Geração de Células T humanas alo-específicos a partir de Sangue Periférico

Os linfócitos T são componentes críticos do sistema imunitário adaptativo. As células T são responsáveis ​​não só para mediar directamente respostas imunitárias protectoras para agentes patogénicos através de uma variedade de mecanismos efectores, mas também manter activamente auto-tolerância imunológica e dirigir as respostas de outras células do sistema imunológico. Estas funções são dirigidos através de um número de sinais integrados, incluindo o receptor de células T (TCR) de ligação, citocinas e quimiocinas, e metabolitos ^1. Destes sinais, o TCR é de particular importância, uma vez que proporciona a especificidade característica que define o papel de células T na imunidade adaptativa. Um TCR interage com antigénios peptídicos lineares apresentados pelo MHC (HLA ortólogo humano) moléculas (complexos pMHC) de um modo altamente específico e sensível para fornecer os sinais que dão início a função efectora de células T. Os parâmetros bioquímicos das interacções TCR com ligandos pMHC proporcionam não só a especificidade para o tativação celular, mas também tem um impacto qualitativo sobre a função das células T posterior ^2. Assim, estudar a função das células T exige frequentemente a examinar as respostas de células T com especificidade antigénica clonais definido.

O compartimento da célula T humana, contendo cerca de 10 ¹² células T αβ, contém uma estimativa de ¹⁰ julho-10 agosto αβTCRs distintas ^3-4. Este repertório diversificado oferece oportunidade para o reconhecimento da vasta gama de peptídeos de potenciais patógenos que exigiria uma resposta das células T para a imunidade protetora. Estima-se que a frequência de células T de responder a um determinado antigénio estranho apresentado por auto-MHC é da ordem de 10 ^-4 – ^-7 10 na ausência de resposta imune antes que o antigénio ^5. O repertório de células T naive é moldada por selecção tímica para assegurar a capacidade de reconhecer auto-MHC que apresenta antigénios peptídicos e limite reagemivity contra antigénios auto-péptido, a maximização da utilidade potencial para mediar a imunidade protectora ^2. No entanto, em violação da presente concebido reactividade, uma relativamente grande frequência, 10 ^-3 – ^-4 10, de células T a partir de indivíduos imunologicamente naive respondem à estimulação com células alogénicas, que reconhece ambas as moléculas MHC estranhos, bem como os peptídeos endógenos que apresentem ^6. O reconhecimento de ligandos pMHC alogénicos é estruturalmente semelhante ao do reconhecimento de antigénios estranhos apresentados pelas auto-MHC; o TCR faz interacções bioquímicas críticas, tanto com a molécula de MHC alogénico, bem como o péptido apresentado ^7. A natureza robusta da resposta das células T para estimulação resulta alogénicas a partir da diversidade de complexos pMHC presente na superfície de células alogénicas ^8. Estima-se que cada MHC apresenta cerca de 2 x 10 ⁴ diferentes antigénios peptídicos endógena ^9. Este breadth de resposta à estimulação alogénica é um aspecto importante da patologia clinicamente relevantes, tais como a rejeição de aloenxertos ou a doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD), que resulta a partir de células T alloreactivity.

Estudo de células T respostas alorreativas humanos tradicionalmente invocado examinar as respostas policlonais de células T naive após a estimulação com células alogênicas. Estimulação repetida com a mesma linha de célula alogénica combinado com análises de diluição limitante é capaz de gerar células T clonais com reconhecimento definido alogénica de HLA de ^10. No entanto, esta abordagem é problemática para examinar respostas aos ligandos alogénicos pMHC individuais, como o repertório grande e diverso de complexos pMHC endógeno presente para um dado alogénica de HLA estimula um amplo repertório de células T. Esta estimulação população a granel e de diluição limitante abordagem exigiria o rastreio de grandes números de clones para isolar as células T com a desejada Reactividade contra um único ligando pMHC. Além disso, a frequência de células T que respondem a uma célula alogénica ligando pMHC individuais é relativamente baixo entre as populações de células T ingénuas, o que apresenta uma barreira eficiente para a geração de clones de células T humanas que respondem a um dado antigénio.

Identificação e isolamento de células T específicas de antigénios a partir de populações policlonais têm sido activado pelo desenvolvimento de marcado com fluoróforo pMHC multímeros ^11. Esta abordagem utiliza antigénios peptídicos específicos carregados em moléculas de MHC recombinantes solúveis, biotinilados que são marcados por ligação a um fluoroforo marcado com estreptavidina. Multimerização de pMHC aumenta a avidez, compensando a afinidade intrínseca baixa (M) de TCR para ligantes pMHC solúveis. As células marcadas podem ser identificadas e isoladas por citometria de fluxo. No entanto, esta abordagem é ainda limitada pela baixa frequência de células T específicas do antigénio entre as populações de células T naive, que são tipicamenteordens de grandeza menor do que o limite de identificação e quantificação precisas sobre a maioria das citómetros de fluxo. Para resolver esta limitação, um método de rotulagem pMHC tetrâmero e subsequente enriquecimento esfera magnética para células marcadas com tetrâmero foi desenvolvida ^12. Este método tem demonstrado uma detecção fiável, enumeração e isolamento de células específicas para o antigénio T de baixa frequência.

Este protocolo descreve um protocolo eficaz para a geração de clones de células T humanas que respondem especificamente a ligandos alogénicos pMHC individuais. O protocolo aplica pMHC (HLA) de rotulagem e enriquecimento multímero para o isolamento de células T humanas específicas do aloantigénio com citometria de fluxo de células de triagem e um método robusto para a cultura in vitro de células T humanas, para permitir a produção de clones de células T a partir de células separadas individuais ( Resumo na Figura 1).