Ganze Berge Kennzeichnung von Cilia im Hauptriechsystem der Mäuse

Die Maus Riechepithel in der Nasenhöhle umfasst 6-10.000.000 bipolaren Riechzellen ^1. Jedes olfaktorischen Neuronen wählt eine der 1200 Geruchsrezeptorgene zum Ausdruck. Der Nachweis von Geruchsstoffen beginnt mit der Geruchsstoff Bindung an einen Geruchsrezeptor ^2, die dann aktiviert Adenylylcyclase Typ-III (ACIII) ³ über den Riech spezifischen G-Protein G & agr _olf ^4. Der resultierende Anstieg des zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP) geöffnet ein zyklisches-Nukleotid-gesteuerten (CNG), nicht selektiven Kationenkanal nach Einströmen von Ca ²⁺ und Na ^+, und anschließend Ca ^{2+ -Einstrom} führenden führt zum Öffnen eines Ca ²⁺ aktivierten Cl ^– Kanal ^5,6. Die resultierende äußere Cl ^– Fluß wird durch eine hohe intrazelluläre Cl erleichtert ^– Aufnahme, wahrscheinlich über die Na ⁺ / K ⁺ / Cl ^{– –} ​​Cotransporter NKCC1, die Konzentration von stationären Cl beibehaltenCl ^– / HCO 3 ^– Tauscher SLC4A1, und vielleicht weitere noch zu identifizierenden Transporter ^6-8.

Bipolare olfaktorischen Neuronen einzigen, unverzweigte Axone, die direkt an den Riechkolben ragen und Dendriten, die an die Oberfläche des Epithels erstreckt und endet als spezialisierten Kompartiment, dendritischen Knopf. Von diesem Knopf, 10-30 Zilien, die eine Länge von bis zu 50 bis 60 & mgr; m erreichen kann, ausgehen in den Schleim für den epithelialen Oberfläche ^9. Proteine ​​der kanonischen Signaltransduktionskaskade werden hauptsächlich in der Membran dieser Zilien lokalisiert. Die erhöhte sensorische Oberfläche des Epithels verstärkt die Fähigkeit, Geruchsstoffe. Aufgrund der Dichte der sensorischen Neuronen, die sich von Zilien benachbarten dendritischen Noppen vermischen. Diese Vermischung führt zu einer zufälligen Mischung von Härchen verschiedener Neuronen exprimieren verschiedene Geruchsrezeptoren, die auf der Oberfläche des Epithels. Der Nachweis und die Zelledere Zuteilung Zilienproteine ​​die nur in einer Teilmenge von sensorischen Neuronen vorhanden sind, ist daher schwierig in Kryoschnitten. Darüber hinaus ist die genaue Lokalisierung solcher Proteine ​​entlang der Zilien kaum möglich, da Kryoschnitte sind typischerweise dünner als die durchschnittliche Länge der Wimpern.

Zur Untersuchung der ciliary Lokalisierung von bisher nicht charakterisierte Membranproteine ​​in Riechzellen aktivieren optimierten wir ein eigenes Gesicht Präparationstechnik, die die detaillierte Analyse der Proteinlokalisierung in Zilien ermöglicht. Kurz gesagt wird die Maus getötet und der Kopf aufgeteilt in der Nähe der Mittellinie. Nasenmuscheln, nasal, und frontalen Knochen entfernt werden, um das Septum freizulegen. Das Septum der olfaktorischen Teil des Epithel wird durch Schneiden alle Verbindungen in der Nasenhöhle gelöst. Nachdem an der Scheidewand in eine Petrischale mit Ringerlösung gefüllt ist, wird das Epithel ab und auf eine beschichtete Glasobjektträger übertragen geschält. Nach einer kurzen FIXATIonenschritt kann Immunofärbung Verfahren durchgeführt werden, wenn die Behandlung ist so schonend wie möglich, um eine Beschädigung der zerbrechlichen Gewebe zu vermeiden. Wir zeigen die erzielbare Auflösung durch den Vergleich der Färbung von zwei verschiedenen Membranproteinen in olfaktorischen Zilien in der klassischen Gefrierschnitten und in der beschriebenen en face Vorbereitung.