Detecteren Glycogeen in perifeer bloed mononucleaire cellen met Periodic Acid Schiff kleuring
Summary
Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.
Abstract
Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.
Introduction
Perjoodzuur Schiff (PAS) kleuring is een immunohistochemische techniek die algemeen wordt gebruikt in de spieren onderzoek en diagnostiek. Het wordt ook gebruikt als een diagnostisch hulpmiddel op bloedmonsters. De techniek werkt door het aanbrengen van periodieke zuuroplossing aan het monster, welke eenheden oxideert in het polysaccharide maken aldehydegroepen die reageren met de kleurloze Schiff reagens waardoor een diep magenta product produceren. De stappen van deze werkwijze zijn weergegeven in Figuur 1. De vlek wordt alles met magenta polysacchariden, zoals glycogeen, glycoproteïnen, glycolipiden, mucinen of andere moleculen met polysaccharide eenheden.
PAS kleuring wordt vaak gebruikt om glycogeen niveaus spiervezels meten. Spieren coupes zijn ideaal voor de techniek als ze stevig aan de glijbaan en bestand tegen meerdere stappen wassen en vlekken. Glycogeen is het meest aanwezig in fast twitch type II spiervezels, die een grote vraag hebbenvoor snelle ATP productie vereisen glycogeen voor maximale prestaties 1,2. Glycogeen is een vertakt polymeer van glucose dat in het vrije glucose kan worden gebroken door de werking van glycogeen fosforylase enzymen. In tijden van rust en voedingswaarde-genoegzaamheid, wordt glycogeen aangevuld door het proces van glycogenese, terwijl in tijden van nutritionele insufficiëntie of hoge-energie-vraag; glycogeen wordt afgebroken tot glucose door glycogenolyse. Al sinds 1950 clinicus wetenschappers ontdekt PAS-kleuring op bloedmonsters glycogeengehalte in verschillende ziekten 3-7 analyseren. Bijvoorbeeld, in Pompe ziekte een bonafide glycogeen opslag ziekte-witte bloedcellen accumuleren grote hoeveelheden glycogeen die aanzienlijk verschilt van gezonde controles 8.
Dit video-artikel wordt een aangepaste versie van PAS kleuring voor perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) monsters uit veneus bloed van gezonde vrijwilligers. PBMCs bevatten meestal lymfocyten van T lymfocyten en B-lymfocyten families, evenals andere immuuncellen zoals natuurlijke killer-cellen en monocyten. De eerste zuiveringsstap verwijdert erytrocyten, neutrofielen en andere granulocyten. Deze techniek verschaft gegevens over een geconcentreerde hoeveelheid lymfocyten waardoor robuustere opsomming van PAS-positieve cellen in vergelijking met volbloed uitstrijkjes.
Figuur 1:. Stapsgewijze methode PAS kleuring van PBMC (A) Ten eerste wordt isolatie van PBMC bereikt door Ficoll, het linkerpaneel toont de bereiding vóór centrifugatie, het rechter paneel toont het na centrifugeren waarbij de bufferlaag die de PBMC waargenomen in het midden van de buis. (B) Geïsoleerde PBMC worden bevestigd op de slede met formaline-ethanol fixeermiddel oplostie. De slede wordt voorzichtig gespoeld met gedestilleerd water uit een plastic wasfles. (C) Het objectglaasje wordt vervolgens in een 100 ml bekerglas halverwege gevuld met amylase oplossing die glycogeen zal oplossen. De slede wordt voorzichtig gespoeld. (D) De schuif wordt met periodieke zuuroplossing, waarbij oxidatie van sachariden plaatsvindt. Dia's worden voorzichtig gespoeld; Dit zal de overmaat perjoodzuur verwijderen en stop de oxidatiestap. (E) Wanneer de Schiffs reagens wordt toegevoegd aan de dia, zal het reageren met aldehyden die tijdens de oxidatiestap. Deze kleurloze reagens resulteert dan in een donkerrode magenta product. Dia's worden voorzichtig gespoeld om het overtollige Schiff reagens te verwijderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De kritische stappen van deze video artikel waren tijdens het wassen en amylase behandeling van de cellen. Terwijl het wassen van de dia's, werd de belangrijkste stap met behulp van een plastic samendrukbare wassen fles en het water te laten zachtjes lopen door het monster op de dia en niet direct gericht op de monsters. Zelfs de geringste directe waterdruk zou ertoe leiden dat de cellen af te komen van de glijbaan. Een andere belangrijke stap was dezelfde dia gebruiken ± amylase omstandigheden. Nadat de PBMC…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by a grant from the NSERC Discovery program grant number RGPIN 418522-2013. We thank R. Kilgour for helpful discussions, and Katelin Gresty and Dr. A. Berghdal for providing the mouse muscle sections.
Materials
| Periodic Acid Shiff Kit | Sigma-Aldrich | 395B | Bring to room temperature prior to use. Materials in this kit are toxic and harmful. Use caution http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/395b?lang=en®ion=CA |
| α-Amylase from porcine pancreas | Sigma-Aldrich | A3176 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a3176?lang=en®ion=CA |
| Binocular Microscope | Carl Zeiss Microscopy | Axio Lab A0 | |
| Glycogen Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK016 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/mak016?lang=en®ion=CA |
| Ficoll-Paque PLUS | VWR, GE Healthcare | 17-1440-02 | Nonionic synthetic polymer of sucrose https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4779441 |
| Centrifuge | For PBMC isolation, swing buckets were used |
Referencias
- Rich, P. R. The molecular machinery of keilin’s respiratory chain. Biochem. Soc. Trans. 31 (Pt 6), 1095-1105 (2003).
- Peter, J. B., Barnard, R. J., Edgerton, V. R., Gillespie, C. A., Stempel, K. E. Metabolic profiles of three fiber types of skeletal muscle in guinea pigs and rabbits). Bioquímica. 11 (14), 2627-2633 (1972).
- Jones, R. V., Goffi, G. P., Hutt, M. S. R. Lymphocyte glycogen content in various disease. J. Clin. Pathol. 15 (1), 36-39 (1962).
- Scott, R. B. Glycogen in human peripheral blood leukocytes. I. characteristics of the synthesis and turnover of glycogen in vitro. J. Clin. Invest. 47 (2), 344-352 (1968).
- Fedele, D., et al. positive index of lymphocytes and metabolic control in insulin-treated and type II diabetes mellitus. Diabete Metab. 9 (3), 188-192 (1983).
- Brelińska-Peczalska, R., Mackiewicz, S. Cytochemical studies of peripheral blood granulocytes and lymphocytes in patients with systemic lupus erythematosus. Pol.Med.Sci.Hist.Bull. 15 (2), 231-234 (1976).
- Yunis, A. A., Arimura, G. K. Enzymes of glycogen metabolism in white blood cells. I. glycogen phosphorylase in normal and leukemic human leukocytes. Cancer, Res. 24, 489-492 (1964).
- Hagemans, M. L., et al. PAS-positive lymphocyte vacuoles can be used as diagnostic screening test for pompe disease. J. Inherit. Metab. Dis. 33 (2), 133-139 (2010).
- Totsuka, Y., et al. Physical performance and soleus muscle fiber composition in wild-derived and laboratory inbred mouse strains. 95 (2), 720-727 (2003).
- Murat, J. C., Serfaty, A. Simple enzymatic determination of polysaccharide (glycogen) content of animal tissues. Clin. Chem. 20 (12), 1576-1577 (1974).
- Arrizabalaga, O., Lacerda, H. M., Zubiaga, A. M., Zugaza, J. L. Rac1 protein regulates glycogen phosphorylase activation and controls interleukin (IL)-2-dependent T cell proliferation. J. Biol. Chem. 287 (15), 11878-11890 (2012).
- Pelletier, J., G, J., Mazure, N. M. Biochemical titration of glycogen in vitro. J.Vis.Exp. (81), (2013).
- Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D. Tagliabracci V.S. Glycogen and its metabolism: Some new developments and old themes. Biochem.J. 441 (3), 763-787 (2012).
- Salmoral, E. M., Tolmasky, D. S., Krisman, C. R. Evidence for the presence of glycogen in rat thymus. Cell Mol.Biol. 36 (2), 163-174 (1990).
- Darlington, P. J., et al. Diminished Th17 (not Th1) responses underlie multiple sclerosis disease abrogation after hematopoietic stem cell transplantation. Ann.Neurol. 73 (3), 341-354 (2013).
