We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.
The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.
The lifelong turnover of sensory neurons distinguishes the olfactory system from many other sensory and neuronal systems1,2. Newly formed sensory neurons are continuously generated in the basal portion of the olfactory epithelium3 and extend their axons into the olfactory bulb, the first relay station of the olfactory system4. However, the cellular and molecular mechanisms controlling the formation and maintenance of the olfactory map are far from being fully understood4,5.
Here, we describe a protocol for labeling sensory neurons of the olfactory organ of larval X. laevis by in vivo electroporation of fluorophore-coupled dextrans. The presented protocol allows visualization of axonal morphology and connectivity, track axonal development over time and study mechanisms regulating axonal wiring and guidance.
Electroporation is a well established method to introduce charged macromolecules, like dextran-coupled dyes and DNA, into cells6,7. The cell membrane is permeabilized by application of short voltage pulses and the molecules are electrophoretically delivered into the cytosol8. Spatially restricted electroporation using a micropipette permits selective labeling of cells including neurons and has been applied in various neuronal systems including the visual system of X. laevis9,10.
We show how the electroporated animals can be used to study axonal growth patterns and morphology in living animals using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. The described procedure allows identifying the coarse topology of axonal projections of sensory neurons of the main and accessory olfactory system11,12. Using in vivo time lapse imaging, it is also suitable to supervise the glomerular connections of single mature sensory neurons, and to monitor the evolution of the axonal projection patterns of immature sensory neurons12. The described protocol can be applied to investigate the structure and formation of olfactory circuits in the intact animal and can be adapted to other cell types within the olfactory and other neuronal systems.
Det förfarande som beskrivs här tillåter märkning sensoriska neuroner i luktorganet av larver X. laevis genom elektroporering av fluoroforen kopplade dextraner och efterföljande visualisering av sensoriska axon tillväxt i levande djur. Genom att variera parametrarna för in vivo elektroporering är det möjligt att styra antalet märkta sensoriska neuroner. Det är därmed möjligt att märka stora grupper av nervceller i en sensorisk epitel, mycket få eller ens enskilda celler.
För att säkerställa den önskade omfattningen av neuronal märkning är det viktigt att vara särskilt försiktiga mikropipett egenskaper och elektroporation pulser. Högre pipett resistanser och minskning av spänningspulsen amplitud, varaktighet och antal upprepningar kan minska mängden av märkta celler, medan minskande pipett resistanser och högre spänning pulsamplituden, varaktigheten och antalet pulser kan leda till mer omfattande märkning. The utnyttjande av fluorescerande dextraner för elektroporering ger omedelbar visuell feedback om de tillämpade inställningarna är lämpliga. Var försiktig så att du använder parametrar för amplitud, längd och antal pulser som överstiger de värden som anges i protokollet kan potentiellt leda till cellskador eller till och med celldöd 17. Igensatta eller trasiga tips av mikropipetter kan också hindra lyckad elektroporering.
In vivo elektroporering i luktorganet för X. laevis är begränsad till larvstadier eftersom huden på postmetamorphotic grodor är tuffare och kan inte vara lätt penetreras med en mikropipett. In vivo visualisering av neuronala processer kan hindras genom spridning av excitation / emission ljus i djupare områden i hjärnan eller av blodkärl. Detta problem blir särskilt tydligt i högre larvstadier på grund av en större hjärna och kan leda till brusiga signaler som gör att tydligt identifiera fina axonal processer svårare.
<pclass = "jove_content"> Den presenterade protokoll tillstånd att visualisera sensoriska nervceller i intakt luktsinne utan att dissekera djur, skadar celler under märkning, förbereda vävnadsskivor eller fastställande av vävnaden som nödvändig för alternativa metoder, som märkning i hel-cell patch -clamp experiment 18. Vid kombination märkning av få eller enstaka sensoriska nervceller med in vivo-time lapse avbildning, är det möjligt att visualisera de glomerulära anslutningar enstaka mogna sensoriska nervceller över långa tidsintervall. På så sätt är det också möjligt att övervaka utvecklingen av axonal projektionsmönster omogna nervceller under flera veckor. Det senare alternativet är särskilt intressant eftersom den tillåter att övervaka tillväxtmönster hos enskilda axoner i det levande djuret. Detta öppnar möjligheten att undersöka cellulära och molekylära mekanismer som styr axon vägledning och pathfinding. Flera faktorer, bland annat luktreceptor uttryck, olika axon vägledning molekyler och luktämnen-inducerad / spontan aktivitet av sensoriska neuroner har visats reglera målet konstaterandet av sensoriska neuron axoner 4,5.Tillämpningen av protokollet är inte begränsat till lukt sensoriska neuroner, men kan även användas för att studera andra celltyper, t.ex.., Stam / progenitorceller av neurogena zoner den växande hjärnan eller mitralceller i luktbulben. Förutom den visade tekniken också kan användas i kombination med kalciumkänsliga dextraner eller injiceras membrangenomträngkalcium färgämnen för att få funktionell information om den märkta neuron och / eller den anslutna kretsarna 7,19. Tillgängligheten av ett stort antal fluoroforer kopplade till dextraner tillåter märkning av flera enskilda celler eller populationer med olika färger. Plasmid också DNA-lösning, t ex som kodar för fluorescerande proteiner, är lämplig för elektroporering och kan ytterligare förbättra versatility och nyttan av tekniken 6. Protokollet kan ytterligare förbättras för att möjliggöra kombinerade elektroporering av dextraner och DNA eller laddade morpholinos att manipulera genuttryck 13,17.
Den beskrivna metoden är verkligen ett nytt verktyg för att undersöka det komplexa och fortfarande inte helt klarlagda processer som reglerar axonal vägledning i ryggradsdjur luktsystemet.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by DFG Schwerpunktprogramm 1392 (project MA 4113/2-2), cluster of Excellence and DFG Research Center Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain (project B1-9), and the German Ministry of Research and Education (BMBF; project 1364480).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
SZX16 | Olympus | stereomicroscope with fluorescent illumination | |
Axon Axoporator 800A | Molecular Devices | single cell electroporator | |
ELP-01D | npi electronic | electroporator | |
MMJ | Märzhäuser Wetzlar | manual micromanipulator | |
P-1000 | Sutter | Horizontal micropipette puller | |
G150F-4 | Warner Instruments | glass capillaries for electroporation pipette fabrication; internal filament makes backfilling easier | |
Alexa 488-dextran 10kD | Life Technologies | D22910 | |
Alexa 546-dextran 10kD | Life Technologies | D22911 | |
Alexa 568-dextran 10kD | Life Technologies | D22912 | |
Alexa 594-dextran 10kD | Life Technologies | D22913 | |
TMR-dextran 3kD (micro-Ruby) | Life Technologies | D7162 | |
microloader pipette tips | eppendorf | 930001007 | |
tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | anesthetic; use gloves |
A1-MP | Nikon | multiphoton microscope | |
LSM 780 | Zeiss | confocal microscope | |
Imaris | Bitplane | alternative software for neuronal tracing |