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Neurociencias

Inibitorio formazione di sinapsi in un co-coltura modello che incorpora GABAergici di medie spinosa neuroni e cellule HEK293 che esprimono stabilmente GABA<sub> A</sub> Recettori

Published: November 14, 2014
doi:
10.3791/52115
, , , , ,
1UCL School of Pharmacy,University College London

Summary

I meccanismi molecolari che coordinare la formazione di sinapsi inibitorie GABAergici durante l'ontogenesi sono in gran parte sconosciuti. Per studiare questi processi, abbiamo sviluppato un sistema di co-coltura modello che incorpora embrionali i neuroni GABAergici di medie spinosa coltivate insieme stabilmente trasfettate rene embrionale umano 293 (HEK293), le cellule che esprimono i recettori GABA A funzionali.

Abstract

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA (γ-aminobutyric acid) is the predominant inhibitory neurotransmitter in the brain. It is released from the presynaptic terminals of inhibitory neurons within highly specialized intercellular junctions known as synapses, where it binds to GABAA receptors (GABAARs) present at the plasma membrane of the synapse-receiving, postsynaptic neurons. Activation of these GABA-gated ion channels leads to influx of chloride resulting in postsynaptic potential changes that decrease the probability that these neurons will generate action potentials.

During development, diverse types of inhibitory neurons with distinct morphological, electrophysiological and neurochemical characteristics have the ability to recognize their target neurons and form synapses which incorporate specific GABAARs subtypes. This principle of selective innervation of neuronal targets raises the question as to how the appropriate synaptic partners identify each other.

To elucidate the underlying molecular mechanisms, a novel in vitro co-culture model system was established, in which medium spiny GABAergic neurons, a highly homogenous population of neurons isolated from the embryonic striatum, were cultured with stably transfected HEK293 cell lines that express different GABAAR subtypes. Synapses form rapidly, efficiently and selectively in this system, and are easily accessible for quantification. Our results indicate that various GABAAR subtypes differ in their ability to promote synapse formation, suggesting that this reduced in vitro model system can be used to reproduce, at least in part, the in vivo conditions required for the recognition of the appropriate synaptic partners and formation of specific synapses. Here the protocols for culturing the medium spiny neurons and generating HEK293 cells lines expressing GABAARs are first described, followed by detailed instructions on how to combine these two cell types in co-culture and analyze the formation of synaptic contacts.

Introduction

GABA è uno dei primi neurotrasmettitori presenti nel cervello embrionale, che precede il più abbondante neurotrasmettitore eccitatorio glutammato 1. Durante lo sviluppo, GABA depolarizza ed eccita i neuroni immaturi, giocando un ruolo chiave nella regolazione della proliferazione cellulare, la migrazione e la formazione di reti neuronali senza indurre eccitotossicità. Nel cervello adulto, il potenziale di inversione per GABA A canali recettore viene spostata verso potenziali più negativi a causa di una diminuzione della concentrazione intracellulare di cloruro. Questo spostamento è causato da up-regolazione del potassio cloruro di co-trasportatore (KCC2), che trasporta cloruro fuori dalla cellula, e, in parallelo, down-regolazione del trasportatore sodio-potassio cloruro (NKCC1), che ha l'effetto opposto 2.

Nel cervello, il GABA si lega principalmente al recettore GABA sia A o GABA B di mediare l'inibizione sinaptica veloce o lenta, rispettivamentely. Recettori GABA A sono una classe di recettori noti anche come ionotropici heteropentameric o canali ionici Cys-loop di ligando-dipendenti. Due molecole di GABA sono necessari per l'attivazione del recettore, che è permeabile agli ioni cloruro e in misura minore, ioni bicarbonato. L'aumento in cloruro di conduttanza diminuisce l'efficacia depolarizzanti, eventi eccitatori nell'attivare il neurone postsinaptico 3.

Diversità strutturale dei recettori GABA A è da tempo riconosciuta come un fattore chiave nel determinare la loro vasta gamma di proprietà funzionali e farmacologiche. Rs Native GABA A sono etero-pentamers composti da subunità con più isoforme classificati come: α (1-6), β (1-3), γ (1-3), δ, ε, π e θ 3, con un comune topologia transmembrana comprendente un ampio dominio N-terminale extracellulare, quattro domini transmembrana (TM), e un importante dominio intracellulare tra TM 3 e 4 4. Ilβ3 e γ2 subunità sono essenziali per l'inibizione sinaptica e la sopravvivenza dell'organismo, in quanto topi portatori di delezione genetica di queste subunità muoiono dopo la nascita 5,6. Al contrario, le singole isoforme di subunità α sono importanti per la funzione di specifiche connessioni sinaptiche nel cervello associata con differenti comportamenti come ansia, sedazione, eccitazione, e altri, ma non sono, singolarmente, essenziale per la vita 7-9. Recettori GABA A sono i principali siti di azione per una varietà di farmaci con potenti sedativi, ipnotici, ansiolitici e gli effetti anticonvulsivanti, quali le benzodiazepine, barbiturici, neurosteroidi e anestetici 7,10,11.

Rs Synaptic GABA A in genere contengono una subunità γ2, due subunità β (più comunemente β2 β3 o) e due subunità α (α1, α2, α3 o α5) 12,13. La classe predominante di recettori extra sinaptica contiene la subunità δ in combinazionecon due subunità α (α4 o α6), e due subunità β (β2 β3) o 14. Localizzazione subcellulare di GABA A R verso assoni, dendriti e soma, e l'inserimento nella membrana plasmatica dipendono dalla presenza di β-subunità 15,16. Tuttavia, l'incorporazione selettiva di diversi GABA A R sottotipi in distinti tipi di sinapsi correla bene con la presenza di specifiche subunità α (α1, α2, α3 o α5) 7,17,18. È importante sottolineare che la cancellazione di α1 o α2 subunità nei topi causa alterazioni ultrastrutturali di sinapsi inibitorie 19. Ciò suggerisce che il GABA A loro RS può svolgere un ruolo diretto nella regolazione della formazione delle sinapsi.

Le prove indicano che lo sviluppo delle sinapsi GABAergica è una sequenza precisamente coordinato di eventi, in cui entrambi gli obiettivi neuronali contattati da diversi tipi di assoni inibitori e recettori che vengono raggruppati inciascuna classe di sinapsi inibitorie sono selettivi e funzionale in sintonia 17,20-22. Questo principio fondamentale di specificità a livello delle sinapsi GABAergici solleva la questione di come i partner pre- e post-sinaptici riconoscono l'un l'altro durante l'avvio di contatti sinaptici.

In vitro co-coltura sono state applicate con successo per studiare alcuni meccanismi di formazione delle sinapsi e per testare il ruolo delle singole proteine-leporino attraversa sinaptici in questo processo. Una delle combinazioni più comuni trans-sinaptica interagenti proteine ​​che funzionano in modo bidirezionale di mediare la formazione di sinapsi e la maturazione, sono il neurexins (Nrxns) e neuroligins (NLS). Nrxns sono proteine ​​presinaptiche che presentano splicing alternativo all'interno dei loro domini di proteine ​​leganti gli ormoni laminina-neurexin sesso, dando luogo a molte isoforme differenti 23. Mentre il Nrxns anche interagire con altre proteine, NLS si pensa di essere il loro onnipresente pa postsinapticortners 24. Insieme, queste proteine ​​contribuiscono a tenere le membrane presinaptiche e post-sinaptici in stretta e rigida apposizione 25. Le due isoforme più abbondanti sono NL-1 e NL-2, che sono presenti in sinapsi eccitatorie ed inibitorie, rispettivamente 26. Uno dei primi sistemi modello di co-coltura, progettato per studiare le interazioni proteina trans-sinaptici, impiegati diversi tipi di cellule non neuronali, linee cellulari più comunemente immortali come embrionali umane di rene (HEK) 293 cellule, di NL- over-express 2. Quando queste cellule sono state coltivate con neuroni pontini, è stato osservato un accumulo di proteine ​​presinaptiche in prossimità della superficie delle cellule HEK, indicando la formazione di contatti sinaptiche simili. L'aggiunta di β-solubile neurexin a questi co-culture ha inibito la formazione di contatti, suggerendo che le interazioni trans-sinaptica tra Nrxns e NLS sono necessari per il contatto sinaptico formazione 27. Inoltre, espressione transientedi β-neurexin in cellule COS (C V-1 (scimmia) in O rigine, e che trasportano il materiale genetico S V40) co-coltura con dissociato glutammatergico ippocampale e neuroni GABAergici espressione indotta della proteina gephryin postsinaptica e di subunità GABA A R γ2 e α2 nei punti di contatto tra questi due tipi di cellule 28. Un altro esempio di un modello di co-coltura utilizzato per studiare la formazione delle sinapsi coinvolte HEK293 cellule, transitoriamente trasfettate con GABA A R subunità α2 / β3 / γ2 e NL-2, e una popolazione mista di neuroni ipotalamici 29. Questo studio ha concluso che l'espressione di NL-2 è un requisito assoluto per la formazione di sinapsi inibitorie.

Α1 Tuttavia, nel recente studio di co-coltura, stabilmente transfettate / β2 / γ2 GABA A R in cellule HEK293 sono risultati sufficienti per indurre sinapsi funzionali quando co-coltura con med GABAergicineuroni spinosi IUM, senza la necessità di ulteriori proteine ​​di adesione trans-sinaptici o post-sinaptici. Tuttavia, un aumento di primo piano nella formazione delle sinapsi e la forza è stata osservata quando è stato co-espresso NL-2 con GABA A Rs 30. Ciò indica che questo sistema modello di co-coltura ha vantaggi rispetto ai sistemi modello precedentemente descritti, più evidentemente una maggiore sensibilità ed affidabilità di rilevamento contatto sinaptico. Due fattori importanti che contribuiscono al miglioramento complessivo della rilevazione dei contatti sinaptici sono: i) uso di linee cellulari stabilmente trasfettate HEK293 con espressione elevata e costante della subunità GABA A R sulla superficie di cellule singole. Tale coerenza facilita il confronto quantitativo tra le diverse condizioni di co-coltura. ii) L'uso di una popolazione pura di neuroni GABAergici medio spinosi coltivate dallo striato embrionale 31 rimuove complicazioni e ambiguità derivanti dall'uso delle popolazioni neuronali miste e alloWS, per esempio, selezione dei più appropriati tipi postsinaptici GABA A R che possono essere comparati con l'altro durante la formazione delle sinapsi.

La formazione di sinapsi è pensato di coinvolgere molti segnali trans-sinaptici all'interno di complessi di adesione cellulare pre- e post-sinaptici. A causa della natura bidirezionale di segnalazione sinaptica ed i numeri puri di molecole di adesione cellulare, è difficile identificare i componenti chiave coinvolti nella formazione di sinapsi. Così, transfezione una singola proteina di adesione cellulare in una cellula non neuronali (in questo caso, i due bersagli postsinaptici prevalenti del GABAergici neuroni medio spinosi in vivo, α1 / β2 / γ2 o α1 / β3 / γ2 GABA A Rs 32) notevolmente riduce la complessità dei segnali trans-sinaptica disponibili in superficie postsinaptico e permette una precisa analisi quantitativa dell'efficacia di questa proteina nel promuovere la formazione di sinapsi.

Protocol

Sprague-Dawley o BAB / c topi inbred (Harlan, Regno Unito, il numero di donne in gravidanza è stato utilizzato 30) sono stati alloggiati e sacrificati secondo UK Home Office [e Direttiva Comunità europee del Consiglio del 24 novembre 1986 (86/609 / CEE) ] linee guida. Il progetto è stato formalmente approvato dalla Scuola di Farmacia UCL Comitato Etico. 1. Preparazione degli strumenti, Cultura, Media e piatti Accendere e pulire la cappa a flusso laminare con il 70% di etanolo per lavorare in condizioni sterili in ogni momento. Preparare HEK293 mezzo di coltura cellulare contenente Dulbecco Modified Eagle Medium pH 7,4 (DMEM, 500 ml), L-glutammina (2 mM), penicillina (50 unità / ml), streptomicina (50 mg / ml) e siero fetale bovino (10 %). NOTA: la penicillina e la streptomicina sono irritanti. Preparare il terreno di coltura neuronale senza siero, contenente Neurobasal medio pH 7,4 (500 ml), B27 supplemento (25 ml), L-glutammina (2 mM), penicillina(50 unità / ml), streptomicina (50 mg / ml) e glucosio (6 mM). Preparare 500 ml di soluzione salina tamponata con HEPES (HBSS), contenenti HBSS 10x (50 ml), HEPES (1 M) (5 ml) e acqua (445 ml), pH 7,4. Autoclave soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, pH 7,4; 1 L), acqua (1 L), vetrini (13 mm di diametro) e pipette Pasteur in vetro per sterilizzare loro. 2. Preparazione di HEK293 linea cellulare stabile Esprimere α1 / β3 / γ2-GABA Rs A Piatto 2×10 6 cellule HEK293 in una piastra di coltura tissutale 10 centimetri sterili e incubare a 37 ° С in un umidificata al 5% di anidride carbonica (CO 2) nell'atmosfera (CO 2 incubatore) per raggiungere 70-90% di confluenza notte. Il giorno seguente, trasfezione le cellule HEK293 con GABA A R α1 subunità cDNA nel pcDN 3.1 (+) vettore di espressione che incorpora il disolfato G418 (Tabella 1) gene di resistenza,e il GABA A R β3 subunità cDNA nel vettore di espressione che incorpora la phleomycin D1 (Tabella 1) gene di resistenza (sia ai sensi del regolamento di un citomegalovirus umano diretto-precoce (CMV) promotore), utilizzando una formulazione di liposomi cationici, che complessi con negativamente molecole cariche di acido nucleico (Tabella 1) secondo il protocollo del produttore. Brevemente, aggiungere 500 ml di mezzo di siero ridotto (pH 7,4; Tabella 1) e 7,5 mg di ciascun cDNA per costruire una provetta sterile da centrifuga da 15 ml, seguito da 15 ml di liposomi trasfezione tampone del reagente, e mescolare delicatamente prima di lasciare a temperatura ambiente per 5 min. A questa miscela, aggiungere 8,75 ml di reagente di trasfezione liposomiale e miscelare nuovamente prima di lasciare a temperatura ambiente per 30 min. Successivamente, aggiungere 3 ml di mezzo di coltura cellulare HEK293 (senza antibiotici), pipettare il contenuto della provetta da centrifuga su e giù due volte, trasfer goccia a goccia sulle cellule che crescono in un 10 centimetri piatto di coltura dei tessuti, e incubare per 48 ore a 37 ° С in un umidificata al 5% di CO 2 nell'atmosfera (CO 2 incubatore). Lavare le cellule HEK293 delicatamente con PBS sterile, pH 7.4, e diluire le cellule HEK293 trasfettate in nuovi 10 centimetri piastre di coltura dei tessuti, nei seguenti rapporti: 1: 3, 1: 5, 1: 7, 01:10, 01:15 e 1:20. Questo assicura che le cellule non diventare eccessivamente confluenti. Inizio selezione delle cellule HEK293 esprimenti entrambi subunità GABA A R aggiungendo 800 ug / ml di ciascun marcatore di selezione antibiotica, G418 e Phleomycin D1, al mezzo di coltura. Incubare le cellule a 37 ° С in un umidificata al 5% di CO 2 nell'atmosfera (CO 2 incubatore) e sostituire il mezzo-antibiotico contenente (10 ml) ogni 2 giorni. Quando le piccole colonie bianche cominciano a formarsi (in genere dopo circa 7 giorni), selezionare con attenzione una singola colonia di ciascuno dei piatti e raccogliere utilizzando un P1000 sterilipunta della pipetta. Trasferimento ad un pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti contenente 500 ml di terreno e risospendere attentamente pipettando il mezzo su e giù. Assicurarsi che esattamente una colonia viene trasferito in ogni pozzetto (è consigliato per un totale di 5-20 colonie). Incubare le cellule a 37 ° С in un umidificata al 5% di CO 2 nell'atmosfera (CO 2 incubatore) e sostituire il medio-antibiotico contenente ogni 2 giorni. Una volta che le colonie diventano 70-80% confluenti, pipettare delicatamente il mezzo su e giù per rimuovere le cellule dal fondo della piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti. Trasferire e dividere la sospensione di cellule tra le 2 pozzetti in una piastra di coltura tissutale da 6 pozzetti. Incubare le cellule a 37 ° С in un umidificata al 5% di CO 2 nell'atmosfera (CO 2 incubatore) e sostituire il medio-antibiotico contenente ogni 2 giorni. Una volta 70-80% confluenti, raccogliere le cellule dal 1 dei 2 pozzetti contenenti le cellule provenienti dallo stesso singolo colonlisati proteici y e preparare. Brevemente, lavare le cellule 2x con PBS, pH 7,4, e aggiungere 200 ml di 2% sodio dodecil solfato (SDS) in PBS, pH 7,4. Raccogliere il lisato e trasferirlo alla provetta. Misurare la concentrazione di proteine ​​utilizzando reagenti proteina BCA (vedi Tabella 1) secondo il protocollo del produttore. Analizzare l'espressione di α1 e β3 subunità di recettori GABA A per SDS / PAGE e immunoblotting con anticorpi specifici subunità (coniglio anti-α1-specifici e coniglio anticorpi GABA A R anti-β3-specifici, si veda la Tabella 1 per le informazioni su questi anticorpi). Rimuovere e trasferire solo cloni positivi dalle restanti pozzi di sei centimetri più grandi piatti di coltura di tessuti. Incubare le cellule a 37 ° С in un umidificata al 5% di CO 2 nell'atmosfera (CO 2 incubatore) e sostituire il medio-antibiotico contenente ogni 2 giorni. A poco a poco espandere le colonie di cellule under la selezione antibiotica trasferendoli a 10 cm piatti di coltura di tessuti e, infine, fiasche di coltura di tessuto (T-75 boccette). Incubare le cellule a 37 ° С in un umidificata al 5% di CO 2 nell'atmosfera (CO 2 incubatore) e sostituire il medio-antibiotico contenente ogni 2 giorni. Piatto 70.000 cellule da ogni colonia su vetrini (13 mm di diametro) e fissare le cellule per analizzare l'espressione di superficie delle cellule e co-localizzazione delle subunità GABA A R mediante immunofluorescenza. Selezionare il clone positivo delle cellule HEK293 che esprimono alti livelli di entrambe le subunità α1 e β3 di recettori GABA A, piastra 2 x 10 6 cellule in un 10 centimetri piatto di coltura di tessuti sterili e incubare a 37 ° С in un umidificata al 5% di CO 2 nell'atmosfera ( CO 2 incubatore) durante la notte. Assicurarsi che le cellule sono incubate in-antibiotico contenente (G418 e Phleomycin D1) medio in ogni momento. Il giorno seguente, trasfettare HEK293 cellule con GABA A R γ2s subunità cDNA nel pcDNA ™ 3.1 (+) vettore di espressione che incorpora Hygromycin B gene di resistenza utilizzando un non liposomiale lipidi reagente di trasfezione (Tabella 1). NOTA: Questo metodo di trasfezione permette una migliore sopravvivenza e maggiore efficienza espressione di proteine ​​estranee in linee cellulari di crescita lenta stabili che si trovano sotto la selezione continua con antibiotici. In una sterile 15 ml tubo da centrifuga, aggiungere 250 ml di Enhancer e tampone di condensazione del DNA (Tabella 1) e 1.4 mg di γ2s GABA A cDNA subunità del recettore. Aggiungere 11,2 ml di Enhancer e vortex per 1 sec prima di lasciare a temperatura ambiente per 5 min. Aggiungere 35 ml di non liposomiale reagente di trasfezione lipidico e vortex per 10 secondi prima di lasciare a temperatura ambiente per 10 min. Aggiungere 3 ml di G418 / Phleomycin D1 contenenti medio e pipettare il contenuto della provetta su e giù due volte befminerale di trasferirli goccia a goccia sulle cellule che crescono in una piastra di coltura tissutale 10 cm. Incubare le cellule per 48 ore a 37 ° С in un umidificata al 5% di CO 2 nell'atmosfera (CO 2 incubatore). Lavare le cellule delicatamente con PBS sterile e diluirli in nuovi 10 centimetri piastre di coltura dei tessuti, nei seguenti rapporti: 1: 3, 1: 5, 1: 7, 1:10, 1:15 e 1:20. Inizia la selezione di α1 cellule / β3-HEK293 che esprimono la subunità γ2s con l'aggiunta di 800 mg / ml di marcatore di selezione antibiotica Hygromycin B al G418 / Phleomycin D1-terreno contenente. Sostituire il mezzo con il G418 fresco / Phleomycin D1 / medio Hygromycin B-contenimento (10 ml) ogni 2 giorni. Ripetere i passaggi 2,7-2,12, sotto la selezione continua in G418 / Phleomycin D1 / Hygromycin B contenenti terreno di coltura cellulare. Conservare i cloni positivi a -140 ° C in antibiotico libera terreno di coltura cellulare e il 10% dimetilsolfossido (DMSO) per l'uso futuro. Verificare il livellodi espressione di α1, β3 e γ2s subunità GABA A R mediante immunoblotting e immunofluorescenza in ogni clone dopo lo scongelamento, perché l'espressione può cambiare a causa di ridotta sopravvivenza delle cellule in selezione antibiotica. 3. Manutenzione di linee cellulari HEK293 Scongelare una fiala di controllo HEK293 cellule o quelle che esprimono Rs sia α1 / β2 / γ2-GABA A (Tabella 1) o α1 / β3 / Rs γ2-GABA A (descritto in precedenza) in 10 ml di terreno di coltura cellulare in una sterile 15 ml provetta da centrifuga. Centrifugare a 440 xg per 5 minuti per eliminare l'eccesso di DMSO. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1 ml di mezzo di coltura cellulare fresca. Prima aggiungere 9 ml di mezzo di coltura cellulare fresca per un piatto di coltura di tessuti 10 centimetri rivestito con poli-D-lisina (0,1 mg / ml) e poi 1 ml di cellule risospese. Agitare gentilmente, da lato a lato, per disperdere le cellule e incubare a 37 ° С in un umidificata5% di CO 2 nell'atmosfera (CO 2 incubatore). Il giorno seguente, aspirare il terreno per rimuovere i detriti e sostituire con 10 ml di fresco mezzo di coltura cellulare HEK293. Seleziona linee cellulari stabili con antibiotici per eliminare tutte le cellule che non esprimono subunità GABA A R e quindi non hanno anche l'espressione di marcatori di resistenza agli antibiotici. Per la linea / β2 / γ2 cellulare stabile α1, sostituire mezzo normale con fresco mezzo di coltura cellulare contenente G418 (800 mcg / ml). Per la linea α1 / β3 / cell γ2, sostituire con fresco mezzo di coltura cellulare contenente G418 (800 mg / ml), Phleomycin D1 (800 mg / ml) e Hygromycin B (800 mg / ml). ATTENZIONE! G418 è un irritante e Hygromycin B è corrosivo, tossico e irritante. Passaggio le cellule in un nuovo piatto di coltura tissutale da semina ad una densità più bassa, in presenza di> 70% di confluenza. Aspirare 10 ml di mezzo di coltura cellulare e lavare due volte brevemente conPBS, pH 7,4. Aggiungere 1 ml di soluzione di tripsina-EDTA, una soluzione di tripsina proteasi (0,05% tripsina) e Ca 2+ chelante EDTA (0,02%) in PBS, pH 7,4, per staccare le cellule dal piatto. ATTENZIONE! Tripsina-EDTA soluzione è un irritante. Aggiungere 10 ml di mezzo di coltura cellulare contenente antibiotici corretti, al piatto e aspirare le cellule. Centrifugare le cellule a 440 xg per 5 min e risospendere in 5 ml di mezzo di coltura cellulare. Passaggio le cellule utilizzando una diluizione 1:10 in una nuova pallone di coltura tissutale (pallone di T-75) contenente fresco mezzo di coltura cellulare e antibiotici corretti. Incubare le cellule a 37 ° С in un umidificata al 5% di CO 2 nell'atmosfera (CO 2 incubatore) e sostituire il mezzo ogni due giorni. Passage le cellule in cui> 70% confluenti (vedere il punto 2.8). 4. Preparazione di GABAergica medio spinoso Neuron Cultura In condizioni di sterilità preparare un 24-ciPiastra ll con poli-L-lisina (0,1 mg / ml) Rivestiti coprioggetto (13 mm di diametro) e incubare a 37 ° С in un umidificata al 5% di CO 2 nell'atmosfera (CO 2 incubatore). Il giorno seguente, aspirare con una pipetta l'eccesso poli-L-lisina e lavare coprioggetto con due brevi di 10 secondi e due lunghi lavaggi 5 min con acqua sterile. Aggiungere laminina (0,01 mg / ml) per una notte e incubare a 37 ° С in un umidificata al 5% di CO 2 nell'atmosfera (CO 2 incubatore). Sterilizzare l'area dissezione con il 70% di etanolo e raccogliere una serie di strumenti di dissezione quali pinze dei tessuti curve e rette, forbici e pinzette, e posto in etanolo al 70% per sterilizzare completamente gli strumenti da dissezione. Posizionare la gravidanza rat / mouse eutanasia con CO 2 sulla schiena e pulire la pelle del suo addome con il 70% di etanolo. Pizzicare la pelle con una pinzetta e tagliare intorno all'addome attraverso la pelle, muscoli e peritoneo, per rivelare gli organi interni e dell'uterocon gli embrioni in modo chiaro. Estrarre gli embrioni (E16-17) dal utero e metterli in una capsula di Petri con PBS raffreddato. Mettere gli embrioni in cappa a flusso laminare e decapitarlo, raccogliendo le teste in un nuovo piatto di Petri con freddo HBSS. Sotto un microscopio da dissezione, sezionare il cervello con le pinze curve e rette. Mettere il cervello in un nuovo piatto di Petri contenente freddo HBSS. Separare i due emisferi cerebrali e rimuovere con attenzione le meningi. Tagliare lungo la linea dell'ippocampo e togliere la corteccia per rivelare striato. Osservare striato come struttura bianca striata in anteriore dell'emisfero. Sezionare striato e tagliare in pezzi molto piccoli (1 – 2 mm di diametro) e usare una pipetta Pasteur lucidati a fuoco per raccogliere il materiale in una sterile 15 ml provetta da centrifuga con un volume totale di 1 ml. Fuoco lucidatura garantisce il materiale viene raccolto senza subire danni. Utilizzando il ti lucidati a fuocop della pipetta Pasteur, aspirare le cellule e rilasciare le 8 – 10 volte. Facendo una nuova pipetta con una punta di fuoco-polacco di circa il 30% del suo diametro originale (1 mm), triturare la soluzione di un ulteriore 4 – 6 volte finché esso appaia omogenea. Filtrare le celle utilizzando un 100 micron filtro cella di nylon in una provetta da centrifuga sterile fresco. Contare le cellule con un emocitometro e piastra 70.000 cellule in 500 ml di terreno di coltura neuronale per pozzetto in una piastra di coltura tissutale da 24 pozzetti. Agitare il pozzetti sinistra a destra e incubare a 37 ° С in un umidificata al 5% di CO 2 nell'atmosfera (CO 2 incubatore) per 14 giorni in vitro (DIV). Dopo 7 giorni, verificare la purezza delle culture neuronali e, se sono presenti cellule gliali, aggiungere citosina β-D-arabinoside (Ara-C, 5 mM) ai pozzetti per fermare la loro proliferazione. Per fare questo, togliere 250 ml di terreno di coltura neuronale (pH 7,4) da ogni pozzetto e aggiungere 250 ml di mezzo fresco contengonoING Ara-C. ATTENZIONE! Ara-C è un irritante. 5. Co-coltura Preparazione Il giorno 11 di coltura neuronale, cappotto una piastra da 6 pozzetti con poli-D-lisina (0,1 mg / ml) in condizioni sterili e incubare una notte a 37 ° С in un umidificata al 5% di CO 2 nell'atmosfera (CO 2 incubatore). Il giorno successivo (giorno 12 di coltura neuronale), aspirare l'eccesso poli-D-lisina e lavare i pozzetti 2x brevemente e 2x per 5 minuti con acqua sterile prima di aggiungere fresco mezzo di coltura cellulare (senza antibiotici) per rivestire i pozzetti con una piccola quantità di siero dal mezzo. Aspirare il terreno di coltura dal pallone di coltura tissutale (T-75). Lavare le cellule due volte con PBS prima di aggiungere 1 ml di Ca 2+ / Mg 2+ agente -chelating EDTA (0.48 mm) che delicatamente e non-enzimaticamente si dissocia cellule. Agitare le cellule staccarli dal fondo del pallone tessuti. Aggiungere 10 ml di mezzo di coltura cellulare (senza antibiotici come questo può interferire con la transfezione), aspirare le cellule e posto in una provetta da centrifuga sterile. Agglomerare cellule a 440 xg per 5 minuti utilizzando un banco centrifuga a bassa velocità. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1 ml di mezzo di coltura cellulare fresca. Utilizzando un emocitometro, contare le cellule e la piastra ad una densità di 3 x 10 5 cellule per pozzetto in una piastra da 6 pozzetti. Agitare delicatamente ed incubare per 24 ore a 37 ° С in un umidificata al 5% di CO 2 nell'atmosfera (CO 2 incubatore). Il giorno successivo (giorno 13 della cultura neuronale) transitoriamente trasfezione le cellule HEK293 con mCherry cDNA in pcDNA3 espressione costrutto usando il reagente liposomiale trasfezione. In breve, in una provetta sterile, aggiungere 500 ml di mezzo di siero ridotto e 5 mg di mCherry cDNA. Aggiungere 5 ml di reagente liposomiale buffering e mescolare delicatamente prima di lasciare a temperatura ambiente per 5 min. Aggiungere 8,75 ml di liposomi trasfezione REAGent e delicatamente mescolare prima di lasciare a temperatura ambiente per 30 min. Pipettare il contenuto della provetta su e giù due volte, trasferimento goccia a goccia a ciascun pozzetto della piastra di coltura tissutale da 6 pozzetti e incubare a 37 ° С in un umidificata al 5% di CO 2 nell'atmosfera (CO 2 incubatore). Il giorno successivo (giorno 14 di coltura neuronale), aspirare il mezzo di coltura cellulare HEK293 da ciascuno dei 6-pozzetti e lavare ogni brevemente ben due volte con PBS (pH 7,4). Aggiungere 300 ml di Ca 2+ / Mg 2+ agente -chelating EDTA (0.48 mM) e 200 ml di tripsina-EDTA (0,02-0,48 mM) soluzione ad ogni pozzetto e incubare a 37 ° С per 5 min. Aggiungere 1 ml di mezzo di coltura cellulare fresca HEK293 per pozzetto (questo placa la tripsina) e aspirare le cellule staccate in una sterile 15 ml tubo da centrifuga. Centrifugare le cellule a 440 xg per 5 minuti a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet in 500 ml di terreno di coltura neuronale (pH 7,4). </ Li> Utilizzando un emocitometro, contare le cellule e sementi ad una densità di 30.000 cellule per pozzetto in una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti contenenti neuroni. Agitare la piastra per disperdere le cellule e incubare co-colture a 37 ° С in un umidificata al 5% di CO 2 nell'atmosfera (CO 2 incubatore) per 24 ore. 6. Analisi della sinaptiche Contatti e loro attività Dopo 23 ore in co-coltura, studiare la formazione di contatti "attivi" tra i neuroni GABAergici di medie spinosi e cellule HEK293 con attività-dipendente assorbimento di anti-synaptotagmin luminale anticorpo specifico dominio coniugato con un colorante fluorescente (Cy5, vedi Tabella 1) . NOTA: L'anticorpo solo accedere al dominio luminale di synaptotagmin, a cui si lega quando vi è continuità tra il lume vescicole sinaptiche e lo spazio extracellulare. Ciò si verifica in particolare durante il rilascio dei neurotrasmettitori, rendendo questo ANTIBODY un eccellente marcatore dei terminali presinaptici attivi. In primo luogo lavare le co-colture di media neuronale (Neurobasal Un mezzo, pH 7.4; vedi Tabella 1) e aggiungere del mouse Cy5 marcato anticorpo anti-synaptotagmin, diluito 1:50 in terreno neuronale (Neurobasal Un mezzo, pH 7,4), al culture, per 30 min. Incubare le cellule durante questo tempo a 37 ° С in un umidificata al 5% di CO 2 nell'atmosfera (CO 2 incubatore). Per rimuovere l'accesso dell'anticorpo, lavare i co-colture tre volte brevemente: prima con fredda normale PBS (pH 7,4), secondo con PBS freddo (pH 7.4) contenente NaCl 200 mM, e la terza freddo normale PBS (pH 7.4) Fissare le cellule con 300 ml di paraformaldeide al 4% / 4% di saccarosio in PBS (PFA, pH 7,4) per 10 minuti con agitazione. Lavare le cellule due volte brevemente con PBS (pH 7,4), poi con due più lunghi di 10 min lavaggi. Aggiungi glicina (0,3 M) ad ogni pozzetto per 10 minuti con agitazione per placare PFA. Lavare le cellule briefly due volte con PBS (pH 7,4), poi con due lunghi 10 min lavaggi prima di aggiungere 300 ml di una soluzione bloccante (1% (w / v) di siero albumina bovina (BSA) in PBS, pH 7,4) per ridurre il legame non specifico di anticorpi. Aspirare la soluzione di saturazione e aggiungere la cavia anticorpo anti-GABA A R-γ2 diretto contro il γ2 N-terminale del dominio 33 (1: 3000 in PBS, pH 7,4) per una notte a 4 ° С. Il giorno seguente, aspirare l'anticorpo primario dai pozzetti e lavare le cellule brevemente due volte con PBS poi con due più lunghi di 10 min lavaggi. Permeabilize le cellule utilizzando Triton X-100 (0,1%) in soluzione di bloccaggio per 30 min a temperatura ambiente. Lavare le cellule due volte brevemente con PBS (pH 7,4), poi con due lunghi 10 min lavaggi prima di aggiungere sia l'anti-glutammico decarbossilasi acido mouse (GAD) 65 anticorpi (1: 4000, Tabella 1) o anticorpo di topo anti-sinapsina I ( 1: 1000, Tabella 1) per 120 min a T ambienteemperatura. Lavare le cellule due volte brevemente con PBS (pH 7,4), poi con due più 10 min lavaggi e quindi aggiungere la soluzione bloccante per 30 minuti a temperatura ambiente. Centrifuga gli anticorpi secondari appropriati (in genere di capra anti-IgG guinea pig coniugato con Cy5, di capra anti-topo IgG coniugato con Alexa Fluor 488 o di capra anti-topo IgG Alexa Fluor 405, il tutto a 2 mg / ml) per rimuovere gli aggregati di anticorpi a 21.910 xg per 10 minuti, e aggiungere gli anticorpi (1: 750) di soluzione bloccante. Applicare nei rispettivi pozzetti per 1 ora e coprire con un foglio di alluminio per proteggere i fluorofori da esposizione alla luce e conseguente photobleaching. Infine, lavare le cellule brevemente due volte con PBS (pH 7,4), poi con due più 10 min lavaggi per eliminare ogni anticorpo secondario non legato e montare i coprioggetti usando il reagente di montaggio (Prolungare oro, tabella 1) circa 10 ml per coprioggetto. Consentire 24 ore per impostare a temperatura ambiente al riparo dalla luce prima del trasferimento di 4° С per la conservazione a lungo termine. Analizzare i campioni utilizzando un microscopio confocale a scansione laser con un obiettivo ad immersione in olio 63X. Assicurarsi che i livelli di luce e il guadagno del rivelatore è regolato per evitare la saturazione. Osservare potenziali contatti sinapsi, come le regioni di co-localizzazione tra i terminali presinaptici positivi per GAD65, sinapsina I o Cy5 marcato anti-synaptotagmin e post-sinaptici HEK293 cellule visualizzati da DIC o l'indicatore di fluorescenza mCherry. Conte potenziali contatti sinapsi simile utilizzando serie Z-stack di sezioni ottiche (8 – 10) con una profondità di 4-5 micron per cella utilizzando il software di imaging.

Representative Results

Il protocollo per questo modello di sistema di co-coltura di cellule neurone-HEK293 è stato finemente sintonizzato per consentire la sopravvivenza delle cellule ottimale. In questo sistema, la formazione di contatti sinapsi-simili e loro analisi si basa su espressione stabile e coerente di tutti e tre subunità GABA A R che assemblano in un recettore funzionale. È quindi importante utilizzare analisi immunocitochimica di prova per subunità espressione sulla superficie delle cellule HEK293 prima di aggiungerli a colture neuronali. In questi esperimenti, espressione di superficie cellulare di α1, β2 e subunità γ2 (Figura 1A), o α1, β3 e γ2 subunità (Figura 1B), è stato rilevato utilizzando anticorpi specifici subunità che si legano agli epitopi extracellulari di queste subunità. Un alto grado di co-localizzazione tra queste subunità sulla superficie HEK293 è stata dimostrata. Dopo aver confermato l'espressione di superficie e co-localizzazione di GABA ASubunità R in HEK293 cellule, co-colture sono state preparate utilizzando HEK293 cellule che esprimono le subunità α1 / β2 / γ2 GABA A R e neuroni medio spinosi in coltura per 14 giorni (14 giorni in vitro (DIV)). Le cellule in co-coltura sono state incubate per 24 ore, fissa e analizzati con immunocitochimica e microscopia confocale. Analisi dei contatti indicato che assoni terminali GABAergici GAD65-positivi formate solo contatti sporadici con controllo HEK293 cellule (Figura 2A, 2B). Il numero di contatti rilevati in 4 ore era 7,3 ± 0,9 per cellulare HEK293, e questo numero è stato ridotto a 5,5 ± 0,5 connessioni (media ± SEM) per cella HEK293 a 24 ore dopo l'aggiunta di cellule HEK293 ai neuroni in coltura. Al contrario, i terminali GAD65-positivi assoni GABAergici formano numerosi contatti sinapsi-come con cellule HEK293 che esprimono recettori GABA A. Il numero di contatti ottenuti a 4 ore dopo l'aggiunta di cellule HEK293 era 28,3 ± 4,7 per cella HEK293, e questo numero è stato un ulteriore aumentod di 52,1 ± 6,3 (media ± SEM) per cella HEK293 a 24 ore in co-coltura (Figura 2A, 2B). Per determinare se questi contatti sinapsi, come fossero 'attivi', vale a dire supportato rilascio del trasmettitore vescicolare, un anticorpo Cy5 coniugato vescicole-luminale specifico del dominio anti-synaptotagmin è stato aggiunto al mezzo di co-coltura dopo 23 ore di incubazione. Questo anticorpo è incorporato in terminazioni nervose presinaptiche solo quando si forma un poro tra il lume vescicole sinaptiche e il liquido extracellulare nella fessura sinaptica durante il rilascio dei neurotrasmettitori. Dopo il rilascio, il poro si chiude, lasciando il synaptotagmin immunofluorescenza Cy5 coniugato attaccato al synaptotagmin all'interno della vescicola. In questo modo, solo le vescicole attivamente impegnati nel rilascio di neurotrasmettitore sono etichettati con l'anticorpo. In questi esperimenti pochi se eventuali contatti tra il controllo HEK293 cellule e dei terminali dei neuroni medio spinosi erano 'attiva & #8217; come mostrato dalla mancanza di co-localizzazione tra la presinaptico GAD65 / synaptotagmin fluorescenza e mCherry fluorescenza in cellule HEK293 (Figura 3A). Al contrario, molti contatti "attivi" si sono formate tra i terminali dei neuroni spinosi medi e α1 / β2 / γ2-cellule che esprimono HEK293, come rivelato da un alto grado di co-localizzazione tra GAD 65 / synaptotagmin e mCherry, espressa in particolare nelle cellule HEK293 ( Figura 3B). Α1 Per verificare se un diverso sottotipo di GABA A R può anche promuovere la formazione di sinapsi, come in vitro, abbiamo co-coltura / β3 / γ2 cellule che esprimono HEK293 con neuroni spinosi medi. Anche in questo caso, di controllo HEK293 cellule raramente hanno ricevuto contatti con sinapsina-positivi terminali presinaptici che raggiungono il 10,8 ± 0,48 contatti al cellulare HEK293 dopo 24 ore in co-coltura (Figura 4A sinistra, 4B) (± SEM media). Tuttavia, le cellule HEK293 che esprimonoα1 / β3 / γ2 forma GABA A Rs significativamente più contatti sinapsi-like con sinapsina-positivi terminali presinaptici dei neuroni spinosi medi che raggiungono 25,3 ± 0,27 (media ± SEM) i contatti per cella HEK293 dopo 24 ore in co-coltura (Figura 4A destra, 4B). Ciò indica che α1 / β3 / γ2 GABAA Rs espresso in cellule HEK293 sono anche in grado di promuovere la formazione di contatti sinaptici, seppure la loro potenza è inferiore alla potenza di α1 / β2 /-γ2 contenenti recettori GABA A. Questi esperimenti indicano che il sistema di co-coltura modello sviluppato nel nostro laboratorio consente l'analisi quantitativa della formazione contatto sinaptica in vitro e valutazione dell'efficacia dei diversi sottotipi di GABA A R in questo processo. Questi esperimenti dimostrano inoltre che i recettori GABA A, oltre ad essere componenti critici funzionali di sinapsi GABAergici, possono svolgere un ruolo chiavenel processo di riconoscimento e di formazione di contatti sinaptici tra neuroni inibitori e le opportune cellule bersaglio neuronali, indipendentemente da altre proteine ​​di adesione sinaptiche. Figura 1. immunocitochimica analisi di espressione del GABA A R α1 / β2 / γ2 o α1 / β3 / γ2 nelle linee di cellule HEK293 stabili. Gli anticorpi che riconoscono i domini extracellulari di subunità GABA A R sono stati usati per i recettori di etichette espresse sulla superficie cellulare. ( A) linea cellulare HEK293 che esprimono α1 (Alexa Fluor 488), β2 (Alexa Fluor 555) e γ2 (Cy5) ad alti livelli. (B) linea cellulare HEK293 che esprimono α1 (Alexa Fluor 488), β2 (Alexa Fluor 555) e γ2 (Cy5)subunità ad alti livelli. Scala bar:. 10 micron Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 2. neuroni GABAergici di medie spinosi formano contatti sinapsi-like con α1 / β2 / γ2- che esprimono le cellule HEK293 in co-coltura. (A) l'etichettatura fluorescente di terminali presinaptici con anticorpi anti-GAD65 (in verde) e le cellule HEK293 con mCherry (in rosso, a sinistra) o del GABA A R subunità γ2 (in blu, a destra), i punti di co-localizzazione tra queste ha rivelato marcatori che indicano la formazione di contatti sinapsi, come dopo 4 o 24 ore in co-coltura. Scala bar:. 10 micron (B) Analisi quantitativa di sinapsi, come co ntacts. Cellule HEK293 sono stati identificati in base alla loro forma, come rivelato da DIC imaging e / o l'espressione mCherry, e il numero di contatti tra GAD-65 puncta positivo (in verde) e la superficie di cellule HEK293 è stato contato occhio in ciascuna sezione ottica di un Serie Z-stack (8 – 10) per cella utilizzando il software di imaging, ed espressa come numero di contatti / cell. Il grafico mostra il numero di contatti tra neuroni medi spinosi e controllo HEK293 cellule (grigio chiaro) o / β2 cellule / γ2-HEK293 α1 (nero) dopo 4 e 24 ore in co-coltura (media ± SEM, n = 8 in ogni condizione da due esperimenti indipendenti). Questo dato è stato modificato da Fuchs et al. (2013) 30. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. annuncio / 52115 / 52115fig3highres.jpg "width =" 600 "/> R Figura 3. GABA A promuovere la formazione di contatti sinaptici attivi. Immunomarcatura di contatti sinapsi, come si formano dopo 24 ore di co-coltura tra i terminali dei neuroni medio spinosi positivi per GAD65 (Alexa Fluor 405 ciano) e (A) di controllo HEK293 cellule, o (B) HEK293-α1 / β2 / γ2 cellule, sia transitoriamente trasfettate con mCherry costruire (rosso). Contatti attivi sono identificati da co-localizzazione tra la vescicola luminale specifico dominio anticorpo anti-synaptotagmin (Cy5) e di anticorpi specifici per GAD65 sia nei terminali presinaptici, e mCherry espressi in cellule HEK293. Scala bar:. 10 micron Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. IGURA 4 "fo: content-width =" "src =" 6in / file / ftp_upload / 52115 / 52115fig4highres.jpg "width =" 600 "/> Figura 4. neuroni GABAergici di medie spinosi formano contatti sinapsi-like con α1 / β3 / subunità γ2- esprimere HEK293 cellule in co-coltura. (A) l'etichettatura fluorescente di terminali presinaptici con anti-sinapsina I anticorpi (in verde), e controllo HEK293 cellule (a sinistra), o α1 / β3 / γ2 cellule che esprimono HEK293, sia transitoriamente trasfettate con mCherry (in rosso), i punti di rivelato co-localizzazione tra questi marcatori che indicano la formazione di contatti sinapsi, come dopo 24 ore in co-coltura. Scala bar: 10 micron (B). L'analisi quantitativa dei contatti sinapsi-like. Cellule HEK293 sono state identificate dall'espressione mCherry, e il numero di contatti tra synapsin I-positivi puncta (in verde) e la superficie di cellule HEK293 è stato contato occhio in ciascuna sezione ottica di una serie Z-stack (8 – 1.0) per cella utilizzando il software di imaging, ed espressa come numero di contatti / cell. Il grafico mostra il numero di contatti tra neuroni medi spinosi e controllo HEK293 cellule (grigio chiaro) o / β3 cellule / γ2-HEK293 α1 (nero) dopo 24 ore in co-coltura (media ± SEM, n = 8-12 cellule in ciascuna condizione, da due esperimenti indipendenti). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Anche se questo protocollo non è tecnicamente difficile da eseguire, ci sono diversi passaggi critici che devono essere seguite per raggiungere le più accurate e ripetibili saggi di co-coltura. In primo luogo, colture di neuroni medio spinosi devono essere seminate ad una densità ottimale. Se seminato troppo poco, i neuroni tendono a svilupparsi molto lentamente e la sopravvivenza è notevolmente ridotto. D'altra parte, se seminato troppo densamente, neuroni tendono ad aggregarsi che compromette l'analisi dei contatti con cellule HEK293. In secondo luogo, si consiglia di esprimere transitoriamente un reporter fluorescente GFP o mCherry in cellule HEK293 che esprimono stabilmente recettori GABA A, prima di loro platting in co-coltura. Ciò consente il riconoscimento affidabile di cellule HEK293, che possono essere compromesse dalla somiglianza nella forma e dimensione tra queste cellule e rari cellule glia sopravvivere in colture neuronali. Per ottenere la trasfezione efficiente con GFP o mCherry cDNA, linee cellulari HEK293 devono essere in fase di crescita esponenziale eseminate ad una densità appropriata in piastre da 6 pozzetti. Semina Sparse seguito da trasfezione farà sì che le cellule a crescere poco, mentre oltre-semina impedisce alle cellule di prendere il cDNA. Idealmente, le cellule devono essere seminate in modo che siano tra il 70 – 90% confluenti il ​​giorno della trasfezione. In terzo luogo, trasfezione deve essere ottimizzato per ciascuna linea cellulare utilizzata, come alcune linee cellulari sono più sensibili rispetto agli altri. Questo perché GABA costitutiva Un'espressione R in cellule HEK293 riduce la sopravvivenza delle cellule e la capacità delle cellule di recuperare dopo trasfezione. Inoltre, la sopravvivenza dipende dal tipo di GABA A Rs espressi in cellule HEK293, con alcune linee cellulari essendo significativamente più sensibile rispetto agli altri. La trasfezione usando il reagente liposomiale è un metodo ottimale per esprimere proteine ​​estranee in rapida crescita di linee cellulari, fornendo sia l'elevata efficienza di trasfezione e livello di espressione. Tuttavia, questo reagente provoca troppi danni a crescita lenta linee cellulari, perche utilizziamo regolarmente un reagente di trasfezione non liposomiale. Ciò funziona in modo simile al reagente liposomiale ma la quantità di DNA necessario per la trasfezione efficace è significativamente ridotta. Questo permette una maggiore sopravvivenza cellulare (circa l'80 – 90% rispetto al 60% utilizzando il reagente liposomiale) ma con bassa efficienza di trasfezione (60%). Infine, il numero di HEK293 controllo o α1 / β2 / γ2 HEK293 cellule che esprimono aggiunti a colture neuronali deve essere ottimizzato. L'aggiunta di troppo poche cellule compromette l'analisi di successo di contatti tra le cellule HEK293 e neuroni, perché diventano molto raro. Al contrario, l'aggiunta di un numero eccessivo di cellule HEK293 provoca la morte delle cellule neuronali entro poche ore.

Culture medio spinosa neuroni embrionali dovrebbero idealmente essere preparate utilizzando tessuto striatale sezionato dall'età embrionale 15 – 17. Tuttavia, spesso accade che gli embrioni sono leggermente più giovani o più vecchie del periodo ottimale. In questo caso, il numero di neuroni seminati in coltura saràdevono essere variato. Tessuto che è più giovane di E15 può avere bisogno di essere testa di serie con una densità leggermente inferiore, mentre il tessuto che è più vecchio di E17 può avere bisogno di essere seminate ad una densità più elevata, per permettere la sopravvivenza delle cellule ottimale. Inoltre, citosina arabinoside (Ara-C) può essere necessario aggiungere alle culture più anziani per prevenire la crescita di cellule gliali, che è più abbondante nel tessuto vecchio.

Quando si crea co-colture, è importante placcare il numero ottimizzato di HEK293 trasfettate o / β2 / γ2 HEK293 cellule esprimenti α1, come detto sopra. Tuttavia, può essere necessario determinare questo per ogni linea singola cella, a causa delle differenze nelle loro sopravvivenza. Tipicamente 30.000 cellule in un volume massimo di 50 microlitri dovrebbero essere aggiunti a ciascun pozzetto di un piatto a 24 pozzetti, che già contiene 500 ml di terreno di coltura neuronale, come questo assicura che il mezzo condizionato neuronale non è diluito troppo e che le condizioni all'interno di ogni bene rimanere abbastanza costante, ad esempio, </em> Concentrazione di fattori di crescita. Aggiunta di volumi superiore a 50 ml per ogni pozzetto sarà generalmente uccidere i neuroni.

Uno dei principali inconvenienti della tecnica di co-coltura è che le colture neuronali sono creati da cellule dissociate coltivate in monostrato, che significa che i neuroni sono stati rimossi dal loro microambiente normale e sono in grado di stabilire la loro normale organizzazione anatomica. Di conseguenza mancano i collegamenti appropriati, gli ingressi e le molecole secrete da altre cellule che possono influenzare le fasi iniziali dello sviluppo delle sinapsi. Ad esempio, in vivo neuroni spinosi medi sono densamente innervati dal ingressi glutamatergiche dalla corteccia, talamo e altre regioni del cervello 34, tuttavia, nelle nostre colture neuronali sinapsi glutammatergica non formano perché questi ingressi sono danneggiati durante la dissezione del tessuto striatale. Come l'assenza di sinapsi glutamatergiche funzionali in colture di neuroni spinosi medi affette la loro capacità di formare sinapsi GABAergici tra loro e / o cellule HEK293 che esprimono GABA A R rimane una questione aperta. La questione potrebbe essere facilmente risolto coltura neuroni spinosi medi insieme con i neuroni glutamatergici corticali consentendo loro di formare sinapsi funzionali 35 precedenti l'aggiunta di cellule HEK293. Un approccio alternativo sarebbe quello di progettare un sistema modello di co-coltura sulla base di culture fetta organotipica, che mantengono alcuni dei citoarchitettura che può essere importante per la maturazione e la formazione di sinapsi. Tuttavia, culture fetta organotipica hanno neuropilo densa ed eterogenea, che può compromettere l'analisi effettuata qui. Un altro importante svantaggio di utilizzare saggi di co-coltura è che GABAA Rs espresso sulla superficie delle cellule HEK293 non sono raggruppati come sono in neuroni, anche se questo non sembra essere necessario per la formazione delle sinapsi in una espressione superficiale abbastanza alta 30. Ad esempio, nel rcervello Odent e in colture ippocampali, la α1 GABA A R subunità si trova nella maggior parte delle sinapsi GABAergici su tutti i domini post-sinaptici delle cellule piramidali. Tuttavia, l'α2 si trova precisamente in un sottoinsieme di sinapsi sul somata e dendriti, ma è altamente arricchito nel segmento iniziale dell'assone, come rivelato da immunofluorescenza e microscopia elettronica 36. Dato che la formazione di sinapsi in co-colture può ancora essere rilevato in modo affidabile e analizzato 30, questo suggerisce che la densità dei recettori GABA A sulla superficie cellulare delle cellule HEK293 può essere simile o addirittura superiore alla densità di questi recettori all'interno sinaptica cluster di neuroni. Ciò può spiegare, almeno in parte, perché le proteine ​​sinaptiche adesione, quali neuroligin e proteine ​​densità postsinaptica, come gephyrin, non sono necessari per la formazione di sinapsi in co-colture, se sono presenti Rs opportunamente assemblate GABA A a sufficiente densità.

È ben documentato che recettori GABA A sono strutturalmente e funzionalmente eterogenea, e che la composizione subunità del recettore determina la loro localizzazione subcellulare e proprietà farmacologiche. Ad esempio, l'incorporazione dei 2 subunità è noto per essere un prerequisito per la localizzazione sinaptica dei recettori GABA A, mentre la subunità è quasi esclusivamente presente in extrasinaptica recettori GABA A. I recettori che incorporano solo αβ combinazioni sono anche pensato di essere prevalentemente localizzato ai domini extrasinaptica 12- 14. Se questa specificità è mantenuta nel nostro sistema di co-coltura può essere facilmente provato da transitoriamente trasfezione 2 o subunità cDNA in linee cellulari HEK293 che esprimono stabilmente α e β subunità, prima di aggiungerli a colture neuronali. I nostri esperimenti preliminari utilizzando questo approccio hanno suggerito che i contatti sinaptici sono facilmente formate solo in presenza della subunità 2, indicando che le specispe- osservata in vivo potrebbe essere conservato in vitro (dati non mostrati).

Inoltre, recettori GABA A che incorporano diverse subunità α sono selettivamente localizzati ai contatti sinaptici formati con specifici tipi di neuroni presinaptici. Ad esempio, nel globo pallido, le Rs α1-GABA A si trovano generalmente a striatopallidali (str-GP) e palliopallidal (GP-GP) sinapsi, che si trovano sui dendriti e regioni somatiche dei neuroni spinosi medi, rispettivamente. Le Rs α3-GABA A si trovano in regioni perisomatic di neuroni spinosi medi e vengono contattati da garanzie reali GP assoni locali, mentre le Rs α2-GABA A si trovano su dendriti distali di questi neuroni e contattato principalmente da input dallo striato 32. L'espressione di specifiche subunità α in diversi tipi di sinapsi e nei diversi compartimenti neuronali è stata dimostrata anche in altre aree cerebrali, come Hippocampus 21 e neocorteccia 18,20. Questi risultati sollevano la questione di come le sinapsi inibitorie specifiche si formano nel cervello. Fa l'adesione di uno specifico tipo di terminale presinaptico indurre l'inserimento di specifici sottotipi GABAA R nei punti di contatto? Sono i recettori vittime della tratta a specifiche posizioni subcellulari in base alla loro composizione subunità, in cui il loro inserimento membrana plasmatica è un prerequisito per l'adesione di terminali assonali di origine specifica? Fino ad oggi, queste domande rimangono senza risposta. L'utilizzo di sistemi modello ridotte, quali il sistema di modello di co-coltura, ci permettono di iniziare a rispondere queste domande complesse perché il sistema è facilmente suscettibile di trasfezione dei costrutti di DNA e l'applicazione dei reagenti e, soprattutto, è adatto per l'analisi di imaging cellulare dal vivo 30. Così, con questo sistema modello possiamo iniziare a testare il ruolo delle singole molecole, tra cui diversi tipi di recettori GABA A, san di essere presenti a contatti sinaptici. Un altro vantaggio è che le sinapsi in questa forma modello di sistema rapidamente, in pochi minuti a ore, riducendo la durata degli esperimenti. Sistemi modello simile co-coltura sono stati impiegati con successo in passato per lo screening per le nuove molecole synaptogenic 27,37,38.

Capire come il sistema nervoso centrale si sviluppa, matura e forme connessioni tra i neuroni in modo complicato per il controllo, per esempio, il comportamento o la cognizione, è di fondamentale importanza. Questo obiettivo distante sarà possibile soltanto delineando i meccanismi molecolari che governano le singole fasi di riconoscimento e di comunicazione cellula-cellula durante lo sviluppo. A causa della complessità pura, i dettagli molecolari di queste interazioni cellulari multiple possono attualmente essere studiati con precisione solo in sistemi ridotti. Tuttavia, la capacità di aumentare la complessità di questi sistemi esprimendo molteplici combinazioni di proteine ​​e studiare comeessi interagiscono presenta alcuni vantaggi rispetto, per esempio approcci soppressione genetica. Questo perché l'interpretazione accurata degli effetti di un singolo gene delezione è spesso compromessa dai cambiamenti associati con meccanismi di compensazione mascheramento gli effetti di lesioni originali, in particolare nel cervello in via di sviluppo. La tecnica ma informativo co-coltura semplice qui descritto ha consentito la scoperta del ruolo strutturale di recettori GABA A nella formazione delle sinapsi e ha aperto la possibilità di studiare come recettori GABA A e di altre molecole di adesione cellulare e / o di proteine ​​della matrice sinaptica interagiscono tra loro durante la sinaptogenesi. Proteine ​​della matrice sinaptiche sono di particolare interesse dato che hanno recentemente dimostrato di giocare un ruolo chiave nella formazione del glutammato sinapsi 39. Ulteriore sviluppo di modelli di co-coltura è importante perché essi hanno il potenziale per far progredire la nostra conoscenza dei meccanismi molecolari che guidano la 'normale &# 8217; lo sviluppo del cervello e, quindi, aumentare la nostra comprensione di come questi meccanismi sono alterati in numerose malattie dello sviluppo neurologico, come l'epilessia, la schizofrenia, i disturbi dello spettro autistico e molti altri.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo riconoscere il sostegno finanziario della MRC Regno Unito (G0800498). Vorremmo anche ringraziare il professor JM Fritschy, Università di Zurigo, per fornire il GABA A -R specifica subunità γ2 anticorpi e il professor R. Harvey, UCL Facoltà di Farmacia, per fornire la pcDNA 3.1 (+) vettori di espressione contenenti la resistenza agli antibiotici geni per la produzione di linee cellulari stabilmente trasfettate HEK293.

Materials

Name Company/Individual Catalog Number Comments
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Serum) Life Technologies 11960-044 Warm in water bath at 37 ° С before use
L-Glutamine Life Technologies 25030-024
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15070-063 Danger: irritant
FBS (Fetal Bovine Serum) Life Technologies 10106-169
Neurobasal Life Technologies 21103-049 Warm in water bath at 37 ° С before use
B27 Supplement Life Technologies 17504-044
Glucose Sigma-Aldrich G8769
HBSS (10X) Life Technologies 14180-046
HEPES (1M) Life Technologies 15630-056
PBS (1X) Life Technologies 10010-031
pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Geneticin-selection) Life Technologies V790-20
pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Zeocin-selection) Life Technologies V860-20
pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Hygromycin-selection) Life Technologies V870-20
Stable HEKα1β2γ2 line Sanofi-Synthelabo, Paris
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P1149
G418 disulfate salt (Geneticin) Sigma-Aldrich G5013 Danger: irritant
Phleomycin D1 (Zeocin) Life Technologies R25001
Hygromycin B Life Technologies 10687-010 Danger: toxic, irritant and corrosive
Trypsin-EDTA Life Technologies 25300-054 Warm in water bath at 37 ° С before use Danger: Irritant.
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P6282
Laminin Sigma-Aldrich L2020
100 μm Nylon Cell Strainer VWR 734-0004
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) Sigma-Aldrich C1768 Danger: Irritant
Chelating agent (Versene) Life Technologies 15040-033
liposomal transfection reagent (Lipofectamine LTX) with liposomal transfection buffering reagent (PLUS reagent). Life Technologies 15338-100 Alternative transfection method: Effectene Reagent
Non-liposomal transfection reagent (Effectene reagent) Qiagen 301425
Reduced serum medium (Opti-MEM) Life Technologies 11058-021
Mouse anti-Synaptotagmin antibody conjugated to Cy5 Synaptic Systems 105311C5
Neurobasal A Life Technologies 10888-022
Sodium Chloride (NaCl) VWR 27810.364
Glycine Sigma-Aldrich G1726
BSA (Bovine Serum Albumin) Sigma-Aldrich A3294
Guinea pig anti-γ2 GABAA receptor antibody Prof. Jean Marc Fritschy N/A
(Institute of Zurich, Switzerland) Fritschy, J.M and Mohler, H.
J. Comp. Neurol. 359 (1) 154–194 (1995).
Triton X-100 Promega H5141
Mouse anti-Glutamate Decarboxylase (GAD)65 antibody Merck Millipore MAB351
Mouse anti-synapsin antibody Synaptic Systems 106-011
Mouse anti-β2/3 antibody (BD17) Merck Millipore MAB341
Rabbit anti-α1 GABAA receptor antibody Professor Anne Stephenson N/A
(UCL School of Pharmacy, London) FA Stephenson et al., J. Comp. Neurol.416 (2) 158-172.
Goat anti-guinea pig conjugated to Cy5 antibody Merck Millipore AP1085
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody Merck Millipore AP124S
Goat anti-mouse Alexa Fluor 405 antibody Life Technologies A31553
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 antibody Life Technologies A21422
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody Life Technologies A11008
Mounting reagent (Prolong Gold) Life Technologies P36930 Use at room temperature
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Referencias

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Brown, L. E., Fuchs, C., Nicholson, M. W., Stephenson, F. A., Thomson, A. M., Jovanovic, J. N. Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors. J. Vis. Exp. (93), e52115, doi:10.3791/52115 (2014).
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