JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioingeniería

לדוגמא הכנת אסטרטגיות להדמית ספקטרומטריית המסה של מודלי תרבית תאי 3D

Published: December 05, 2014
doi:
10.3791/52313
, ,
1Department of Chemistry and Biochemistry,University of Notre Dame, 2Harper Cancer Research Institute,University of Notre Dame

Summary

ניתן לגדל שורות תאי סרטן הונצחו כתרביות תאי 3D, מודל רב-ערך למחקר ביולוגי. פרוטוקול זה מתאר הדמיה ספקטרומטר מסה של תרביות תאי 3D, כולל שיפורים בפלטפורמת הכנת מדגם. המטרה של פרוטוקול זה היא להנחות את המשתמשים כדי להכין תרביות תאי 3D לניתוח הדמיה ספקטרומטר מסה.

Abstract

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate de vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

Introduction

Mass spectrometry imaging (MSI) is a powerful technique to examine the distribution of molecular species across samples of interest. Researchers have imaged biological samples from whole animals down to single cells with this technique.1–4 Using MSI hundreds of analytes may be imaged at a single time, rather than single-substrate techniques requiring the development of additional fluorophores for traditional confocal microscopy, or staining for histology.5–7 Additionally, MSI can be used in either a targeted or a discovery-based fashion, making it an attractive approach to look at the overlap between the distribution of chemical species. Presented within are methods for the growth, preparation, and matrix assisted laser desorption ionization/desorption (MALDI) imaging of small samples (~1 mm in diameter) of three-dimensional multicellular cell cultures.8–11

3D cell cultures are of particular interest to the biological community as an intermediary between traditional monolayer culture and in vivo tumors. As the name implies, 3D cell cultures are heterogeneous cellular aggregates that contain many of the chemical gradients in the microenvironment observed in small avascular tumor nodules, making them a more realistic model system to the native tumor environment than monolayer culture.10 Many human cell lines can be grown as 3D cultures, including cell lines derived from colon, breast, ovary, prostate, kidney and lung tissues.10 There are inherent challenges in imaging three dimensional cell cultures as they are smaller than many samples commonly used for mass spectrometry imaging and therefore require careful sample preparation.7 However, the advantages of these tractable model systems include lower cost and faster growth and analysis time compared to animal models. As a result, studies involving three dimensional cell cultures can be higher throughput than traditional animal studies.12–14

All of these advantages have resulted in increasing popularity for three dimensional cell cultures in biological research; there is a corresponding need to develop new analytical strategies to explore both the composition and spatial distribution of molecules in these systems.12,15–21 The goal of this manuscript is to describe the adaptation of mass spectrometry imaging methods and sample preparation to three dimensional cell cultures.

Protocol

תרבות 1. 3D Cell והכנה להדמיה תרבות קו תא מתאים, כלומר, שורת תאי קרצינומה של מעי גס HCT116, בשתי ממדי תרבות, monolayer. לגדול HCT 116 תאים בבקבוק T-25 עם תקשורת 5A של מקוי 10% בסרום שור עוברי + ב5% CO 2 באינקובטור עד confluency 50-70%, אשר בדרך כלל לוקח כמה ימים. תאי שחרור עם 0.25% פתרון טריפסין-EDTA ולספור חלק מהתאים באמצעות hemocytometer וtrypan כתמי כחולים כדי לבדוק צפיפות תאים ואת כדאיות. לאחר ספירה, לדלל תאים עם מדיום מלא כדי להשיג צפיפות זריעה מתאימה של 6,000 תאים / טוב, או 30,000 תאים / מיליליטר. 2. כן מצופה Agarose 96 צלחות גם להוסיף 0.19 גרם של agarose 10 מיליליטר של תקשורת סטנדרטית בצינור חרוטי 50 מיליליטר (1.5% פתרון agarose בתקשורת) 10. להבטיח הכללה על ערבוב עדין. החיטוי agarose באמבט מיםבמשך 20 דקות. בעזרת פיפטה רבה, 50 לשאוב μl של תערובת agarose + מדיה לתוך 60 הבארות של צלחת תרבות צלחת שטוחה 96 תחתית באר מרכזיות. כמו שיש לי הבארות בקצוות היקפיים של צלחת שיעורי אידוי גבוהים מעט יותר, להוסיף מלח 200 פוספט μl 1x שנאגרו (PBS) במקום agarose לקצוות הללו. ברגע שהתערובת agarose נוסף לבארות הפנימיות, להגדיר את הצלחת בצד להתקרר ל~ 37 ° C לפני התוספת של התאים. 3. זרעים ונוטים תרבות תלת ממדית הערה: יותר או פחות תאי זרע ניתן בהתאם לדרישות של התרבות מעורבת, אבל זה כבר נקבע כי תנאים אלה לגרום למבני תרבית תאי 3D של כ 1 מ"מ בקוטר לאחר 10-14 ימים של התרבות (מידע לא מוצג) . הוסף 200 μl של פתרון התא המתאים (בדילול להכיל ~ 6000 תאים) לagarose מצופה96 צלחת גם. מכסה את הצלחת ולהגדיר בחממת humidified עם 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס לצמיחת תאים. שינוי בתקשורת סלולארי מינימאלי של כל שעה 48, או כאשר התקשורת נראית ששינוי צבע. שינוי בתקשורת על ידי aspirating בזהירות את המדיה הישנה מרחבי התרבות הקטנה תא 3D (הגלוי לעין בלתי מזוינת ביום 2) בחלק התחתון של agarose. הוסף 200 μl של תקשורת טרי בעדינות על תרבית תאי 3D. (שלב אופציונאלי) במהלך שינויי תקשורת אלה, להוסיף chemotherapeutics או תרופות אחרות לבדיקה. לדלל את תרופת בחירה לריכוז הסופי עם תקשורת מלאה ולהוסיף 200 μl הנדרש לכל אחד. צג צמיחת תרבית תאי 3D על ידי מיקרוסקופ אופטי, עד תרביות תאי 3D הם כ 1 מ"מ בקוטר. 4. קציר תא תרבויות 3D השתמש פיפטה סרולוגיות 2 מיליליטר כדי להסיר בעדינות את תרבית תאי 3D מהמיטה agarose. <li> לשטוף את תרביות תאי 3D עם PBS על ידי pipetting בעדינות אותם לכ 1 מיליליטר PBS בצלחת גם מחכה 24. העברה נקטפה בתרביות תאי 3D באמצעות pipet סרולוגיות לצינורות צנטריפוגה להפקת חלבון או המטבוליט, או להטביע אותם במדיום חיתוך לסייע בחיתוך ליישומי הדמיה. 5. שבץ תא תרבויות 3D בטין הכן פתרון של ~ 175 מ"ג / מיליליטר ג'לטין במים טוהר גבוהים (18 MΩ מועדף). 22,23 מערבבים את הג'לטין במרץ. שים לב לפתרון הופך צמיג וקשה לתמרן. מניחים את צינור חרוטי המכיל ג'לטין באמבט מים ב ~ 60 ° C וחמים עד הפתרון הופך ברור וקל ללשאוב. הערה: פתרון ג'לטין החם מתקשה במהירות כפי שהוא מתקרר, כך לבצע את כל השלבים הבאים במהירות לפני ההקפאה. אחרי זה הוא מחומם, לקחת את הג'לטין באופן מיידי למכסה מנוע תרבית תאים. שמור את הצינור עם ג'לטין בביהker עם מים שחומם מראש בכ -60 ° C כדי למנוע התקשות של פתרון ג'לטין. בעזרת פיפטה סרולוגיות 2 מיליליטר, להפקיד 0.6 מיליליטר של פתרון ג'לטין החם לתוך הבאר של צלחת שטוחה קרקעי 24. נפח זה מספיק כדי לכסות את התחתית בשכבה דקה. בעדינות להפקיד תרביות תאי 3D מייד על גבי שכבת ג'לטין בעזרת פיפטה 2 מיליליטר שונה, כדי למנוע פקיעת מבנה 3D. הערה: יש להקפיד בשלב זה לא למקום PBS לג'לטין. אם זה יקרה, עם זאת, להסיר את PBS מהחלק העליון של ג'לטין בעזרת פיפטה 200 μl. לאחר תרביות תאי 3D ממוקמות על פני השטח של שכבת ג'לטין, פיפטה בזהירות 0.6 מיליליטר נוסף של תערובת הג'לטין החמה על תרביות תאי 3D, כדי לא להפריע את המיקום של התרבויות. לאחר השכבה השנייה ממוקמת, להקפיא את תרביות תאים-משובץ ג'לטין 3D ב -80 ° C. ה 6. פורסים והפשירו הרדואר לטין-משובץ תא תרבויות 3D להדמיה ההמוני spectrometric הסר את הצלחת גם 24 המכילה תרביות תאי 3D מהמקפיא. לחמם את תחתית הצלחת עם החום מהיד שלך עד פינצטה או אזמל תהיה להחליק בעדינות את הצד של הבאר. בצורה חלקה להחליק פינצטה או אזמל, לשחרר את הג'לטין ללא הפשרת המרכז. קח טיפת מים לתמיכת cryostat ולהשתמש בזה כדי לדבוק דיסק ג'לטין לתמיכה. תרביות תאי 3D המשובצים בג'לטין הן נוחות ביותר לחיתוך ב-30 מעלות צלזיוס. נקה את להב cryostat וזכוכית עם אתנול 70% לפני השימוש. השתמש בחלק אחר של הלהב או להב חדש לכל דיסק תא 3D התרבות-ג'לטין כדי למנוע טמטום של הלהב. שימוש cryostat בעדינות, פן ג'לטין העודף עד תרביות תאי 3D להיות גלויות. בשלב זה לחתוך לאט תרביות תאי 3D עם תנועה חלקה ב12-16 מיקרומטר סעיפים. הערה: גורמים קריטיים לחיתוך כוללים מרחק של הזכוכית ללהב, זווית הלהב, הטמפרטורה של cryostat, ואת הזווית של הדיסק על התמיכה, ולכן כל אלה חייבים להיבדק כדי להבטיח תוצאות עקביות. להפשיר בזהירות את הפרוסות ולעגן אותן בשקופיות אינדיום תחמוצת טיטניום (איטו) -coated זכוכית שכותרתו כראוי ולאחסן אותו בייבוש. השתמש בפרוסות מהר ככל האפשר לאיכות מקסימלית. יישום 7. מטריקס והכנת דוגמאות לMALDI הדמיה לפני ההדמיה MALDI, להכין פרוסות עם המטריצה ​​המתאימה. לניתוח מולקולה קטן, אין שלבי כביסה נדרשים בדרך כלל. לגילוי חלבון שלם, לשטוף את הפרוסות באצטון 100% קרים, הנוזל של Carnoy, או 70% isopropanol / 95% כדי להסיר מולקולות קטנות כגון שומנים שיכולים להסוות את האות 24 -. 26 לשטוף בעדינות לא יותר מ -30 שניות בכל פעם. לאלהפריע כל פרוסות. הכן מטריצה ​​בפתרון של ממס אורגני ומים, עם 0.1% TFA. למולקולה קטנה כגון α-Cyano-4-hydroxycinnamic חומצה (CHCA), להשתמש ACN 60%: 40% H 2 O: 0.1% TFA (10 מ"ג / מיליליטר). לגילוי חלבון כגון חומצת sinapic (30 מ"ג / מיליליטר), להשתמש באותו פתרון הממס. למסיסות אופטימלית של חומצת sinapic, לפזר ראשון באצטוניטריל לפני תוספת של TFA: H 2 O פתרון. מטריצות אחרות עשויות לשמש כמתאימות. הערה: מטריקס יכול להיות מיושם במספר שיטות שונות, אך יש לציין כמה מטריצות נמצאו לשתף להתגבש עם ג'לטין, כגון חומצת ferulic, עיבוד המדגם לא שמיש. גבישים קטנים יותר לייצר ספקטרום מסה עקבי יותר, מה שמאפשר ליותר מינים מולקולריים כדי להתגלות ומיוחס להבדלים ביולוגיים ולא אפקטי מטריצה. החל מטריצה ​​על ידי handspotting שיטה. השתמש במזרק דק שקצהו ליישם 0.5 μl של matrפתרון ix על פרוסת תרבית תאי 3D ולאפשר המטריצה ​​להתגבש. לחלופין, השתמש בשיטת airbrush. מלא airbrush כיתה מסחרי עם פתרון המטריצה. החזק את המרסס 8-12 סנטימטרים מהשקופיות, מטרת תרסיס עדין בפרוסה. בין מעברים, לאפשר המטריצה ​​להתייבש במשך 1 דקות, כדי לאפשר היווצרות הגבישים הטובה ביותר. עד 10-20 עובר של airbrush נדרש כדי לייצר שכבה אופטימלית של מטריקס 22. לחלופין, השתמש בשיטת סובלימציה מפורטת במקום אחר. 25,27 מגלשות יבשים בייבוש לפחות 30 דקות לפני MALDI-MSI, ללא קשר לשיטת יישום מטריצה. 25 8. MALDI-MSI ניתוח שימוש במערכת MALDI-TOF (כלומר, AutoFlex III) הערה: סעיף זה מכיל הוראות ועצות להגדרת פרמטרים לניסוי הדמיה MALDI-TOF. בהתאם לתוספותיצרן ותוכנה המשמשת trument, התהליך עשוי להשתנות. להתאים את השקופיות במתאם עשוי להחזיק שקופיות x 25 מ"מ 75 מ"מ בצורה מאובטחת לתמונת פרוסות תרבית תאי 3D המצורפת לשקופיות איטו מצופים. טען את מתאם השקופיות לתוך המכשיר. הכן את המכשיר לMALDI-MSI על ידי בחירה סטנדרטי כיול מתאים למגוון ההמוני בשאלה. לחקירה של מולקולות קטנות, האותות זיהו כי מתאים למטריצה ​​משמשת, α-CHCA, הם קבוצה אחת משותפת של calibrants. לניתוח של חלבונים, סטנדרטים חלבון ידוע (כלומר, יוביקוויטין, trypsinogen) בטווח המסה של עניין נבחרים והבחינו בסמוך לתרביות תאי 3D כcalibrants. לכייל את המכשיר לפני שתמשיך עם פיתוח שיטה. לפני ההדמיה, לפתח שיטות איסוף נתונים לטווח ההמוני של בחירה באמצעות התוכנה המסופקת על ידי יצרן המכשיר. דמויות ראו 1 ו -2 למולקולה קטנה והדמיה חלבון. עבור הדמיה מולקולה קטנה, להשתמש reflectron מצב לרזולוציה הגבוהה ביותר ההמונית. התאם את טווח המסה לרכישת נתונים מולקולה קטנה בין 100-1,000 מ '/ z וחלבונים בין 25,000 8,000- מ' / z. התאם את טווח המסה להקיף את אזור בחירה, תוך מתן החלטת המסה הגבוהה ביותר האפשרית עם המכשיר. התאם כוח לייזר, תדירות, מספר יריות לייזר וגודל נקודה באמצעות פתרון הכיול ופרוסת סמוכה 'הקרבת' תרבית תאי 3D. שים לב הגדרות אלה בתוכנת שליטת הכלי העיקרית. השתמש בהגדרות הבאות כנקודת התחלה מומלצת: כוח 60%, 400 יריות לייזר, גודל נקודה קטן במיוחד. הגדרות אלה ישתנו פני מכשירים ושיטות, כך לייעל את הפרמטרים מכשיר לתת את הספקטרום באיכות הגבוהה ביותר עבור כל מכשיר ספציפי. פרמטרים נוספים שיכול להיות מותאם כוללים את רווח הגלאי, קצב דגימה, ורווח אלקטרוני. Sתשתה בשיטה זו לשימוש בתוכנת ההדמיה (כלומר., AutoExecute השיטה שFlexImaging תהיה לשאוב). הערה: יוני Suppress מתחת לטווח ההמוני של עניין (נמצאו שוב בשליטת המכשיר) כדי לא להפריע לזיהוי. לפתח שיטות איסוף נתוני חלבון לטווח ההמוני של בחירה. בצע את אותו שתואר לעיל צעדים, אבל לטווחים המוניים אמצע-גבוה, מעל kDa על 3, להשתמש במצב לינארי. הערה: הגדרות יהיו שונות מאלה ששימשו לשיטות מולקולה קטנות. פרמטרים הגדרה ספציפיים MS מכשיר באמצעות תוכנת ההדמיה מסופקת על ידי יצרן המכשיר, כגון FlexImaging למערכות הברוקר MALDI-TOF. צור קובץ הדמיה חדש ותיקייה, על פי השיטה קודמת והציל. בחר את הפרמטרים המכשיר כגון גודל נקודת סריקה (שינוי מברירת המחדל על 200 מיקרומטר עד 50 מיקרומטר), להגדיר את שיטת שליטת מכשיר (התקנה בשלב 8.3.2 או 8.3.3), וPOSItion בי לסריקה בתרבית תאי 3D. בחר שלוש נקודות ללמד מתאימות במדגם, נע לייזר לכל אחד בתורו. השג את התמונה האופטית מהתוכנה שליטת לייזר MALDI-TOF באמצעות 'מסך הדפסה'. הערה: תוכנת הדמיה תוכניות רבות דורשות תמונה אופטית של המדגם ל"ללמד" התוכנה שבו הלייזר ממוקם, אשר ניתן להשיג עם סורק או לעתים קרובות המצלמה המכשיר. ואז להתחיל את תהליך ההדמיה מהתוכנה ההדמיה (לא שליטת המכשיר) ולרכוש ספקטרום המוני מכל פרוסה. שים לב שרוב ההמונים ברחבי תרבית תאי 3D ואחרים המקומיים לאזורים מסוימים. 9. שיטות ניתוח נתונים אופציונליות לניתוח ממוקד, לבצע ניתוח ידני של הספקטרום על ידי לחיצה המונית בספקטרום הממוצע, או לאפשר לתוכנת ההדמיה כדי לאסוף באופן אוטומטי המונים מעל סף מסוים (למשל., פסגות abאובת סף 20% העליונים). לבקרת איכות, ניתוח ההתפלגות של פסגות מטריצה ​​או ספקטרום הממוצע. לבצע ניתוחים סטטיסטיים עם מערכי נתונים שחולצו בתוכנה מתמטית כגון R או Matlab. ספקטרום יחיד יצוא בפורמט ASCII, קובץ טקסט קריא, לטעינה לתוך התוכנה של בחירה. להמיר את ספקטרום הפרט לASCII, mzXML, של פורמט mzML לקריאה על ידי כמה תוכנות שונות, 28 -. 31 או לייצא את הנתונים כקובץ בפורמט לנתח (.img), פורמט נפוץ המשמש ליישומי הדמיה אחרים כגון MRI 32 שתי אפשרויות קוד פתוח לניתוח הן MSiReader וBioMap 32,33. ברגע שהקבצים מיוצאים לפורמט קריא על ידי התוכנה, לטעון את בסיס הנתונים באמצעות ההוראות בתוכנה המתאימה. לאחר טעינה, לבצע עיבוד שלאחר הרכישה, כגון הסרת תחילת המחקר ונורמליזציה. עם מערך זה, לבצע statiטיפולי stical כגון ניתוח מרכיבים עיקרי של קיבוץ היררכי או באמצעות סקריפטים מותאמים אישית או בנויים באלגוריתמים בתוכנה כגון Matlab 18.

Representative Results

יש הדמיה MSI הפוטנציאל לחשוף הפצה מולקולרית רבות ושונה בתרביות תאי 3D. תוך שימוש בשיטה שתוארה לעיל, מינים ממולקולות קטנות (איור 1) לחלבונים גדולים (איור 2) עשויים להיות במעקב על פני התרבות. תוצאות אלו מראות הדמיה של יון יחיד עם כלי חינם MSiReader. 32 תוצאות עשויות להיות מנותחות ליונים בודדים של עניין על פני תרבית תאי 3D עם תוכנת הדמיה או באזור של עניין או האזור שנסרק כולו. בנוסף רוב התוכנות באופן אוטומטי לדמיין יונים מעל לסף מסוים שנקבע על ידי המשתמש, אשר עשוי לסייע במאמצי גילוי. ברגע שמפות יון בודדים מתקבלות, רוב התוכנות כוללות יכולת כיסוי התמונות לצפייה בcolocalization של יונים. כך או בגישות גילוי מבוסס או באופן ממוקד, ההדמיה ספקטרומטריית מסה היא כלי רב עוצמה כדי לנתח תרביות תאי 3D. <p class="jove_content" fo:keep-together.בתוך-page = "תמיד"> איור 1. תוצאות נציג של צמיחת תרבית תאי 3D וחתך. תמונה אופטית של מבנה מעי גס שלם HCT-116 3D תרבית תאים כפי שנצפו ביום 14 לפני קציר שמאל). מימין) תמונה אופטית של הפרוסה כ משווני של הפשרה תרבית תאי 3D מעי גס רכובה על גבי שקופית מצופה איטו להדמיה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 2. תוצאות נציג של מולקולה הקטנה MALDI-MSI של סעיף קו המשווה של תרבית תאי 3D. ספקטרה ההמונית הממוצעת שהושגה עם α-CHCA בטווח מסה נמוכה (מולקולה קטנה) למעלה). ) נציג תמונות תחתיתמסה אחת: 327.8 מ '/ z מקומי בעיקר הפנים של תרבית תאי 3D ו429.7 מ' / z מקומי בעיקר לקצה של תרבות תא 3D. קו מקווקו מציין את הקצה המשוער של אליפטית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 3. נציגי תוצאות של הדמיה חלבון על ידי MALDI-MSI של סעיף קו המשווה של תרבית תאי 3D. למעלה) ספקטרה ההמונית הממוצעת שהושגה עם חומצת sinapic בטווח מסת חלבון) (גבוה יותר. תחתון) נציג תמונות של מסה אחת: 10871 מ '/ z מקומי בעיקר לקצה אליפטית, ו12,184 מ' / z מקומי יותר לכיוון הפנים של אליפטית. קו מקווקו מציין את הקצה המשוער של אליפטית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

שימוש בשיטות שתוארו לעיל, תרביות תאי 3D עשויות להיות מבוגרות וניתחו עם MALDI-MSI. שורות תאים הנציחו רבים יהוו מבני 3D כאשר בתרבית כראוי. יש להקפיד 9,10 לטפח תאים שלא עברו יותר מדי פעמים, כלומר, יש לי מספרי מעבר נמוכים. באופן כללי, תאים עם מספרי חלוף עשר ותחתונים הם אופטימליים לגידול תרביות תאי 3D. גידול תרביות תאי 3D בתמיכת agarose מסורתית מספק דרך חסכונית לקבוצות מחקר המתעניייינות בתרבית תאי 3D לנסות מערכת זו. בשיטה זו משתמשת כמה רכיבים לא כבר ברוב מעבדות תרבית תאי יונקים. תשומת לב קפדנית צריכה להיות משולם להכנת צלחות agarose לצמיחה, כך שתרביות תאי 3D עולות בקנה אחד בגודל ובצורה; כמה היבטים שדורשים תשומת לב קפדנית כוללים בדיקה שאין בועות אוויר וממולכד לתערובת וכי המניסקוס נכון נוצר בתחתית כל well. אם המניסקוס לא יתבצע כראוי, התאים עשויים לגדול בצורות שאינן אליפטית או בגושים קטנים. כמו כן, יש לקחת לא למקום PBS לתוך הג'לטין עם spheroids טיפול. אם זה יקרה, להסיר את PBS מהחלק העליון של ג'לטין בעזרת פיפטה 200 μl. אם העלות היא לא גורם, צלחות תחתונה נמוכות במיוחד מחייבות עגולות הם זמינות מסחריות ומציעות פישוט הפעולות הבאות. בעוד שיטות הטבעת רקמות אחרות יכולות להיות גם ספקטרומטריית יקרה ולא המונית תואמות, ג'לטין-הטבעה הוכח להיות גם זול ורבים-תכליתי. אסטרטגיות הכנה שתוארו לעיל כבר מותאמות לתרביות תאי 3D להשיג נתונים באיכות הגבוהות ביותר. בעוד ג'לטין-הטבעה הוכח להיות תואם לניתוח ספקטרומטריה, תהליך זה אמנם מצמצם מטריצות הזמינות בשל שיתוף התגבשות. ברגע קפוא, תרביות תאי 3D יציבות במשך חודשים, כל עוד הם לא בהקפאה מופשרות. ג'לטין הופך אטום כאשר קפוא, ותא 3Dתרבויות הן בצבע דומה, ולכן רצוי לפני ההקפאה לתעד את מיקום תרבית תאי 3D כדי לסייע בחיתוך.

בעת הכנת שקופיות, מטריצה ​​יכולה להיות מיושמת במספר שיטות שונות, אך יש לציין כי חלק מהמטריצות נמצאו לשתף להתגבש עם ג'לטין, כגון חומצת ferulic, עיבוד המדגם לא שמיש. גבישי מטריצה ​​קטנים יותר לייצר ספקטרום מסה עקבי יותר. בעוד handspotting היא השיטה הפשוטה של ​​יישום מטריצה, נפח הממס הגדול יותר יכול לגרום לגדלי גביש גדולים יותר והגירה אנליטי משמעותית.

בספקטרומטר המסה, התקדמות בטכנולוגיות MALDI-MSI צמצם את המומחיות הנדרשת לתחילת ניתוח. רכישת נתונים וניתוח הוא פשוט ברוב המערכות, המאפשרות אפילו טירון כדי להשיג מידע באיכות גבוהה משקופיות מצופות איטו. בחירה זהירה של הפרמטרים המכשיר, מותאמת בcultur תא הסמוך שאינה תמונה 3D הראויes, הוא קריטי לקבלת נתונים באיכות גבוהה. לדוגמא, הגדלת כוח הלייזר עלולה להגביר עוצמת שיא אבל ירידת כוח הלייזר עשויה לשפר את הרזולוציה ולתת צורות שיא סימטריות יותר. יש להשתמש בתרביות תאי 3D במהירות לאחר חיתוך על מנת להבטיח איכות מדגם אופטימלית. השפלה של אות חלבון ניתן לראות בפחות משבוע ללא אחסון נאות (dessicator / -80 ° C במקפיא), בעיקר באזור המסה הגבוה (מעל 20 KDA). בשל ביקוש ההולך וגדל, תוכנת הדמיה תוכניות רבות ושונות פותחו וחופשיים לציבור המחקר. רוב ספקטרומטרים מסת ההדמיה התקינו את התוכנה דרושה כדי לחזות המונים יחידים עם הפורמטים קנייניים בשימוש בכל מכשיר. תוכנות אלו עשויות לשמש כדי להשיג תמונות חדה-מסה ולייצא את הנתונים. רוב התוכנות תאפשר גם את השכבה של שניים או יותר המונים של עניין. בנוסף, צופים רבים ושונים לנתונים MSI הם להורדה בחינם, כגון MSiReaderד BioMap. 32,33 נתונים ספקטרומטר המסה שהושגו עשוי גם להיות מעובד לאחר רכישה בקלות, הבאת מידע שימושי יותר לחזית.

מתרופות לשומנים לחלבונים, המערכת שתוארה לעיל מאפשרת רכישה מהירה של נתונים על מנת להעריך את ההפצה של מולקולות של עניין על פני מבנה תרבית תאי 3D. ניתן לקחת קטעי סדרתי לתמונת מבנה 3D כולו על ידי בנייה מכל תמונת 2D של פרוסת תרבית תאי 3D. הטכניקות והערות בפרוטוקול יהיו שימוש לחוקרים המעוניינים להתחיל תרבית תאים תלת ממדי כגשר בין תרבות monolayer ומודלים של בעלי חיים. ברגע שמשתלט עליו, יכולות להיות מיושמות בטכניקות אלה לסוגים שונים של תרבויות 3D תא, רקמות, ותרביות תאים, המאפשרות לחוקרים תמונה לפי דוגמאות שהם בוחרים.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Walther Cancer Foundation under the Advancing Basic Cancer Research program to the Harper Cancer Research Institute of the University of Notre Dame (DARW) and the 2011 Starter Grant from the Society for Analytical Chemists of Pittsburgh (ABH). Thanks also to the staff of the Mass Spectrometry and Proteomics Facility for useful discussions.

Materials

Name of Material/Equipment Company Catalog Number Comments
HCT116 Cell line ATCC ATCC CCL-247 Potential hazard, handle with care
McCoy's 5A media Gibco 16600-108
Fetal Bovine serum HyClone SH30071.03
0.25% Trypsin-EDTA solution Gibco 25200-056
Agarose Sigma-Aldrich A9539
Phosphate Buffered Saline Gibco 10010049
Gelatin, unflavored Knox — Available at most grocery stores in single-packets
ITO-coated glass slides Delta Technologies, Limited CG-90IN-S115
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)  Sigma-Aldrich C8982
Sinapic Acid Sigma-Aldrich 85429
0.3mm Gravity Feed Dual-Action Airbrush Paint Spray Gun Kit Set RoyalMax Airbrush — Many options available on sites such as Amazon.com
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Schober, Y., Guenther, S., Spengler, B., Römpp, A. Single cell matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging. Anal Chem. 84 (15), 6293-6297 (2012).
  2. Cornett, D., Frappier, S., Caprioli, R. MALDI-FTICR imaging mass spectrometry of drugs and metabolites in tissue. Anal Chem. 80 (14), 5648-5653 (2008).
  3. Reyzer, M. L., Hsieh, Y., Ng, K., Korfmacher, W. a., Caprioli, R. M. Direct analysis of drug candidates in tissue by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. J Mass Spectrom. 38 (10), 1081-1092 (2003).
  4. Reyzer, M. L., Chaurand, P., Angel, P. M., Caprioli, R. M. Direct molecular analysis of whole-body animal tissue sections by MALDI imaging mass spectrometry. Methods Mol Biol. 656 (18), 285-301 (2010).
  5. Cornett, D., Reyzer, M., Chaurand, P., Caprioli, R. MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems. Nat Methods. 4 (10), 828-833 (2007).
  6. Guenther, S., et al. Histology by mass spectrometry: label-free tissue characterization obtained from high-accuracy bioanalytical imaging. Angew Chem Int Ed Engl. 49 (22), 3834-3838 (2010).
  7. Schwamborn, K., Caprioli, R. M. Molecular imaging by mass spectrometry–looking beyond classical histology. Nat Rev Cancer. 10 (9), 639-646 (2010).
  8. Kunz-Schughart, L. a., Kreutz, M., Knuechel, R. Multicellular spheroids: a three-dimensional in vitro culture system to study tumour biology. Int J Exp Pathol. 79 (1), 1-23 (1998).
  9. Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. a. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. J Biotechnol. 148 (1), 3-15 (2010).
  10. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nat Protoc. 4 (3), 309-324 (2009).
  11. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
  12. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
  13. Fernandes, T. G., Kwon, S. -. J., et al. Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate. Biotechnol Bioeng. 106 (1), 106-118 (2010).
  14. Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. Influence of a three-dimensional, microarray environment on human cell culture in drug screening systems. Biomaterials. 33 (35), 9087-9096 (2012).
  15. Weaver, E. M., Hummon, A. B. Imaging mass spectrometry: From tissue sections to cell cultures. Adv Drug Deliv Rev. 65 (8), 1039-1055 (2013).
  16. Li, H., Hummon, A. B. Imaging mass spectrometry of three-dimensional cell culture systems. Anal Chem. 83 (22), 8794-8801 (2011).
  17. Liu, X., Weaver, E. M., Hummon, A. B. Evaluation of Therapeutics in Three-Dimensional Cell Culture Systems by MALDI Imaging Mass Spectrometry. Anal Chem. 85 (13), 6295-6302 (2013).
  18. Ahlf, D. R., Masyuko, R. N., Hummon, A. B., Bohn, P. Correlated Mass Spectrometry Imaging and Confocal Raman Microscopy for Studies of Three-Dimensional Cell Culture Sections. Analyst. 139 (18), 4578-4585 (2014).
  19. Derda, R., Tang, S. K. Y., et al. Multizone paper platform for 3D cell cultures. PloS one. 6 (5), 18940 (2011).
  20. Imbeault, S., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. a. L. Localizing protein in 3D neural stem cell culture: a hybrid visualization methodology. J Vis Exp. 2 (46), 2-7 (2010).
  21. He, W., Kuang, Y., et al. Proteomic Comparison of 3D and 2D Glioma Models Reveals Increased HLA-E Expression in 3D Models is Associated with Resistance to NK Cell-Mediated Cytotoxicity. J Proteome Res. 13 (5), 2272-2281 (2014).
  22. Chen, R., Cape, S. S., Sturm, R. M., Li, L. Mass Spectrometric Imaging of Neuropeptides in Decapod Crustacean Neuronal Tissues. Methods Mol Biol. 656, 451-463 (2010).
  23. DeKeyser, S. S., Kutz-Naber, K. K., Schmidt, J. J., Barrett-Wilt, G. A., Li, L. Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Decapod Crustacean Neuronal Tissues. J Proteome Res. 6 (5), 1782-1791 (2007).
  24. Van Hove, E. R. A., Smith, D. F., Fornai, L., Glunde, K., Heeren, R. M. An alternative paper based tissue washing method for mass spectrometry imaging: localized washing and fragile tissue analysis. J Am Soc Mass Spectrom. 22 (10), 1885-1890 (2011).
  25. Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix Sublimation/Recrystalization for Imaging Proteins by Mass Spectrometry at High Spatial Resolution. Anal Chem. 83 (14), 5728-5734 (2012).
  26. Seeley, E. H., Oppenheimer, S. R., Mi, D., Chaurand, P., Caprioli, R. M. Enhancement of protein sensitivity for MALDI imaging mass spectrometry after chemical treatment of tissue sections. J Am Soc Mass Spectrom. 19 (8), 1069-1077 (2008).
  27. Gemperline, E., Li, L. MALDI-mass spectrometric imaging for the investigation of metabolites in Medicago truncatula root nodules. J Vis Exp. 1 (85), 1-11 (2014).
  28. Deutsch, E. mzML: a single, unifying data format for mass spectrometer output). Proteomics. 8 (14), 2776-2777 (2008).
  29. Pedrioli, P. G. a., Eng, J. K., et al. A common open representation of mass spectrometry data and its application to proteomics research. Nat Biotechnol. 22 (11), 1459-1466 (2004).
  30. Lin, S., Zhu, L., Winter, A., Sasinowski, M., Kibbe, W. What is mzXML good for. Expert Rev Proteomics. 2 (6), 839-845 (2005).
  31. Orchard, S., Hoogland, C., Bairoch, A., Eisenacher, M., Kraus, H. -. J., Binz, P. -. A. Managing the data explosion. A report on the HUPO-PSI Workshop. August 2008, Amsterdam, The Netherlands. Proteomics. 9 (3), 499-501 (2009).
  32. Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. a., Muddiman, D. C. MSiReader: an open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform. J Am Soc Mass Spectrom. 24 (5), 718-721 (2013).
  33. Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. Imaging mass spectrometry of proteins and peptides 3D volume reconstruction. Nat Methods. 5 (1), 101-108 (2008).

Tags

3D Cell CultureMass Spectrometry ImagingMALDI-MSISample PreparationColon CancerSpheroidsTumor NodulesSpatial AnalysisMolecular Distribution

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Ahlf Wheatcraft, D. R., Liu, X., Hummon, A. B. Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models. J. Vis. Exp. (94), e52313, doi:10.3791/52313 (2014).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image