marie Curie Network “C7”, contract n. 238214; ICT Future Emerging Technology “ENLIGHTENMENT” project, contract n. 306502), the Interuniversity Attraction Poles Program initiated by the Belgian Science Policy Office (contract n. IUAP-VII/20), and the University of Antwerp is kindly acknowledged.
Materials
| Tissue slicer | Leica | VT-1000S | |
| Pipette puller | Sutter | P-97 | |
| Pipettes | WPI | 1B150F-4 | 1.5/0.84 mm OD/ID, with filament |
| Vibration isolation table | TMC | 20 Series | |
| Microscope | Leica | DMLFS | 40X Immersion Objective |
| Manipulators | Scientifica | PatchStar | |
| Amplifiers | Axon Instruments | MultiClamp 700B | Computer controlled |
| Data acquisition card | National Instruments | PCI-6229 | Supported by Comedi Linux Drivers |
| Desktop computer | Dell | Optiplex 7010 Tower | OS: real-time Linux |
| Oscilloscopes | Tektronix | TDS-1002 | |
| Perfusion Pump | Gibson | MINIPULS3 | Used with R4 Pump head (F117606) |
| Temperature controller | Multichannel Systems | TC02 | PH01 Perfusion Cannula |
| Manometer | Testo | 510 | Optional |
| Incubator | Memmert | WB14 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | ACSF |
| KCl | Sigma | P9541 | ACSF, ICS |
| NaH2PO4 | Sigma | S3139 | ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | ACSF |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | ACSF |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | ACSF |
| Glucose | Sigma | G7528 | ACSF |
| K-Gluconate | Sigma | G4500 | ICS |
| HEPES | Sigma | H3375 | ICS |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | ICS |
| Na2-GTP | Sigma | 51120 | ICS |
| Na2-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | ICS |
Referencias
- Saleem, A. B., Ayaz, A., Jeffery, K. J., Harris, K. D., Carandini, M. Integration of visual motion and locomotion in mouse visual cortex. Nature neuroscience. 16, 1864-1869 (2013).
- Ahrens, M. B., Li, J. M., et al. Brain-wide neuronal dynamics during motor adaptation in zebrafish. Nature. 485 (7399), 471-477 (2012).
- Paz, J. T., Davidson, T. J., et al. Closed-loop optogenetic control of thalamus as a tool for interrupting seizures after cortical injury. Nature neuroscience. 16 (1), 64-70 (2013).
- Wallach, A., Eytan, D., Gal, A., Zrenner, C., Marom, S. Neuronal response clamp. Frontiers in neuroengineering. 3 (April), 3 (2011).
- Linaro, D., Couto, J., Giugliano, M. Command-line cellular electrophysiology for conventional and real-time closed-loop experiments. Journal of neuroscience. 230, 5-19 (2014).
- Sharp, A., O’Neil, M., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. Journal of neurophysiology. 69 (3), 992-995 (1993).
- Robinson, H. P., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. Journal of neuroscience methods. 49 (3), 157-165 (1993).
- Vervaeke, K., Hu, H., Graham, L. J., Storm, J. F. Contrasting effects of the persistent Na+ current on neuronal excitability and spike timing. Neuron. 49 (2), 257-270 (2006).
- White, J. A., Klink, R., Alonso, A., Kay, A. R. Noise from voltage-gated ion channels may influence neuronal dynamics in the entorhinal cortex. Journal of neurophysiology. 80 (1), 262-269 (1998).
- Destexhe, a., Rudolph, M., Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Fluctuating synaptic conductances recreate in vivo-like activity in neocortical neurons. Neurociencias. 107 (1), 13-24 (2001).
- Fellous, J. -. M. Regulation of Persistent Activity by Background Inhibition in an In Vitro Model of a Cortical Microcircuit. Cerebral Cortex. 13 (11), 1232-1241 (2003).
- Gal, A., Eytan, D., Wallach, A., Sandler, M., Schiller, J., Marom, S. Dynamics of excitability over extended timescales in cultured cortical neurons. The Journal of neuroscience. the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (48), 16332-16342 (2010).
- Wang, Y., Toledo-Rodriguez, M., et al. Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat. The Journal of physiology. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).
- Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex). Cerebral cortex (New York, N.Y). 12 (4), 395-410 (1991).
- Brette, R., Piwkowska, Z., et al. High-resolution intracellular recordings using a real-time computational model of the electrode. Neuron. 59 (3), 379-391 (2008).
- Rutishauser, U., Kotowicz, A., Laurent, G. A method for closed-loop presentation of sensory stimuli conditional on the internal brain-state of awake animals. Journal of neuroscience. 215 (1), 139-155 (2013).
- Margrie, T., Brecht, M., Sakmann, B. In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 444 (4), 491-498 (2002).
- Graham, L., Schramm, A. In Vivo Dynamic-Clamp Manipulation of Extrinsic and Intrinsic Conductances: Functional Roles of Shunting Inhibition and I BK in Rat and Cat Cortex. Dynamic Clamp: From Principles to Applications. , (2008).
- Sakmann, B., Neher, E. . Single-channel recording. , (1995).
- Molleman, A. . Patch Clamping. , (2002).
- Davie, J. T., Kole, M. H. P., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nature Protocols. 1 (3), 1235-1247 (2006).
- Gold, R. . The Axon Guide for Electrophysiolog., & Biophysics Laboratory Techniques... , (2007).
- Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. Reliability of spike timing in neocortical neurons. Science. 268 (5216), 1503-1506 (1995).
- Buzsáki, G. Action potential threshold of hippocampal pyramidal cells in vivo is increased by recent spiking activity. Neurociencias. 105 (1), 121-130 (2001).
- Koch, C., Segev, I. . Methods in Neuronal Modeling: From Synapses to Networks. , (1988).
- Silberberg, G., Markram, H. Disynaptic inhibition between neocortical pyramidal cells mediated by Martinotti cells. Neuron. 53 (5), 735-746 (2007).
- Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. Brief bursts self-inhibit and correlate the pyramidal network. PLoS biology. 8 (9), (2010).
- Tsodyks, M., Pawelzik, K., Markram, H. Neural networks with dynamic synapses. Neural computation. 10 (4), 821-835 (1998).
- Kapfer, C., Glickfeld, L. L., Atallah, B. Supralinear increase of recurrent inhibition during sparse activity in the somatosensory cortex. Nature. 10 (6), 743-753 (2007).
