Mesure de la stabilité des protéines dans le salon embryons de poissons zèbres en utilisant la fluorescence Decay Après Photoconversion (FDAP)
Summary
Les teneurs en protéines dans les cellules et les tissus sont souvent étroitement réglementées par l'équilibre de la production de protéines et de dégagement. En utilisant la fluorescence Decay Après Photoconversion (FDAP), la cinétique de dégagement de protéines peuvent être mesurées expérimentalement in vivo.
Abstract
la stabilité des protéines influence de nombreux aspects de la biologie, et de mesurer la cinétique de libération de protéines peut fournir des informations importantes sur les systèmes biologiques. Dans les expériences FDAP, la clairance de protéines dans les organismes vivants peut être mesurée. Une protéine d'intérêt est marquée avec une protéine fluorescente photoconvertible, exprimée in vivo et photoconverted, et la diminution du signal dans le temps photoconverted est surveillée. Les données sont ensuite muni d'un modèle d'autorisation approprié pour déterminer la demi-vie de la protéine. Fait important, la cinétique de libération des populations de protéines dans les différents compartiments de l'organisme peuvent être examinées séparément en appliquant des masques à compartiments. Cette approche a été utilisée pour déterminer les demi-vies intra- et extracellulaires de protéines de signalisation sécrétées pendant le développement du poisson zèbre. Ici, nous décrivons un protocole pour des expériences FDAP dans embryons de poisson zèbre. Il devrait être possible d'utiliser FDAP pour déterminer la cinétique de libération detoute protéine tagable dans tout organisme optiquement accessible.
Introduction
Les niveaux de protéines dans des cellules et des organismes sont déterminés par leurs taux de production et de dégagement. Protéines demi-vie peut varier de quelques minutes à 1-4 jours. Dans de nombreux systèmes biologiques, la stabilisation ou la clairance de protéines clés a des effets importants sur l'activité cellulaire. La modulation de stabilité de la protéine intracellulaire est nécessaire pour la progression du cycle cellulaire de 5,6, la signalisation du développement 7-9, 10 l'apoptose, et la fonction normale et le maintien des neurones 11,12. La stabilité des protéines extracellulaires affecte la distribution et la disponibilité des protéines sécrétées, telles que 13,14 morphogènes, dans un tissu.
Au cours des dernières décennies, la stabilité des protéines a été évaluée principalement dans la culture de cellule à l'aide d'impulsions marquage radioactif ou d'expériences de chasse cycloheximide 15. Dans ces expériences pulse-chase, les cellules sont soit transitoirement exposées à un «pouls» de aminés radioactifsprécurseurs acides qui sont incorporés dans des protéines nouvellement synthétisées, ou ils sont exposés à la cycloheximide, qui inhibe la synthèse des protéines. Les cellules cultivées sont ensuite recueillies à différents points dans le temps, ainsi que d'une immunoprécipitation suivie d'une autoradiographie (en radioactives expériences pulse-chase) ou western blot (dans des expériences de cycloheximide) est utilisé pour quantifier la clairance de la protéine au fil du temps.
Classiques tests de stabilité des protéines présentent plusieurs inconvénients. Tout d'abord, les protéines dans ces dosages sont souvent pas exprimées dans leurs environnements endogènes, mais plutôt dans une culture tissulaire et parfois dans des cellules provenant d'espèces différentes. Pour les protéines dont la stabilité dépend du contexte, cette approche est problématique. Deuxièmement, il ne est pas possible de suivre la clairance de la protéine dans des cellules ou des organismes individuels au cours du temps, et les données provenant de ces essais reflète une moyenne de différentes populations de cellules à différents points dans le temps. Depuis cellules individuelles peuvent avoir commencéavec différentes quantités de protéines, peut avoir pris l'étiquette ou cycloheximide radioactifs à des moments différents, ou peuvent avoir différents cinétique d'élimination, ces données agrégées peuvent être trompeuses. Enfin, dans le cas d'expériences de chasse cycloheximide, l'addition de l'inhibiteur de la synthèse des protéines peut avoir des effets physiologiques non désirées qui pourraient modifier artificiellement la stabilité des protéines de 16 à 18. Ces lacunes peuvent être évités en utilisant la fluorescence Decay Après Photoconversion (FDAP), une technique qui utilise des protéines photoconvertible pour mesurer la clairance de la protéine dynamiquement dans les organismes vivant 19-25 (voir Discussion des limitations de la technique FDAP).
Photoconvertible protéines sont des protéines fluorescentes dont excitation et d'émission propriétés changer après une exposition à des longueurs d'onde spécifiques de la lumière 26. Une variante couramment utilisé est Dendra2, une protéine "vert au rouge» photoconvertible qui a initialement excitations et d'émission des propriétés similaires aux protéines fluorescentes vertes, mais après une exposition à "la photoconversion" de -son excitation UV / propriétés d'émission deviennent semblables à celles des protéines fluorescentes rouges 23,27. Surtout, nouvelle protéine produite après photoconversion ne aura pas les mêmes propriétés d'excitation / émission que la protéine photoconverted, permettant découplage de la production et de la clairance à la photoconversion et l'observation de seulement une piscine de protéines photoconverted. Marquage des protéines d'intérêt avec des protéines photoconvertible fournit ainsi un moyen pratique d'impulsion-étiquette protéines dans les organismes vivants intacts, optiquement accessibles.
Dans les dosages de FDAP (Figure 1A), une protéine d'intérêt est marquée avec une protéine photoconvertible et exprimé dans un organisme vivant (figure 1B). La protéine de fusion est photoconverted, et la diminution du signal photoconverted cours du temps est suivie par fluorescenMicroscopie CE (figure 1C). Les données sont ensuite équipé d'un modèle approprié pour déterminer la demi-vie de la protéine de fusion (Figure 1D).
Le dosage FDAP décrit ici a été conçu pour déterminer les demi-vies extracellulaires de protéines de signalisation sécrétées dans embryons de poisson zèbre au début de l'embryogenèse 19. Cependant, cette approche peut être adapté à tout organisme modèle transparent qui tolère l'imagerie en direct, et pourrait être utilisé pour surveiller le jeu de toute protéine intracellulaire ou extracellulaire tagable. Variations de la technique décrite ici ont été réalisées dans des cellules cultivées 20,23 et 22 drosophile et la souris 21 embryons.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le succès d'une expérience FDAP repose sur la génération d'une protéine de fusion photoconvertible fonctionnel. Une protéine de marquage peut affecter son activité biologique et / ou les propriétés biophysiques, y compris sa localisation, la solubilité, la stabilité et 36 à 41. Soyez prêt à tester l'activité de plusieurs différentes constructions de fusion afin de trouver celui qui est actif. Nous avons trouvé que la modification de la position de la protéine photoconvertible par…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Jeffrey Farrell, James Gagnon, et Jennifer Bergmann des commentaires sur le manuscrit. KWR a été soutenu par le Programme National Science Foundation Graduate Research Fellowship lors de l'élaboration de l'essai FDAP. Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH à AFS et par des subventions de la Fondation allemande pour la recherche (programme Emmy Noether), la Société Max Planck, et le Programme Human Frontier Science (Career Development Award) à PM.
Materials
| PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab) | Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems. | ||
| mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit (Life Technologies, AM1340) | To generate capped mRNA for injection into embryos | ||
| Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa (Life Technologies, D34682) | Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks | ||
| 6-well plastic dish (BD Falcon) | Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting | ||
| Embryo medium | 250 mg/l Instant Ocean salt, 1 mg/l methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3 | ||
| Protease from Streptomyces griseus (Sigma, P5147) | Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage | ||
| 5 cm diameter glass petri dish | For embryo dechorionation | ||
| 200 ml glass beaker | For embryo dechorionation | ||
| Microinjection apparatus | For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage | ||
| Stereomicroscope | For injecting and mounting embryos | ||
| 1x Danieau's medium | Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2 | ||
| UltraPure low melting point agarose (Invitrogen, 16520-100) | For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau's medium: add 200 mg to 20 ml Danieau's medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 °C, re-melted at 70 °C, and cooled to 40 – 42 °C when ready to use | ||
| Glass Pasteur pipette (Kimble Chase (via Fisher), 63A53WT) | For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos | ||
| Metal probe | For positioning embryos during mounting | ||
| Glass bottom dishes (MatTek, P35G-1.5-14-C) | Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5 | ||
| 15 ml tube (BD Falcon) filled with ~5 ml embryo medium | For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette | ||
| Inverted laser scanning confocal microscope | A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required | ||
| Heated stage | To maintain embryos at the optimal temperature of 28 °C during the experiment | ||
| Confocal software capable of time-lapse imaging | Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals | ||
| 25x or 40x water objective | Objective for imaging | ||
| 10x air objective | Objective for photoconversion | ||
| Immersion oil | Immersion oil with the same refractive index as water |
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