מדידת יציבות חלבון בחיים עוברי דג הזברה שימוש הקרינה רדיואקטיבית לאחר photoconversion (FDAP)
Summary
רמות חלבון בתאים וברקמות לעתים קרובות מוסדרות היטב על ידי האיזון של ייצור חלבון ופינוי. שימוש בקרינה רדיואקטיבית לאחר photoconversion (FDAP), קינטיקה האישור של חלבונים ניתן למדוד באופן ניסיוני בvivo.
Abstract
יציבות חלבון משפיעה על היבטים רבים של ביולוגיה, ומדידת קינטיקה השחרור של חלבונים יכולה לספק תובנות חשובות במערכות ביולוגיות. בניסויי FDAP, האישור של חלבונים בתוך אורגניזמים חיים ניתן למדוד. חלבון של העניין מתויג עם חלבון פלואורסצנטי photoconvertible, בא לידי ביטוי בvivo וphotoconverted, והירידה באות photoconverted לאורך הזמן היא פיקוח. הנתונים אז מצויד במודל פינוי מתאים כדי לקבוע את חלבון מחצית החיים. חשוב לציין, קינטיקה פינוי אוכלוסיות חלבון בתאים שונים של האורגניזם יכולה להיבחן בנפרד על ידי יישום מסכות compartmental. גישה זו נעשתה שימוש כדי לקבוע את זמן מחצית החיים התוך וחוץ-תאיים של חלבוני איתות מופרשים במהלך פיתוח דג הזברה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לניסויי FDAP בעוברי דג הזברה. זה צריך להיות אפשרי להשתמש FDAP לקבוע קינטיקה סליקתכל חלבון taggable בכל אורגניזם אופטי נגיש.
Introduction
הרמות של חלבונים בתאים ואורגניזמים נקבעות על ידי תעריפי ייצור שלהם ואישור. זמן מחצית חיים של חלבון יכולים לנוע בין דקות לימים 1-4. בהרבה מערכות ביולוגיות, יש הייצוב או אישור של חלבוני מפתח השפעות חשובות על פעילות הסלולר. אפנון של יציבות חלבון תאית נדרש להתקדמות מחזור התא 5,6, איתות התפתחותית 7-9, אפופטוזיס 10, ותפקוד תקין ותחזוקה של נוירונים 11,12. יציבות חלבון תאית משפיעה על ההתפלגות וזמינות של חלבונים מופרשים, כגון morphogens 13,14, בתוך רקמה.
במהלך העשורים האחרונים, יציבות חלבון בעיקר הוערכה בתרבית תאים באמצעות דופק תיוג הרדיואקטיבי או ניסויי מרדף cycloheximide 15. בניסויי דופק מרדף כזה, תאים או זמניים נחשפו ל" דופק "של אמין רדיואקטיבייםמבשרי חומצה שמשולבים בחלבונים מסונתזים חדש, או שהם נחשפים לcycloheximide, אשר מעכב את סינתזת חלבון. תאים בתרבית ולאחר מכן נאספו בנקודות זמן שונות, וגם immunoprecipitation אחרי autoradiography (בניסויי דופק מרדף רדיואקטיבי) או מערבית סופג (בניסויי cycloheximide) משמשת לכמת את האישור של חלבון לאורך זמן.
יש מבחני יציבות חלבון קונבנציונליים כמה חסרונות. ראשית, חלבונים במבחנים אלה הם בדרך כלל לא באו לידי ביטוי בסביבות אנדוגני, אלא בתרבית רקמה ולעתים בתאים ממינים שונים. לחלבוני יציבותה תלוי קשר, גישה זו היא בעייתית. שנית, לא ניתן לעקוב אחרי שחרור מחלבון בתאים או אורגניזמים בודדים לאורך זמן, והנתונים ממבחנים אלה משקפים ממוצע של אוכלוסיות שונות של תאים בנקודות זמן שונים. מאחר ותאים בודדים אולי התחילועם כמויות שונות של חלבון, אולי לקח את התווית או cycloheximide רדיואקטיביים בזמנים שונים, או שיש לי קינטיקה אישור שונה, נתונים מצרפיים כזה יכולים להיות מטעים. לבסוף, במקרה של ניסויי מרדף cycloheximide, תוספת של מעכב הסינתזה של החלבונים עלולה להיות השפעות פיסיולוגיות בטעות שיכולות לשנות באופן מלאכותי יציבות חלבון 16-18. ניתן להימנע מחסרונות אלה באמצעות הקרינה רדיואקטיבית לאחר photoconversion (FDAP), טכניקה שמשתמשת בחלבוני photoconvertible למדוד אישור חלבון באופן דינמי באורגניזמים החיים 19-25 (ראה דיון למגבלות של טכניקת FDAP).
חלבוני photoconvertible הם חלבוני ניאון עירור פליטה שהתכונות ולשנות לאחר חשיפה לאורכי גל מסוים של אור 26. גרסה הנפוצה אחת היא Dendra2, חלבון "ירוק-עד-אדום" photoconvertible שתחילה יש לשעברמאפייני ציטוט ופליטה דומים לחלבוני ניאון ירוקים, אבל אחרי חשיפה ל" photoconversion "בהיר UV -its עירור / מאפייני פליטה להיות דומים לאלה של חלבוני ניאון אדומים 23,27. חשוב לציין, החלבון חדש שיוצר לאחר photoconversion לא יהיה לי מאפייני עירור / פליטה זהות לחלבון photoconverted, המאפשר ניתוק של ייצור ואישור על photoconversion והתבוננות רק בריכה של חלבון photoconverted. תיוג חלבוני עניין עם חלבוני photoconvertible כך מספק דרך נוחה לדופק תווית חלבונים באורגניזמים שלמים, אופטי נגישים חיים.
במבחני FDAP (איור 1 א), חלבון של העניין מתויג עם חלבון photoconvertible ובא לידי ביטוי באורגניזם חי (איור 1). חלבון ההיתוך הוא photoconverted, והירידה באות photoconverted לאורך הזמן מנוטרת על ידי fluorescenמיקרוסקופיה ce (איור 1 ג). הנתונים אז מצויד במודל מתאים כדי לקבוע את זמן מחצית החיים של חלבון ההיתוך (1D איור).
Assay FDAP המתואר כאן נועד לקבוע את זמן מחצית החיים תאיים של חלבוני איתות מופרשים בעוברי דג הזברה בעובר מוקדם 19. עם זאת, גישה זו יכולה להיות מותאמת לכל אורגניזם מודל שקוף שסובל הדמיה לחיות, ויכול לשמש כדי לפקח על הפינוי של כל חלבון תאיים או תאי taggable. וריאציות של הטכניקה המתוארת כאן בוצעו בתאים בתרבית 20,23 ותסיסנית 22 ועכבר 21 עוברים.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההצלחה של ניסוי FDAP מסתמכת על הדור של חלבון היתוך photoconvertible פונקציונלי. תיוג חלבון יכול להשפיע על פעילותה הביולוגית ו / או נכסי biophysical, כוללים הלוקליזציה שלה, מסיסות, ויציבות 36-41. להיות מוכן לבחון את הפעילות של כמה מבני היתוך שונים כדי למצוא אחד שהוא פעיל. מצאנו כי ש…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לג'פרי פארל, ג'יימס גניון, וג'ניפר ברגמן להערות על כתב היד. KWR נתמכה על ידי קרן מדע בוגר תכנית עמיתי המחקר הלאומית במהלך הפיתוח של assay FDAP. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מ- NIH לAFS ועל ידי מענקים מקרן המחקר הגרמנית (Emmy תכנית נטר), מקס פלאנק החברה, והתכנית לאדם Frontier המדע (פיתוח קריירה פרס) לראש הממשלה.
Materials
| PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab) | Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems. | ||
| mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit (Life Technologies, AM1340) | To generate capped mRNA for injection into embryos | ||
| Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa (Life Technologies, D34682) | Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks | ||
| 6-well plastic dish (BD Falcon) | Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting | ||
| Embryo medium | 250 mg/l Instant Ocean salt, 1 mg/l methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3 | ||
| Protease from Streptomyces griseus (Sigma, P5147) | Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage | ||
| 5 cm diameter glass petri dish | For embryo dechorionation | ||
| 200 ml glass beaker | For embryo dechorionation | ||
| Microinjection apparatus | For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage | ||
| Stereomicroscope | For injecting and mounting embryos | ||
| 1x Danieau's medium | Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2 | ||
| UltraPure low melting point agarose (Invitrogen, 16520-100) | For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau's medium: add 200 mg to 20 ml Danieau's medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 °C, re-melted at 70 °C, and cooled to 40 – 42 °C when ready to use | ||
| Glass Pasteur pipette (Kimble Chase (via Fisher), 63A53WT) | For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos | ||
| Metal probe | For positioning embryos during mounting | ||
| Glass bottom dishes (MatTek, P35G-1.5-14-C) | Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5 | ||
| 15 ml tube (BD Falcon) filled with ~5 ml embryo medium | For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette | ||
| Inverted laser scanning confocal microscope | A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required | ||
| Heated stage | To maintain embryos at the optimal temperature of 28 °C during the experiment | ||
| Confocal software capable of time-lapse imaging | Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals | ||
| 25x or 40x water objective | Objective for imaging | ||
| 10x air objective | Objective for photoconversion | ||
| Immersion oil | Immersion oil with the same refractive index as water |
Referencias
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Boisvert, F. M., et al. A Quantitative Spatial Proteomics Analysis of Proteome Turnover in Human Cells. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (3), 011429 (2012).
- Belle, A., Tanay, A., Bitincka, L., Shamir, R., O’Shea, E. K. Quantification of protein half-lives in the budding yeast proteome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 13004-13009 (2006).
- Eden, E., et al. Proteome Half-Life Dynamics in Living Human Cells. Science. 331 (6018), 764-768 (2011).
- Parry, D. H., O’Farrell, P. H. The schedule of destruction of three mitotic cyclins can dictate the timing of events during exit from mitosis. Current Biology. 11 (9), 671-683 (2001).
- Holloway, S. L., Glotzer, M., King, R. W., Murray, A. W. Anaphase is initiated by proteolysis rather than by the inactivation of maturation-promoting factor. Cell. 73 (7), 1393-1402 (1993).
- Dharmasiri, N., Estelle, M. Auxin signaling and regulated protein degradation. Trends Plant Sci. 9 (6), 302-308 (2004).
- MacDonald, B. T., Tamai, K., He, X. Wnt/beta-catenin signaling: components, mechanisms, and diseases. Developmental Cell. 17 (1), 9-26 (2009).
- Chen, X., et al. Processing and turnover of the Hedgehog protein in the endoplasmic reticulum. The Journal of Cell Biology. 192 (5), 825-838 (2011).
- Elmore, S. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
- Yi, J. J., Ehlers, M. D. Emerging Roles for Ubiquitin and Protein Degradation in Neuronal Function. Pharmacological Reviews. 59 (1), 14-39 (2007).
- Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
- Müller, P., Schier, A. F. Extracellular Movement of Signaling Molecules. Developmental Cell. 21 (1), 145-158 (2011).
- Eldar, A., Rosin, D., Shilo, B. -. Z., Barkai, N. Self-enhanced ligand degradation underlies robustness of morphogen gradients. Developmental Cell. 5 (4), 635-646 (2003).
- Zhou, P. Determining protein half-lives. Methods In Molecular Biology. 284, 67-77 (2004).
- Woodside, K. H. Effects of cycloheximide on protein degradation and gluconeogenesis in the perfused rat liver. Biochim Biophys Acta. 421 (1), 70-79 (1976).
- Schimke, R. T., Doyle, D. Control of enzyme levels in animal tissues. Annual Review of Biochemistry. 39, 929-976 (1970).
- Kenney, F. T. Turnover of rat liver tyrosine transaminase: stabilization after inhibition of protein synthesis. Science. 156 (3774), 525-528 (1967).
- Müller, P., et al. Differential Diffusivity of Nodal and Lefty Underlies a Reaction-Diffusion Patterning System. Science. 336 (6082), 721-724 (2012).
- Kiuchi, T., Nagai, T., Ohashi, K., Mizuno, K. Measurements of spatiotemporal changes in G-actin concentration reveal its effect on stimulus-induced actin assembly and lamellipodium extension. The Journal of Cell Biology. 193 (2), 365-380 (2011).
- Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. E., Pantazis, P. Oct4 kinetics predict cell lineage patterning in the early mammalian embryo. Nature Cell Biology. 13 (2), 17-123 (2011).
- Drocco, J. A., Grimm, O., Tank, D. W., Wieschaus, E. Measurement and Perturbation of Morphogen Lifetime: Effects on Gradient Shape. Biophys J. 101 (8), 1807-1815 (2011).
- Zhang, L., et al. Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level. BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).
- Miyawaki, A. Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 636-668 (2011).
- Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 327-339 (2014).
- Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Innovation: Photoactivatable fluorescent proteins. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (11), 885-891 (2005).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
- Zou, J., Wei, X. Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), (1995).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
- Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. In Vivo Cell Tracking Using PhOTO Zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1148, 217-228 (2014).
- Schier, A. F. Nodal Morphogens). Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (5), a003459-a003459 (2009).
- Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans Syst Man Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).
- Pédelacq, J. -. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2005).
- Swulius, M. T., Jensen, G. J. The Helical MreB Cytoskeleton in Escherichia coli MC1000/pLE7 Is an Artifact of the N-Terminal Yellow Fluorescent Protein Tag. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6382-6386 (2012).
- Landgraf, D., Okumus, B., Chien, P., Baker, T. A., Paulsson, J. Segregation of molecules at cell division reveals native protein localization. Nature Methods. 9 (5), 480-482 (2012).
- Stadler, C., et al. Immunofluorescence and fluorescent-protein tagging show high correlation for protein localization in mammalian cells. Nature Methods. 10 (4), 315-323 (2013).
- Quattrocchio, F. M., Spelt, C., Koes, R. Transgenes and protein localization: myths and legends. Trends Plant Sci. 18 (9), 473-476 (2013).
- Morimoto, Y. V., Kojima, S., Namba, K., Minamino, T. M153R Mutation in a pH-Sensitive Green Fluorescent Protein Stabilizes Its Fusion Proteins. PLoS ONE. 6 (5), e19598 (2011).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 185 (7), 1135-1148 (2009).
- Moll, U. M., Petrenko, O. The MDM2-p53 interaction. Mol Cancer Res. 1 (14), 1001-1008 (2003).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-2987 (2013).
- Hwang, W. Y., et al. Heritable and Precise Zebrafish Genome Editing Using a CRISPR-Cas System. PLoS ONE. 8 (7), 68708 (2013).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
- Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nature Methods. 10 (4), 329-331 (2013).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of Zebrafish Early Embryonic Development by Scanned Light Sheet Microscopy. Science. 322 (5904), 1064-1069 (2008).
- Blanchet, M. H., et al. Cripto Localizes Nodal at the Limiting Membrane of Early Endosomes. Science Signaling. 1 (45), ra13-ra13 (2008).
- Jullien, J., Gurdon, J. Morphogen gradient interpretation by a regulated trafficking step during ligand-receptor transduction. Genes & Development. 19 (22), 2682-2694 (2005).
- Incardona, J. P., et al. Receptor-mediated endocytosis of soluble and membrane-tethered Sonic hedgehog by Patched-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 12044-12049 (2000).
- Scholpp, S., Brand, M. Endocytosis Controls Spreading and Effective Signaling Range of Fgf8 Protein. Current Biology. 14 (20), 1834-1841 (2004).
- Bläßle, A., Müller, P. . PyFDAP: Automated analysis of Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP) experiments. Bioinformatics. In Press, (2014).
