Der Nachweis von IgE-Wahre exprimierenden Maus B Lineage Cells
Summary
In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.
Abstract
B-Lymphozyten-Immunglobulin schwere Kette (IgH) Klassenwechsel-Rekombination (CSR) ist ein Verfahren, bei dem zunächst ausgedrückt IgM schaltet auf andere IgH Isotypen, wie IgA, IgE und IgG. Messung der IgH CSR in vitro ist ein Schlüsselverfahren für die Untersuchung einer Reihe von biologischen Prozessen, die von DNA-Rekombination und Reparatur, um Aspekte der molekularen und zellulären Immunologie. In vitro CSR Assay das durchflusszytometrische Meßfläche Ig-Expression auf aktivierten B-Zellen. Während Messung des IgA- und IgG-Subklassen ist einfach, ist die Messung von IgE durch dieses Verfahren problematisch aufgrund löslichen IgE-Bindung an FcεRII / CD23, das auf der Oberfläche von aktivierten B-Zellen. Hier beschreiben wir ein einzigartiges Verfahren für die genaue Messung von IgE-produzierende Maus-B-Zellen, die CSR in Kultur erfahren haben. Das Verfahren basiert auf Trypsin-vermittelten Spaltung von IgE-CD23-Komplexen auf der Zelloberfläche gehalten und erlaubt die Detektion von IgE-produzierenden B-Linie Zellen durch cytoplasmic Färbung. Dieses Verfahren bietet eine komfortable Lösung für die durchflusszytometrische Analyse von CSR an IgE.
Introduction
Während der schweren Immunglobulinkette (IgH) Klassenwechsel-Rekombination (CSR) in Mäusen und Menschen, μ die IgH Exons der konstanten Region (C & mgr;) gelöscht und durch eine von mehreren Sätzen von nachgeschalteten Exons der konstanten Region (C H s) (z Cy ersetzt, C & egr; und C & alpha;), was zu einem Wechsel von der Herstellung von IgM auf die Herstellung von anderen Ig-Klassen (beispielsweise IgG, IgE oder IgA). CSR tritt innerhalb Schalter (S) Regionen, die 1-10 kb-Sequenzen, die 5 'an jeden Satz von C H s 1 sind. Die Aktivierungs-induzierte Cytidindeaminase (AID) Enzym initiiert CSR über Cytidin Desaminierung Aktivität.
IgE ist ein wichtiger Mediator der allergischen Erkrankung 2 und ein besseres Verständnis dafür, wie IgE produziert und reguliert kann Türen zu neuen Therapieansätzen zu atopischen Erkrankung zu öffnen. In Mäusen und Menschen, ist die IgE streng reguliert Ig Isotyp. IgE wird normalerweise in Mengen Tausende von tim erkanntes weniger als andere IgH Isotypen 3, kann jedoch stark bei Krankheitszuständen 4 erhöht werden. Jedoch CSR an IgE ist nicht vollständig verstanden. In vitro-Aktivierung von B-Zellen mit IL-4 in Kombination mit entweder Anti-CD40 oder LPS induziert CSR sowohl IgG1 und IgE 5. Aktivierte B-Zellen exprimieren den niedrigen affinen IgE-Rezeptors FcεRII / CD23 2,6, die die lösliche IgE in Kultur nach CSR abgesondert bindet. Deshalb bei der Analyse mit Durchflusszytometrie, B-Zellen mit rezeptorgebundenen IgE-Färbung ähnlich wie Zellen endogen exprimierenden IgE 7b. Obwohl bekannt ist, dass die Maus-B-Zellen das geringe Affinität IgG-Rezeptor FcγRIIB1 (CD32) 8, in unserer Erfahrung ist es offenbar nicht mit der Messung der Klassenwechsel zu IgG1 stören. Allerdings, wenn die Messung IgE Schalt nach B-Zell-Aktivierung in der Kultur, nicht spezifische oberflächengebundene IgE kann die Analyse verschleiern. Mit gemeinsamen Färbeverfahren, Fleck nicht IgE-exprimierenden Zellen positiv für IgE.
Hier skizziert ist eine Strategie, die verwendet worden ist, um CSR-Tests von Mäusen 9 durchführen und erkennen wahre IgE-exprimierenden Zellen, B – 11. Behandlung von aktivierten B-Zellen mit Trypsin, einem gemeinsamen Labor-Reagens, um Protein zu verdauen, entfernt sowohl cytophylic und Membran-gebundenen Oberfläche IgE. Nachfolgende Permeabilisierung und Färbung für zytoplasmatische IgE zeigt somit die wahren IgE-produzierenden Zellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stimulation von Maus-Milz-B-Zellen in Kultur mit Anti-CD40 und IL-4 wird T-Helfer Typ 2 (TH 2) Wechselwirkungen, ermutigend Klassenumschaltzeit IgG1 und IgE 5 simulieren. B-Zellen können für CSR im Rahmen der Gesamt Splenozyten 12 oder als gereinigte Milz-B-Zellen, 11 aktiviert werden. Wie in dem Protokoll (Schritt 2.3) angemerkt, ist B-Zell-Anreicherung optional, und liegt im Ermessen des Experimentators, ob es von Vorteil, zu ermitteln. Positive magnetische Trennung von B-…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DRW wird durch NIH Zuschüsse AI089972 und AI113217 und durch die Mukosaimmunologie Studies-Team unterstützt, und hat einen Career Award für medizinische Wissenschaftler der Burroughs Wellcome Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Mouse IgE FITC | BD Pharmingen | 553415 | clone R35-72 |
| Rat Anti-Mouse IgG1 PE | BD Pharmingen | 550083 | clone A85-1 |
| Methanol | BDH | BDH1135-4LP | Keep at -20 °C |
| Falcon Cell Strainer 40 µm Nylon | Corning | 352340 | |
| Falcon Cell Strainer 70 µm Nylon | Corning | 352350 | |
| Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-4052-82 | clone RA3-6B2 |
| anti-Mouse/Rat CD40 | eBioscience | 16-0402-85 | clone HM40-3 |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| MEM-NEAA (100X) | Gibco | 11140-050 | |
| Phosphate Buffered Saline (10X) | Lifetechnologies (Corning) | 46-013-CM | |
| MACS CD45R (B220) microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-501 | |
| MACS purification column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| IL-4 | PeproTech | 214-14 | Reconstitute in water or 0.1% BSA |
| Formalin Solution, Neutral Buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Trypsin-EDTA Solution (10X) | Sigma Aldrich | T4174-100mL | 5.0g Trypsin, 2.0g EDTAŸ4Na per Liter of 0.9% NaCl |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100mL | 10,000U Penicillin; 10 mg/mL Streptomycin (100X) |
| L-Glutamine 200mM | Sigma Aldrich | G7513 | |
| 2-mercaptoethanol (99%) | Sigma Aldrich | M6250-100mL | |
| Red cell lysis buffer | Sigma Aldrich | R7757 | |
| Rat Anti-Mouse IgM RPE/cy7 | SouthernBiotech | 1140-17 | clone 1B4B1 |
| HyClone Fetal Calf Serum | Thermo | SH30910.03 | |
| B cell Stimulation media | B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1X MEM-NEAA, 2.0mM L-glutamine, 1X Penicillin-Streptomycin (Penicillin:100 U/ml, Streptomycin: 100 µg/ml), Beta-mercaptoethanol (7 µL/L), IL-4 (20 ng/mL), and anti-CD40 (1 µg/mL) |
Referencias
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