Plazmid vektörler oluşturulması Gibson tertibatı kullanılarak insan uzama faktör-1α bir promotörün regülasyonu altında FLAG-etiketli Proteinlerinin İfade
Summary
Synthesis of custom plasmids is labor and time consuming. This protocol describes the use of Gibson assembly cloning to reduce the work and duration of custom DNA cloning procedure. The protocol described also produces reliable tagged protein constructs for mammalian expression at similar cost to the traditional cut-and-paste DNA cloning.
Abstract
Gibson tertibatı (GA) klonlanması, geleneksel DNA klonlama yöntemleri için hızlı, güvenilir ve esnek bir alternatif sunmaktadır. Bu fare embriyonik kök hücreleri eksojen genin (mESCs) ekspresyonu için özel plazmitleri yaratmak için GA kullanılır. SV40 ya da insan sitomegalovirüs promotörlerin kontrolü altında ekzojen genlerin sentezlenmesi mESCs içine transfeksiyonundan sonra hızlı bir şekilde azalır. Bu azalmış ifadesi için bir çare gen sentezlenmesini tahrik etmek için, insan uzama faktör-1 alfa (hEF1α) promoteri kullanmaktır. HEF1α içeren plazmid vektörleri, SV40-veya CMV ihtiva eden plasmidler, özellikle de ihtiva eden N-terminali 3xFLAG etiketleri gibi yaygın olarak mevcut değildir. Burada açıklanan protokol hEF1α promotörünün anlatım regülasyonu altında FLAG etiketli CstF-64 ve CstF-64 mutantı ifade plazmitleri oluşturmak için hızlı bir yöntemdir. GA mümkün DNA fragmanlarının uçları üst üste bir klonlama için bir DNA ekzonükleaz, DNA polimerazı ve DNA ligazı bir karışımını kullanır.Biz mevcut vardı şablon DNA'lar dayanarak, bizim yapıları tek bir dizisi içine monte edilecek şekilde tasarlanmıştır. Tasarım, dört DNA parçaları kullanılır: pcDNA 3.1 vektör omurga hEF1α yükseltici bölüm 1 (a çift kollu sentetik DNA fragmanı olarak satın 3xFLAG-etiketi ihtiva), ve her iki CstF-64 ya da belirli CstF-64 mutant hEF1α yükseltici bölüm 2. Bu fragmanların dizileri, DNA fragmanlarının üretilmesi için uygun PCR primerlerinin tasarlanması için bir primer üretim aracına aktarılmıştır. PCR'den sonra DNA fragmanları, seçici işareti ve GA klonlama reaksiyonu ihtiva eden vektör toplandı ile karıştırılmıştır. Bağımsız dönüştürülmüş bakteri kolonilerinden gelen plasmidler izole edildi. Plazmidler başlangıç ekran sekanslama ile, sınırlama sindirimi ile yapıldı. Sonuç olarak, GA bize ekranları ve doğrulama yapı dahil olmak üzere, 5 gün içinde gen ifadesi için özel plazmitleri yaratmak için izin verdi.
Introduction
Geleneksel DNA klonlama prosedürleri birlikte, DNA parçalarını birleştirmek üzere, DNA ve DNA ligazı bölmek için kısıtlama enzimlerinin kullanımına dayanmaktadır. Farklı DNA fragmanlarını ihtiva eden özel sentezleme konstruktlarının Üretimi birine ve / veya birden fazla sınırlama endonükleazları ve ligasyon yoluyla DNA parçalarının daha sonra yerleştirilmesi ile DNA bölünmesini içeren sıralı bir işlemdir. Bu işlemin önemli bir dezavantajı imkansız ilgi tam-boy proteinin başarılı DNA klonlama oluşturma (yani, birden fazla bölme sitesi olabilir) DNA fragmanlarının biri için uygun kısıtlama enzimleri tespit etmek zor olabilir olmasıdır. Bu nedenle, özel ifade üretimi özel protein etiketleri ile etkin hücre tipine özgü promoterlerin transkripsiyonel regülasyonu altında yapıları dikkatli bir tasarım gerektirmektedir. Aynı zamanda bir zaman ve emek harcayan bir tekniktir. Son zamanlarda, birçok rapor MULTIP monte yöntemleri tarifsınırlama kullanılmadan bir ya da iki aşamalı reaksiyonla ya da aynı anda sürekli bir dizi le farklı sentetik DNA fragmanları 1-3 enzimleri. tek-aşamalı bir klonlama reaksiyonu (tüm hazırlık adımları hariç), bir DNA ekzonükleaz, DNA polimerazı, DNA ligaz, 2,3 ve DNA parçalarının bir üst üste binen uçları, (Şekil 1) 'in bir karışımı kullanımına bağlıdır. Kısıtlama enzimleri hiçbir kullanımı olduğu için, herhangi bir boyut ve (Tekrarlanan dizileri hariç) sekansı bileşimin DNA fragmanları bir kesintisiz bir yapı içinde birbirine birleştirilebilir. Son zamanlarda, bir ticari kit (Gibson montaj, GA) bir adım klonlama reaksiyonlar için kullanılabilir hale geldi. Bu kit, özel promoterler ve protein etiketleri ile tek bir vektörde herhangi bir DNA fragmanlarının hızlı ve ekonomik bir montaj sağlar.
Memeli hücre kültürü modelleri ekzojen proteinleri ifade etmek için kullanılan geniş çapta plazmid ifade vektörleri kopyalama reg altında genelliklevirüs, sitomegalovirüs (CMV) ya da Simian virüsü 40 (SV40) promoterlerin modülasyon. Bunlar, viral promoterler, memeli hücre kültürü göre büyük bir çoğunluğunda ekzojen proteinlerin sağlam geçici ifadesini sağlar. Bununla birlikte, kararlı bir şekilde ekzojen proteinleri eksprese eden hücre çizgilerinin üretimi için kuruluş süreci boyunca 4,5 'CMV veya SV40 promoterleri transkripsiyonel susturulması genellikle başarısız olur. Buna ek olarak, SV40, CMV ve viral promoterler yeterince lenfoid veya embriyonik kök hücreler, 6,7 hücreler ekzojen proteinlerin ifadesini teşvik edecektir. Viral promoterler doğasında sınırlama çözelti güçlü yapısal olmayan viral promoterlerin 8-10 kullanmaktır. Insan kökenli bir iyi karakterize edilmiş güçlü yapısal olmayan viral promoteri (hEF1α ribozom 11 aminoasil-tRNA GTP-bağlı esas nin kataliz işlemine dahil olan) uzama faktörü 1α (hEF1α) promotörüdür. Bununla birlikte,hEF1α promoterini ihtiva eden ifade vektörleri, özellikle olanlar da ilgilenilen proteinin amino terminal ucunda 3 x FLAG ihtiva eden plasmidler ihtiva eden viral promoter olarak yaygın olarak mevcut değildir.
64,000 MA bölünme uyarım faktör proteini (CstF-64) replikasyon bağlı histon mRNA 14,15 dahil olmak üzere en mRNA 12,13, 3 'ucu işleme katılır. CstF-64 somatik dokulardaki 12 olarak ifade edilir. Onun RNA tanıma motifi bölünme ve poliadenilasyon sitesi 16 aşağısında doğmakta transkript üzerinde GU-zengin RNA dizileri bağlanır. CstF-64 ön-mRNA'nın bağlanması, bu yeni oluşan transkriptin etkili endonükleolitik bölünmesini teşvik eder.
Burada, bir protokol DNA fragmanlarının PCR amplifikasyonu kullandığı açıklanmaktadır, (kimyasal olarak kompetan bakteriyel hücreleri içerir) Gibson düzeneği klonlama kiti 3xFLAG-etiketli m özel vektörler oluşturmakOuse CstF-64 ya da mutant CstF-64 hEF1α promotör 1 ifadesi altında, amino terminal ucuna.
Protocol
Representative Results
Discussion
GA klonlama başarılı kullanımı her zaman tam yapı (Şekil 2 ve Şekil 3) dikkatli bir tasarım önünde olmalıdır.
Astar nesil aracı tarafından tasarlanan primer dizilerinin Dikkatli doğrulama da şiddetle tavsiye edilir. GA primerleri astar oluşturma aracı kullanılmadan oluşturulabilir. Ancak, aracın kullanımı, süreci kolaylaştırır, çünkü son derece tavsiye ederiz. Genel olarak, GA klonlama için, primer iki farklı fonksiyonel dizilerine sahip olmalıdır. İlk dizisi DNA fragmanı ye-özeldir, ve PCR kullanılarak fragmanının büyütülmesine olanak tanır. İkinci dizisi GA montaj için gerekli olan bitişik fragmanı ile çakışıyor. Tipik bir DNA fragmanı spesifik dizisinin uzunluğu 18-22 nt olabilir. Aynı DNA'yı büyütmek için kullanılan DNA fragmanı spesifik sekanslar benzer erime sıcaklıkları ve GC içeriğine sahip olmalıdır. Çakışan dizisi olmalıdır 15 en aznt, en az 48 ° C'lik bir erime sıcaklığına sahip uzunluğu. fazla 4 DNA parçalarının montajı en az 20 nt olmak örtüşen dizisi gerektirir. Daha uzun çakışmalar daha düzgün monte DNA fragmanları sonuçlanan tavlama artan özgüllüğünü sağlayacaktır. Bu çarpık dizileri uygun DNA düzeneğini tehlikeye olabilir çünkü, onların GC veya çakışan dizileri gelişmekte içerik AT çarpık olan dizileri önlemek için tavsiye edilir.
Ayrıca herhangi bir ilaç-dirençli bakteri kolonileri, bir GA reaksiyonunda vektör omurgası tekabül eden sadece bir DNA fragmanını üreten gereken bir negatif kontrol olarak kullanarak göstermektedir. Seçenek olarak ise, "geçme" içeren DNA parçalarının bir de herhangi bir ilaç-dirençli bakteri kolonileri ile sonuçlanmalıdır GA reaksiyonu, ihmal edilebilir. Bir compl montajını kılacak hiçbir koloniler komşu DNA parçalarının üst üste uçları eksikliği olacak büyüyecek nedeni,ete plazmid.
Protokolü tarif olarak, çünkü kullanılan DNA parçalarının sayısı (Şekil 3) nt primer seti kullanılmıştır oluşturmak için 25 dizi ile üstüste gelen. 6 DNA fragmanlarını – astar üretme aracı web sitesinin önerisi 4 araya en az 20 nt örtüşen dizileri kullanmaktır (Ekipman Tablo bakınız). Buna ek olarak, daha kısa DNA şeritlerinin düzgün tamamlanmasını sağlayacak üstüste binen doğru olarak monte ürünlerin sayısının artırılması (bakınız Şekil 1).
Şu anda, kesintisiz klonlama için çeşitli sistemler mevcuttur. Ancak, bu sistemlerin bazıları hala (yani, Golden Gate 18 klonlama) kısıtlama enzimleri kullanın. Diğer aynı biyolojik bir kaynaktan 19 gelen aşı virüsü DNA polimerazı, tek iplikli bir DNA bağlayıcı protein göre enzimlerin özel karışımlar kullanılmaktadır. Her iki sistem de shor tarafından GA karşılaştırıldığında sınırlıdırdizi ile üstüste gelen ter uzunluğu. Kısa örtüşen diziler sorunlu fazla 23 DNA parçalarının doğru montajını render bitişik DNA parçalarının tavlama aşamasında, yeterli özgüllük sağlamak olmayabilir çünkü. Bu eksiklikler, GA sistemde mevcut değildir.
(uzunluğu, yani, en az 8 kbp), PCR tarafından güvenilir bir şekilde büyütülebilir boyutu aşmayacak şekilde amplifiye edilecek olan DNA parçalarının büyüklüğü de dikkate alınmalıdır. Hatta, son 10 yıl içinde DNA polimerazların işlevinde gelişmelerle, büyük DNA fragmanları daha az etkinlik ve doğruluk ile amplifiye edilir. Gerekirse, daha geniş DNA fragmanları, plazmid izole edilmiş ve sınır enzimleri ile sindirme ile uygun bir DNA, örneğin, PCR için alternatif olarak, diğer kaynaklardan elde edilebilir. Spesifik olarak, mevcut metin içinde tarif edilen protokol için eden PCR kullanımı mantıklı daha tüm az olan mevcut DNA fragmanlarının boyutuna dayandırılmıştır5 kbç. Agaroz jel elektroforezi ile tespit birden fazla PCR ürünü, varsa, istenen parçası boyutu jel saflaştırma veriler moleküler biyoloji teknikleri ya da uygun kitlerin herhangi biri kullanılarak tavsiye edilir. Mevcut protokol termostabil DNA polimeraz (Malzeme Tablo bakınız) kullanılır. Bununla birlikte, yüksek ölçüde doğruluk ve ürün sağlayan herhangi bir DNA polimeraz, bu protokol ile birlikte kullanılmak üzere uygun olacaktır. Protokol açıklanan farklı yüksek sadakat DNA polimerazlar varsa ilgili kılavuzlarda açıklandığı gibi, yukarı belirtilen şartları kullanın. Mevcut protokolde, kimyasal yetkili E. coli hücreleri GA kiti ile birlikte olduğu kullanılmaktadır. Seçenek olarak ise, kimyasal ya da elektro kompetan E. örneğin DH5a ya da DH10B gibi coli suşları kullanılabilir.
2x ana karışımı klonlama montaj az eller zamanla kullanımı kolaydır. Ancak, doğru pipet ne nedeniyle küçük hacimli gereklidireded birlikte karıştırılır. İyi moleküler biyoloji tekniği, hem sürekli icra edilmesi gerekmektedir.
GA klonlama uzun boyutu 3 kbp'yi daha DNA fragmanları, plazmid ve vektörler, bir inşaat için sınırsız olanaklar sunuyor. Örneğin, sentezini ve montajını sağlar Buna ek olarak bu, bütün bir bakteri (Mycoplasma mycoides) genomunun ya da bir maya (Saccharomyces cerevisiae) kromozom 20,21, sentetik biyoloji alanında daha geniş bir etkisi vardır. klasik klonlama kesintisiz yapıları oluşturmak için ihtiyacı için teknik de uygulanabilir.
Sonuç olarak, GA klonlama geleneksel DNA klonlama prosedürü, hızlı, güvenilir ve esnek bir alternatif sunmaktadır.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz cömertçe veren pcDNA 3.1 myc-His (A) ve hEF1α organizatörü içeren plazmidler için, Texas Tech Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi, Lubbock, Teksas ve Mladen Yovchev Pittsburgh Tıp Merkezi Üniversitesi, Pittsburgh de PA Michaela Jansen teşekkür etmek istiyorum . Bu yayında bildirilen araştırma ödülü numarası (CCM için) R01HD037109 altında Çocuk Sağlığı ve Ulusal Sağlık Enstitüleri İnsan Gelişimi Eunice Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. Ek destek Kadın Sağlığı (CCM ve PNG) Laura Bush Enstitüsü oldu. içerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Synthetic double-stranded DNA fragment (sDNA) | Integrated DNA Technologies | We used gBlocks, which can be up to 2 kb in length. However, there are many commercial sources of synthetic DNA available. | |
| DNA purification magnetic beads | Beckman Coulter | A63880 | Agencourt AMPure XP – PCR Purification system |
| Plasmid Isolation Mini Kit | Omega Bio-Tek Inc | D6942-01 | E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I |
| Gibson Assembly Cloning Kit | New England BioLabs | E5510S | |
| DNA polymerase | New England BioLabs | M0494S | Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix |
| DpnI | New England BioLabs | R0176S | |
| NheI | New England BioLabs | R3131S | |
| NotI | New England BioLabs | R3189S | |
| HindIII | New England BioLabs | R3104S | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop device | |
| EditSeq | DNASTAR | Part of Lasergene Core Suite | |
| SeqBuilder | DNASTAR | Part of Lasergene Core Suite | |
| Word | Microsoft | Part of Microsoft Office | |
| NEBuilder | New England BioLabs | primer generation tool: http://nebuilder.neb.com | |
| NEBioCalculator | New England BioLabs | ligation calculator: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation |
Referencias
- Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in enzymology. 498, 349-361 (2011).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature methods. 7, 901-903 (2010).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature methods. 6, 343-345 (2009).
- Bowtell, D. D., Johnson, G. R., Kelso, A., Cory, S. Expression of genes transferred to haemopoietic stem cells by recombinant retroviruses. Molecular biology & medicine. 4, 229-250 (1987).
- Challita, P. M., Kohn, D. B. Lack of expression from a retroviral vector after transduction of murine hematopoietic stem cells is associated with methylation in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 2567-2571 (1994).
- Lutzko, C., Senadheera, D., Skelton, D., Petersen, D., Kohn, D. B. Lentivirus vectors incorporating the immunoglobulin heavy chain enhancer and matrix attachment regions provide position-independent expression in B lymphocytes. Journal of Virology. 77, 7341-7351 (2003).
- Meilinger, D., et al. Np95 interacts with de novo DNA methyltransferases, Dnmt3a and Dnmt3b, and mediates epigenetic silencing of the viral CMV promoter in embryonic stem cells. EMBO reports. 10, 1259-1264 (2009).
- Chan, K. K., Wu, S. M., Nissom, P. M., Oh, S. K., Choo, A. B. Generation of high-level stable transgene expressing human embryonic stem cell lines using Chinese hamster elongation factor-1 alpha promoter system. Stem cells and development. 17, 825-836 (2008).
- Chung, S., et al. Analysis of different promoter systems for efficient transgene expression in mouse embryonic stem cell lines. Stem cells. 20, 139-145 (2002).
- Qin, J. Y., et al. Systematic comparison of constitutive promoters and the doxycycline-inducible promoter. PloS one. 5, e10611 (2010).
- Lund, A., Knudsen, S. M., Vissing, H., Clark, B., Tommerup, N. Assignment of human elongation factor 1alpha genes: EEF1A maps to chromosome 6q14 and EEF1A2 to 20q13.3. Genomics. 36, 359-361 (1996).
- Wallace, A. M., et al. Two distinct forms of the 64,000 Mr protein of the cleavage stimulation factor are expressed in mouse male germ cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6763-6768 (1999).
- MacDonald, C. C., McMahon, K. W. Tissue-specific mechanisms of alternative polyadenylation: testis, brain, and beyond. Wiley interdisciplinary reviews. RNA. 1, 494-501 (2010).
- Sabath, I., et al. 3′-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors. Rna. 19, 1726-1744 (2013).
- Yang, X. C., et al. A complex containing the CPSF73 endonuclease and other polyadenylation factors associates with U7 snRNP and is recruited to histone pre-mRNA for 3′-end processing. Molecular and cellular biology. 33, 28-37 (2013).
- Grozdanov, P. N., Macdonald, C. C. High-Throughput Sequencing of RNA Isolated by Cross-Linking and Immunoprecipitation (HITS-CLIP) to Determine Sites of Binding of CstF-64 on Nascent RNAs. Methods in molecular biology. 1125, 187-208 (2014).
- Youngblood, B. A., Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. CstF-64 supports pluripotency and regulates cell cycle progression in embryonic stem cells through histone 3′ end processing. Nucleic acids research. , (2014).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PloS one. 3, e3647 (2008).
- Irwin, C. R., Farmer, A., Willer, D. O., Evans, D. H. In-fusion(R) cloning with vaccinia virus DNA polymerase. Methods in molecular biology. 890, 23-35 (2012).
- Annaluru, N., et al. Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome. Science. 344, 55-58 (2014).
- Gibson, D. G., et al. Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome. Science. 329, 52-56 (2010).
