Adaptação Humanos videofluoroscópicos Andorinha Métodos de Estudo de detectar e caracterizar Disfagia em modelos de doenças Murino
Summary
Este estudo adaptado com sucesso deglutição estudo (VFSS) métodos humanos para uso com modelos de doenças murino com a finalidade de facilitar a investigação translacional disfagia.
Abstract
Este estudo adaptado videofluoroscópica humano deglutição (VFSS) métodos para uso com modelos de doenças murino com a finalidade de facilitar a investigação translacional disfagia. Resultados bem sucedidos dependem três componentes críticos: câmaras de ensaio que permitam a auto-alimentação ao estar desenfreado em um espaço confinado, receitas que mascaram o sabor aversivo / odor de agentes de contraste orais comercialmente disponíveis, e um protocolo de passo-a-passo de teste que permite a quantificação da fisiologia andorinha. A eliminação de um ou mais desses componentes vai ter um impacto negativo nos resultados do estudo. Além disso, o nível de energia de capacidade de o sistema irá determinar que a fluoroscopia engolir parâmetros podem ser investigados. A maioria dos centros de pesquisa têm fluoroscopia de alta energia projetados para uso com pessoas e animais de maior porte, o que resulta em má qualidade de imagem excepcional ao testar ratos e outros pequenos roedores. Apesar dessa limitação, identificamos sete VFSS parâmetros que são consistentemente quantificáveis em ratinhos quando usando um fluoroscópio alta energia em combinação com o novo protocolo VFSS murino. Nós obtivemos recentemente um sistema de baixa fluoroscopia energia com capacidades excepcionalmente de alta resolução de imagem e ampliação que foi projetado para uso com ratos e outros pequenos roedores. Trabalhos preliminares de usar este novo sistema, em combinação com o novo protocolo VFSS murino, identificou 13 parâmetros andorinha que são consistentemente quantificáveis em camundongos, o que é quase o dobro do número obtido usando convencional (ou seja, de alta energia) fluoroscopia. Identificação de parâmetros adicionais andorinha é esperado como otimizar as capacidades deste novo sistema. Os resultados até agora demonstrar a utilidade do uso de um sistema de fluoroscopia de energia de baixo para detectar e quantificar mudanças sutis na fisiologia andorinha que podem passar despercebidas quando se usa fluoroscopia de alta energia para investigar modelos de doenças murino.
Introduction
Disfagia (distúrbio de deglutição) é um sintoma comum de várias condições médicas que afetam as pessoas de todas as idades. Exemplos incluem acidente vascular cerebral, doença de Parkinson, doença de Alzheimer, paralisia cerebral, distrofia muscular, esclerose lateral amiotrófica (ELA), doença de Batten, câncer de cabeça e pescoço, o nascimento prematuro, e idade avançada. A disfagia é altamente correlacionado com a mortalidade, geralmente como consequência de desnutrição ou pneumonia grave que se desenvolve quando bacteriana-laden comida / líquido / saliva é aspirado para os pulmões 1-4. Esta condição médica debilitante e com risco de vida afeta mais de 15 milhões de pessoas a cada ano nos Estados Unidos sozinho 3. Apesar da alta prevalência e os resultados negativos associados, as opções atuais de tratamento para a disfagia são limitados a paliativos (e não curativa) se aproxima, como a modificação da dieta (por exemplo, evitando as consistências de alimentos / líquidos específicos), alterações posturais (por exemplo, Tucking o queixo quando engolir), abordagens a motor (por exemplo, exerce o direccionamento músculos na cavidade oral, faringe, laringe e), abordagens sensoriais (por exemplo, aroma de execução, a temperatura, e / ou de estimulação mecânica), e tubo de alimentação (por exemplo, a nutrição e hidratação administrados via nasogástrica (NG) tubo de gastrostomia endoscópica percutânea ou (PEG) tubo). Estes tratamentos servem apenas como terapia sintomática em vez de mirar as causas subjacentes do problema. Na verdade, uma grande barreira para a descoberta de novos tratamentos eficazes, para a disfagia é o conhecimento científico limitado de mecanismos patológicos responsáveis, que provavelmente diferente para cada doença.
Diagnóstico Disfagia é predominantemente feita através de um procedimento radiográfico chamado de deglutição estudo (VFSS), também conhecido como um estudo de bário modificado. Ao longo dos últimos 30 anos ou mais, este teste de diagnóstico tem sido considerada o padrão-ouro para evaluating função andorinha 5-7. Este teste implica ter o paciente se sentar ou ficar no caminho do feixe de raios-X de uma máquina de fluoroscopia enquanto voluntariamente a ingestão de alimentos e consistências líquida misturada com um agente de contraste oral, tipicamente sulfato de bário 8,9 ou iohexol 10. À medida que o paciente engole, alimentos e líquido contendo agente de contraste pode ser observada em tempo real através de um monitor de computador, enquanto viaja a partir da boca para o estômago. Estruturas de tecido mole também são visíveis e podem ser avaliados em relação à estrutura e função. Os doentes são chamados a realizar vários goles de cada alimento e consistência líquida, todos os quais são vídeos gravados para posterior visualização e análise de frame-by-frame para quantificar a presença eo grau de disfagia. Numerosos componentes fisiológicos de engolir normalmente são analisados, como o ponto de disparo anatômica da andorinha da faringe, o tempo de trânsito bolus através da faringe e esôfago, extensão e duração do laryngeal elevação, localização e quantidade de resíduo pós-andorinha, e ocorrência de e razão fisiológica para aspiração 7,11.
Aspectos do protocolo VFSS humano foram recentemente adaptado para o estudo ratos livremente comportando; no entanto, os resultados foram limitados porque os ratos não permanecer no campo videofluoroscópica de vista durante o teste 12. VFSS não tenha sido previamente tentada com ratinhos. A adaptação bem sucedida do protocolo VFSS humano para utilização com ratos e ratazanas iria proporcionar um método novo de pesquisa para investigar as centenas de modelos de doenças que são conhecidos por causar disfagia em humanos actualmente existente murino (ratinho e rato). Este novo método (doravante referida como VFSS murina), portanto, acelerar a identificação e validação de modelos murinos de disfagia que são adequados para investigar os mecanismos neurofisiológicos subjacentes no tecido músculos, nervos e cérebro que são patológico e contribuindo para a disfagia in humanos. Além disso, murino VFSS iria permitir a identificação de medidas objetivas (biomarcadores) de capacidade de deglutição / disfunção que poderia ser comparado diretamente com os seres humanos. Estas espécies cruzadas biomarcadores videofluoroscópicos poderia então servir medidas de resultados, como novos para quantificar a eficácia do tratamento em ensaios pré-clínicos com camundongos e ratos, o que melhor traduzem em ensaios clínicos com pessoas.
Para esse efeito, o protocolo VFSS murino foi estabelecida utilizando ~ 100 ratinhos de ambos os sexos. Todos os ratos eram ou C57 ou híbridos estirpes C57 / SJL. Os ratinhos C57 não foram geneticamente alterados, enquanto C57 / SJL foi a estirpe de fundo para uma colónia de murganhos transgénicos G93A-SOD1 (ou SOD1), o modelo animal mais largamente utilizado dos ALS. A colônia SOD1 foi um aproximada de 50-50 mix de transgênicos (ou seja, ALS-afetados) ratos e não transgênicas (ou seja, não afetados) ninhada.
O protocolo VFSS murino consiste em três componentes:
- <li> câmaras de observação a pedido de clientes que permitem a alimentação voluntária e deglutição ao estar desenfreado em um espaço confinado dentro de uma máquina de fluoroscopia,
- Receitas que mascaram o sabor aversivo / odor de agentes de contraste oral e produzem radiodensity suficiente para permitir a visualização adequada da deglutição,
- Um protocolo passo-a-passo de teste que maximiza o cumprimento animal, minimiza o tempo total do teste e a exposição à radiação, e permite a quantificação de vários parâmetros de andorinha para cada fase da deglutição (ou seja, oral, faringe, esófago e).
O efeito combinado produz um baixo stress, ambiente confortável, auto-alimentando exame que permite a avaliação da alimentação típica e deglutição comportamentos de ratos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Centenas de modelos murina (rato e rato) estão comercialmente disponíveis para estudar doenças humanas. No entanto, apenas três modelos de doenças murino foram investigadas especificamente em relação à disfagia: um modelo de mouse ALS 13,14 e ratos modelos da doença de Parkinson 12,15-17 e acidente vascular cerebral 18. Cada um desses estudos preliminares utilizados diferentes metodologias para avaliar a disfagia, tornando-o impossível derivar comparações significativas entre espécies e doenças. Esta importante limitação pode ser superada em estudos futuros, utilizando o protocolo VFSS murino recém-desenvolvido que permite a quantificação objetiva de inúmeros parâmetros Andorinha em animais auto-alimentação.
VFSS resultados bem-sucedidos são depende de três componentes críticos: 1) câmaras de teste que permitem a auto-alimentação ao estar desenfreado em um espaço confinado, 2) receitas que mascaram o sabor aversivo / odor de venda no mercado ag contraste oralentos, e 3) um protocolo de teste passo-a-passo que permite a quantificação da fisiologia engolir. O efeito combinado produz um baixo stress, ambiente confortável, auto-alimentando exame que evoca alimentação típica e comportamentos de deglutição. A eliminação de um ou mais desses componentes vai ter um impacto negativo nos resultados do estudo. Exemplos de resultados negativos incluem a incapacidade de manter os animais no campo fluoroscopia de vista, comportamentos indesejáveis que distraem de beber, a aversão ao agente de contraste oral, e incapacidade de quantificar parâmetros engolir devido a episódios de bebedeira insuficientes.
Um dos grandes desafios na obtenção de resultados ótimos VFSS estava projetando uma câmara de teste adequado. Numerosas revisões de nosso projeto protótipo culminou em uma câmara de observação que mantém suficientemente ratos no campo de visão e previne comportamentos que distraem de beber. As câmaras foram feitas utilizando máquinas de trituração para obter dimensões uniformes de the tubos e tampas finais, garantindo assim a permutabilidade de componentes para várias câmaras de observação do mesmo diâmetro. As dimensões internas (diâmetro e comprimento) foram pareados a ser um pouco maior do que o tamanho do corpo de um rato adulto, o que resultou em uma câmara de teste suficientemente estreito que permite andar em linha reta e se virar. O desenho estreito, em combinação com o posicionamento estratégico do bico e da cavilha de taça em somente no final, mantém a cabeça e corpo de ratos alinhadas ao longo do comprimento da câmara, enquanto o consumo. Uma vez envolvido em beber, ratos permanecem notavelmente auto-estabilizado no bico ou tigela por alguns segundos de cada vez, resultando em artefato movimento mínimo para interferir com o teste. Assim, é possível obter sem distorções, observação close-up de gravação / vídeo e imagem videofluoroscópica de ratos, enquanto o consumo nos planos laterais e dorso-ventral.
Ratos (e outros pequenos roedores) são naturalmente inclinados a verk abrigo em espaços pequenos. Como resultado, eles entrar livremente na câmara de ensaio (com uma extremidade já fechada por uma tampa final), quando ele é colocado na gaiola, eliminando desse modo o esforço / ansiedade causados por manuseamento (isto é, escolhe-se manualmente o animal para colocá-lo na câmara). Uma vez que o rato entra na câmara, a outra extremidade é fechada por uma ponteira de fixação tampa 2 nd. Este projeto impede fuga ao criar uma câmara de teste ansiedade baixo para os ratos para explorar livremente.
A forma quadrada da câmara fornece base de estabilidade de movimento que permite que ele seja utilizado de uma maneira livre de pé, eliminando assim a necessidade de testes dentro de uma gaiola de roedor padrão. Todo o aparelho é leve, portátil, empilhável para fins de armazenamento, resistente, fácil de limpar e pode ser autoclavado. Ainda que as câmaras foram inicialmente projetados para uso com fluoroscopia, eles também são compatíveis com a radiografia spot-filme, neuroimagem (por exemplo, ressonância magnética, PET, CT), e visual observação / gravação de vídeo de vários comportamentos.
Um segundo grande desafio de superar foi mascarar o aversivo gosto / odor de agentes de contraste orais (ou seja, sulfato de bário e Iohexol). Dado que a sensibilidade ao sabor varia amplamente entre as estirpes de ratinho 19-21 e talvez com 22,23 idade, foi necessário identificar uma única solução de ensaio que foi aceitável para todos os ratinhos, independentemente da estirpe e idade. Este resultado é essencial para permitir uma comparação directa da capacidade de deglutição / disfunção entre estirpes e idades, eliminando simultaneamente os resultados de confusão devida a diferenças na reologia (por exemplo, viscosidade, densidade, etc.) e as propriedades químicas das soluções de ensaio. Para este fim, foi desenvolvida uma abordagem simples palatabilidade rápida, de triagem para identificar o intensificador de sabor preferido para mascarar o gosto repugnante / odor de agentes de contraste oral durante VFSS murino. Os métodos foram modelado após o teste de exposição breve, o que exige uma lambidaometer (ie sensor, lambida) a registar taxas de lamber durante a primeira 2 min depois de um período de regulação de água (ou seja, a retenção de água durante a noite) para induzir sede 24,25. A lickometer não estava disponível para este estudo; portanto, a preferência foi avaliada por observações comportamentais, bem como métodos de gravação de vídeo padrão para taxa lambida que tenham sido previamente validado em nosso laboratório 13,14. Utilizando esta abordagem de rastreio palatabilidade, o chocolate foi identificado como o intensificador de sabor preferido por estirpes C57 e C57 / SJL. Especificamente, 100% dos ratinhos em cada gaiola prontamente bebeu soluções de chocolate com sabor dentro de 30 segundos de exposição, simultaneamente com vários ratinhos beber no bico. No entanto, a adição de bário resultou em apenas breves ataques bebendo pela maioria dos ratinhos, independentemente da concentração de bário ou de chocolate.
Uma alternativa é a de bário iohexol, um agente de contraste contendo iodo, que apenas recentemente foi reconhecida como um suitabela alternativa ao sulfato de bário para VFSS humano 10; assim, ainda não foi normalizado para esta finalidade. Várias concentrações diferentes de iohexol achocolatados foram oferecidos aos camundongos. Receitas contendo até uma solução a 50% do estoque iohexol (350 mg de iodo por ml) foram prontamente bebeu pela maioria dos camundongos após um período de regulação da água durante a noite. As concentrações mais elevadas resultaram em comportamentos de esquiva. Uma solução ioexol 50% (350 mg de iodo por ml) produzido radiodensity suficiente ao ser engolido por ratos, enquanto que concentrações mais baixas foram marcadamente menos visível e impediu quantificação da fisiologia andorinha. Portanto, a solução de ensaio óptima para VFSS com ratinhos foi identificado como uma solução 50% de iohexol com aroma de chocolate adicionado. Testes de palatabilidade Repita não resultou em comportamentos de fuga ou eventos adversos.
Um terceiro desafio a superar estava impedindo ratos de girar / inclinar sua cabeça enquanto beber, que obscurece a visualizaçãodo mecanismo de deglutição durante VFSS. Potável a partir de uma bacia de peg-posicionado logo acima do chão, numa extremidade da câmara resolvido este problema. Existem várias vantagens adicionais da utilização de uma cavilha de taça em vez de uma garrafa tubo Sipper. Por exemplo, um volume calibrado de líquido pode ser pipetado para a cavilha de taça através de um orifício de ventilação na tampa final do tubo de observação. Esta abordagem permite a quantificação do volume de solução de teste consumiu durante o breve período de teste VFSS minuto. Além disso, o aumento da área de superfície da solução teste na taça peg, em comparação com uma abertura de pequeno tubo sipper, pode proporcionar maior estímulo olfativo para motivar ainda mais beber. PEG-taças pode ser mais adequado para o estudo da estirpe de ratos jovens ou mais pequenas, como a altura do recipiente é uma distância estandardizada a partir do piso. Em contraste, comprimentos de tubo sipper deve ser ajustado para acomodar diferentes camundongos de tamanho, o que acrescenta uma outra variável potencialmente confundindo a considerar. Além disso, o modo de ratols de doenças neurológicas podem ter dificuldade em atingir uma garrafa tubo sipper devido ao comprometimento motor dos membros, enquanto que eles podem facilmente chegar a um bowl peg. Ratos com língua e / ou sintomas de disfunção pode ser incapaz de pressionar suficientemente a bola no bico para aceder ao líquido; usando peg-bacias pode eliminar essa confundem. Por estas razões, o uso de PEG-taças ao longo do tubo sipper garrafas é o método preferido de teste VFSS murino. No entanto, as câmaras de observação foram concebidos para acomodar bocal para beber, conforme necessário. Uma ressalva importante a considerar é que as taxas de lamber são conhecidos por diferem entre bico e bacia beber 13,26. Portanto, a escolha de bico ou peg-bacia para VFSS deve ser coerente dentro e entre experimentos.
Um quarto desafio foi identificar parâmetros andorinha quantificáveis para ratos que são comparáveis aos parâmetros VFSS comumente utilizados em pesquisas humanos e prática clínica. Nossos resultados preliminares mostraram atipo de sistema de fluoroscopia determina que engolir parâmetros podem ser investigados em ratinhos. A maioria dos centros de pesquisa e definições médicas têm alta energia (75-95 kV, 1-5 mA) fluoroscopia projetado para uso com pessoas e animais de maior porte, que resultam em excepcionalmente má qualidade de imagem ao testar os ratos e outros pequenos animais. Como exemplo, um estudo recente usando um fluoroscope alta energia com ratos foi capaz de identificar apenas 4 parâmetros quantificáveis andorinha 12, e fomos capazes de identificar apenas 7 parâmetros engolir para ratos no presente estudo. Para superar esta limitação importante, obtivemos recentemente um sistema de baixa fluoroscopia energia chamada The LabScope (Glenbrook Technologies). O sistema é um fluoroscópio miniatura, que gera um feixe contínuo de cone de raios X com energias de fotões entre 15 e 40 kV e um pico de corrente no tubo de 0,2 mA (8 W de potência máxima). Os níveis mais baixos de energia deste sistema são melhor atenuada pelo osso e tecido mole fina de ratinhos e, assim, proporcionar mais altos padrõesresolução de contraste r do que o convencional (ou seja, de alta energia) fluoroscopia. O feixe de raios-X de O LabScope é dirigida a um cinco centímetros de diâmetro intensificador de imagem, que é marcadamente menor do que a 15-57 cm de diâmetro intensificador de imagem de fluoroscopia convencionais. A distância mínima da fonte ao intensificador (SID) do LabScope é ~ 6 cm (em contraste com ~ 30 cm para fluoroscopia convencionais), o que proporciona uma maior capacidade de ampliação. Além disso, O LabScope usa tecnologia patenteada que amplia digitalmente a imagem em até 40 vezes, em tempo real, sem alterar o SID. O resultado é, em essência, um raio-X microscópio que pode zoom in e out em tempo real para visualizar pequenas regiões de interesse, como o mecanismo de deglutição de um mouse.
A grande vantagem deste sistema de fluoroscopia de baixa energia é melhorada segurança de radiação. Além dos animais que receberam doses mais baixas com o LabScope, os investigadores que utilizam o sistema são expostos a les significativamentes dispersão da radiação. A exposição à radiação diretamente na frente da unidade no painel de controle é de 10,3 mR / hr. A uma distância de 1 m na frente da unidade, a exposição cai para 580 mR / hr. A maioria dos outros locais da sala tem baixíssima exposição abaixo dos 10 mR / hr. Apesar desta melhoria, temos tomado medidas adicionais para melhorar a segurança de radiação. Por exemplo, proteção de acrílico com chumbo foi adicionado ao redor do LabScope bloquear fótons espalhados de raios-X, que permite aos pesquisadores para realizar testes VFSS murino sem usar proteção pessoal (por exemplo, aventais de chumbo, protetores de tireóide, e copos). Além disso, o acrílico claro permite a visualização do rato a partir de uma distância. Mais segurança de radiação é fornecida por uma mesa de tesoura elevador motorizado, que é controlada remotamente pelo investigador. A partir de uma distância de até 3 m do fluoroscope, os pesquisadores podem usar o dispositivo de controle remoto para ajustar a posição vertical e horizontal da câmara de observação dentro do bea de raios-Xm. Como resultado, as regiões anatómicas de interesse pode ser mantido dentro do campo de vista fluoroscopia enquanto o rato se move livremente dentro da câmara de observação. Embora o elevador de tesoura foi projetado para uso com o LabScope, também é compatível para uso com fluoroscopia convencionais para melhorar a segurança de radiação para os investigadores. Um passo final para melhorar a segurança da radiação durante murino VFSS implica a utilização de um sistema de entrega de seringa para líquidos. Este sistema inclui um pé de 3-4 (ou mais, se necessário) comprimento de tubagem de PE, o que permite a rápida e eficiente entrega de líquidos para dentro da bacia a partir de uma cavilha de distância. Este sistema de entrega de seringa para líquidos, em combinação com as câmaras de observação, também pode ser utilizado com fluoroscopia convencionais.
Trabalhos preliminares utilizando o LabScope, em combinação com o novo protocolo VFSS murino, demonstra uma importante vantagem em relação aos sistemas convencionais de: o número de parâmetros de andorinha que pode ser quantificada fiavelmente ié quase o dobro. No entanto, as estruturas dos tecidos moles do mecanismo de deglutição (por exemplo, língua, véu, parede posterior da faringe e epiglote) dos camundongos não são facilmente visíveis ao usar sistemas de fluoroscopia de energia baixas ou altas. Portanto, nós nos concentramos em quantificar as medidas de fluxo de bolus, em vez de a biomecânica da deglutição. Estávamos predominantemente interessado em parâmetros que podem ser quantificados com base em unidades de tempo, a área, distância, volume, etc., em vez de usar medidas de escala do tipo Likert. Numerosos parâmetros de fluxo de bolus cumprir estes requisitos foram descritos na literatura VFSS humana, tais como o tempo de trânsito oral, 27-29, 27-33 faríngea tempo de trânsito, e o tempo de trânsito esofágico 34-36, para citar apenas alguns. Transporte Bolus através da cavidade oral não era facilmente visível em ratos, provavelmente devido ao pequeno tamanho bolus durante beber espontânea. No entanto, fomos capazes de quantificar de forma fiável de faringe e esôfago trânsito vezes, bemcomo várias outras medidas relativas ao fluxo de bolus e desembaraço. Identificação de parâmetros de translação andorinha adicionais é esperada, já que otimizar as capacidades do LabScope.
Os resultados deste estudo mostraram que os ratos demorar alguns licks rítmicos por gole durante beber espontânea, com cada pequeno líquido bolus sequencialmente preenchendo o espaço vallecular antes de acionar a andorinha da faringe. Este comportamento, que é típico para os mamíferos que usam lambendo como o principal meio de ingestão de líquido 37-40, assemelha-se o padrão de chupar-andorinha rítmica da deglutição bebê humano e todos os mamíferos infantis em geral. Infant fisiologia engolir é caracterizada por vários rítmica suga seguido por uma andorinha faríngea reflexiva, comumente descrito como o ciclo de chupar-andorinha 37,41-43. Assim, os de língua e mandíbula movimentos rítmicos envolvidos nos comportamentos ingestivo de lambedura de ratos pode ser mais comparável ao ingestivo sugadores comportamentos de humum crianças, em vez de copo bebendo por crianças e adultos. Temos sido, portanto, quantificar a relação da taxa e lamber-andorinha lick de camundongos para futuras comparações com a relação de sugar e sugar taxa de-andorinha dos bebês humanos. Talvez a pesquisa VFSS murino irá fornecer insights sobre distúrbios da deglutição de desenvolvimento.
Como acontece com qualquer novo método de pesquisa, áreas de melhoria foram identificadas. Por exemplo, o protocolo VFSS murídeo foi desenvolvido utilizando estirpes C57 e C57 / ratinho SJL; que ainda não tenha sido testada em ratos. As câmaras de observação terá de ser aumentadas em tamanho (diâmetro e comprimento) para acomodar o maior tamanho corporal de ratos. Além disso, não se sabe se o iohexol com sabor a chocolate é adequado como uma solução de teste universal VFSS murino. Portanto, o teste maior escala com várias linhagens de camundongos e ratos é garantido para este fim. Além disso, o uso de bário como um agente de contraste para murino VFSS não deve ser excluída. Ratos preferido claramente o iohexol receitas mais de bário; tentativas porém mais rigorosos e sistemáticos, mascarando o aversivo gosto / odor de bário pode fornecer alternativas palatável para iohexol. Futuros estudos comparando os efeitos do sulfato de bário e iohexol (bem como outros potenciais agentes de contraste oral) sobre a preferência gosto e engolir fisiologia em camundongos e ratos, sem dúvida, fornecer informações importantes que é diretamente relevante e de translação para VFSS humano.
VFSS com os seres humanos inclui várias consistências de alimentos e líquidos, e disfagia é mais aparente ao engolir líquidos finos e secos, alimentos sólidos 44,45. O protocolo VFSS murino é, por conseguinte, a ser expandido para incluir consistências adicionais que podem facilitar a detecção e quantificação de disfagia em modelos de doenças. Também será necessário para conduzir o teste de viscosidade de líquidos para as receitas VFSS murino, a fim de ajustar as viscosidades para coincidir com os utilizados durante a VFSS humano. Enfrentar estes limiteções vai facilitar a identificação de biomarcadores VFSS translacionais de disfagia, que podem ser comparados directamente entre murganhos, ratos e seres humanos.
O utilitário de VFSS murino pode ser significativamente melhorada através da implantação de marcadores radiopacos em estruturas de tecidos moles do mecanismo de deglutição que de outra forma não são visíveis, permitindo, assim, investigações de biomecânica da deglutição. Esta abordagem tem sido usado com sucesso por muitos anos para estudar a biomecânica da deglutição em porcos infantis, usando uma variedade de clips e fios de metal 37,42. Esperamos que o uso de marcadores semelhantes, mas de menor dimensão, em ratinhos que permitem a quantificação de vários parâmetros adicionais andorinha para comparação com os grandes mamíferos, incluindo seres humanos. Estamos actualmente a desenvolver metodologia para implantação de marcadores radiopacos para a língua, palato mole, faringe, laringe e esôfago proximal de ratos para testar esta hipótese.
O recordin vídeog taxa de quadros do fluoroscopia LabScope e convencionais é limitado a 30 frames por segundo (fps). No entanto, os nossos resultados preliminares mostraram que toda a fase da faringe de engolir para ratinhos saudáveis ocorre em menos de 66 ms (ou seja, 2 frames), que é aproximadamente 10 vezes mais rápido do que os humanos. Assim, a fase faríngea da deglutição em ratos ocorre tão rapidamente que os detalhes não são sensíveis com uma câmera de 30 fps. A maior taxa de quadros (provável> 100 fps) será necessário suficientemente visualizar e quantificar os movimentos extremamente rápidos e complexos da fase faríngea da deglutição em camundongos e outros roedores. Em conjunto com uma maior taxa de quadros, incorporando tecnologia biplanar para geração de imagens 3D fluoroscopic certamente expandir o murino utilitário VFSS. Portanto, as considerações de design futuras deverão incluir uma câmera de alta taxa de quadros e recursos de imagem biplanares.
Por fim, a radiação de baixa dosagem foi mostrado para provocar esterilidade emC57 fêmeas, resultando em níveis alterados de hormônios ovarianos estimulada que podem confundir estudos tempo de vida 46. Os resultados relativos especificamente aos efeitos da exposição a radiação de baixa dose repetida associada ao teste VFSS ainda não foram investigados em ratos, outros animais ou seres humanos. No entanto, a disfunção do ovário (não relacionados com a exposição à radiação) em fêmeas humanas tem sido associada a perturbações da motilidade gastrointestinal, e, especificamente, a disfagia, em alguns casos, 47, que fornece ainda outra ressalva a considerar ao conceber estudos futuros VFSS que incluem fêmeas (animais e seres humanos ). Exclusão de fêmeas devem ser evitados, como diferenças significativas na capacidade de deglutição de gênero têm sido relatados por pessoas 48,49 e seria importante para detectar e caracterizar em modelos de doenças animais também. Por conseguinte, os resultados de estudos longitudinais VFSS em ratinhos e ratos de ambos os sexos têm um enorme potencial para os seres humanos de translação em relação ao dysphagia, bem como aos riscos de exposição a radiação de baixa dose associados com testes VFSS repetição.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nós graciosamente agradecer membros adicionais do Lab Lever que contribuíram para a coleta de dados (Andries Ferreira, Danarae Aleman, Alexis Mok, Kaitlin Flynn, Elizabeth Bearce e Matan Kadosh) e de revisão de artigos (Andries Ferreira, Rebecca Schneider, e Kate Robbins). Reconhecemos também Roderic Schlotzhauer e Edwin Honse do MU Física Oficina para a sua entrada projeto e fabricação dos tubos de observação de roedores utilizados neste estudo. Estamos especialmente agradecidos por (Departamento de Cirurgia da Universidade de Missouri Radiologia Supervisor na Medicina Veterinária e – Faculdade de Medicina Veterinária) Malea Jan Kunkel e Jan Ivey (Gerente da Cath Lab Pesquisa Animal da Universidade de Missouri – School of Medicine) para demonstrar paciência e motivação constante durante a operação os fluoroscopia de alta energia como foi desenvolvido o protocolo VFSS murino. Fontes de financiamento para este estudo incluiu NIH / NIDCD (TE Lever), NIH / NINDS (GK Pavlath), Otolaryngologia – Cirurgia de Cabeça e Pescoço fundos de arranque (TE Lever), do Fundo de MU PRIME (TE Lever), Mizzou Advantage (TE Lever), e do Centro de MU sobre Envelhecimento (TE Lever).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Polycarbonate tubing for observation chambers | McMaster-Carr | 3161T41 | Body of observation tubes, 2"X2" diameter, 0.080" thick wall |
| Polycarbonate sheet for observation chambers | McMaster-Carr | 9115K71 | End-caps for observation tubes, 2"x12"x3/4" |
| Polycarbonate sheet for observation chambers | McMaster-Carr | 8574K281 | Peg-bowls for observation tubes |
| Silicone O-rings for end-caps of observation chambers | McMaster-Carr | 9396K108 | S1138 AS568-029, pack of 25 http://www.mcmaster.com/#o-rings/=t0wt5r |
| Silicone stoppers for observation chambers | McMaster-Carr | 2903K22 | Package of 10 stoppers to plug the oval opening in the top of the observation chamber when using a peg-bowl http://www.mcmaster.com/#catalog/120/3803/=t0y5at |
| Centrifuge tubes for sipper tube bottles | Evergreen Scientific | 222-3530-G80 | 30 ml freestanding centrifuge tubes, with caps, sterile https://www.evergreensci.com/labware-catalog/tubes-and-vials/30-and-50-ml-centrifuge-tubes/ |
| Silcone stoppers for sipper tube bottles | Saint-Gobain Performance Plastics | DX263031-10 | Number 31D, size: 26 mm bottom, 32 mm top, 30 mm high; 10 pack; http://www.labpure.com/en/Products.asp?ID=179&PageBrand=STOPPERS |
| Stopper borers for sipper tube bottles | Thomas Scientific | 3276G40 | Cork Borer Set that ranges from 3/16-15/16 inch http://www.thomassci.com/Supplies/Corks/_/CORK-BORER-SET-316-1516-IN?q=Humboldt |
| Drinking tubes for sipper tube bottles | Ancare | TD-100 | 2 1/2” long drinking tubes with 5/16” opening, straight ball-spout http://www.ancare.com/products/watering-equipment/open-drinking-tubes/straight-tubes-ball-point |
| Iohexol for making oral contrast agent solution | GE Healthcare | 350 mg iodine per ml http://www3.gehealthcare.com/en/products/categories/contrast_media/omnipaque |
|
| Chocolate syrup for flavoring oral contrast agent | Herseys | ||
| 10 ml syringe for syringe delivery system | Becton, Dickinson and Company | 309604 | Luer lock tip syringe without needle, 100 per box http://www.bd.com/hypodermic/products/syringeswithoutneedles.asp |
| Catheter tubing for syringe delivery system | Becton, Dickinson and Company | 427451 | Polyethylene Tubing (Non-Sterile) (PE 240) 100' http://www.bd.com/ds/productCenter/427451.asp |
| Needle for syringe delivery system | Becton, Dickinson and Company | 427560 | 15-gauge needle, fits into PE 240 catheter tubing http://www.bd.com/ds/productCenter/427560.asp |
| Delrin acetal resin rod for syringe delivery system | McMaster-Carr | 8576K15 | 1/2 inch diameter, black http://www.mcmaster.com/#catalog/120/3609/=t0wvaf |
| Acrylic sheeting for scissor lift | Ponoko | Laser cut http://www.ponoko.com |
|
| 3D printed ABS frame | Engineering Rapid Prototyping Facility, University of Missouri | ||
| Brass rods for scissor lift | Amazon | TTRB-03-12-03 | made into axles http://www.amazon.com/Brass-Seamless-Round-Tubing-Length/dp/B000FN898M |
| Drawer slide for scissor lift | Richelieu | 10292G116 | Attaches to base of scissor lift http://www.lowes.com/pd_380986-93052-T35072G16_0__?productId=50041754 |
| 28BYJ-48 stepper motor for scissor lift | 2 each | ||
| ULN2003 Darlington transistor array for scissor lift | Toshiba | ULN2003APG | Used as stepper drivers (2 each) |
| ATTINY85 microcontroller for scissor lift | Atmel | ATTINY85-20PU | 2 each http://www.taydaelectronics.com/attiny85-attiny85-20pu-8-bit-20mhz-microcontroller-ic.html |
| Nylon spur gear | McMaster-Carr | 57655K34 | 2 each http://www.mcmaster.com/#57655k34/=t0yaqz |
| Nylon spur gear rack | McMaster-Carr | 57655K62 | 2 each http://www.mcmaster.com/#57655k62/=t0ybh9 |
| 4-40 nylon machine screws | McMaster-Carr | 95133A315 | Lift assembly http://www.mcmaster.com/#95133a315/=t0yd8q |
| 4-40 nylon hex nuts | McMaster-Carr | 94812A200 | Lift assembly http://www.mcmaster.com/#94812a200/=t0ye29 |
| Buna-N O-Ring AS568A Dash No. 104 | McMaster-Carr | 9452K318 | Lift assembly http://www.mcmaster.com/#9452k318/=t0yem7 |
Referencias
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