The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).
Majoriteten av alle kjente sykdommer er ledsaget av forstyrrelser i det kardiovaskulære systemet. Studier av kompleksiteten i samspill trasé aktiveres under kardiovaskulære sykdommer er imidlertid begrenset av mangel på robuste og fysiologisk relevante metoder. For å modellere patologiske vaskulære hendelser har vi utviklet en in vitro-analyse for å studere interaksjonen mellom endotel og helblod. Analysen består av primære humane endotelceller, som er plassert i kontakt med humant helblod. Metoden utnytter naturlig blod med ingen eller svært liten antikoagulant, slik studie av ømfintlige interaksjoner mellom molekylære og cellulære komponenter som er tilstede i et blodkar.
Vi undersøkte funksjonaliteten til analysen ved å sammenligne aktivering av koagulasjon med forskjellige blodvolumer inkubert med eller uten human navlestrengvene endotelialceller (HUVEC). Mens en større blodvolum bidro tilen økning i dannelsen av trombin antitrombin (TAT) -komplekser, tilstedeværelse av HUVEC resulterte i redusert aktivering av koagulasjon. Videre påføres vi bildeanalyse av leukocytter festing til HUVEC stimulert med tumornekrosefaktor (TNFa) og funnet tilstedeværelsen av CD16 + -celler til å være betydelig høyere på TNFa-stimulerte celler sammenlignet med ustimulerte celler etter blod kontakt. Som konklusjon, kan analysen bli anvendt for å studere vaskulære patologier, hvor vekselvirkninger mellom endotel og blodrommet er opprørt.
Metoder for å analysere blod-vaskulære interaksjoner i hjerte-og karsykdommer generelt involverer dyr forskningseksperimenter. Resultater som er opprettet i eksperimentelle undersøkelser dyremodeller kan imidlertid ha liten eller ingen innvirkning på human sykdom. 1,2 Som sådan, er det behov for godt og pålitelig in vitro-modeller for å undersøke cellulære interaksjoner mellom blodkammeret og vaskulære endotelceller i en human-lignende system. Vi har derfor etablert en blod endotelceller kammer modell. Dette er basert på en tidligere beskrevet modell som brukes for å undersøke interaksjonen mellom biomaterialer og humant helblod. 3. I motsetning til andre in vitro-oppsett der vanligvis begrenset antall av rensede komponenter, dvs., trombocytter, leukocytter eller endotelceller er tilgjengelige, inkorporerer den foreliggende modellen alle de komponenter som er tilstede i et blodkar.
Oppsettet av blodet endothelial cell kammermodellen er utformet for å muliggjøre bruk av ferskt humant blod trukket med lite eller intet tilsatt antikoagulant. Blood lagret under lengre tidsperioder tilegne såkalte lagrings lesjoner der nedbryting av erytrocytter kan forstyrre delikat samspill mellom blod og endotelceller. 4
For å unngå klumpdannelse under håndtering av helt blod ex vivo krever enten høye doser av antikoagulerende middel, eller at alt materiale i kontakt med blod må være ikke-aktiverende. Som ikke-aktiverende flater er sjeldne i laboratoriemiljø, kan materialer alternativt være utstyrt med et beskyttende lag av immobilisert heparin. Et beskyttende lag av immobilisert heparin (heretter referert til som Corline heparin flate (CHS)) som kan anvendes på de fleste materialer skaper en overflate hvor blod kontakt kan forekomme uten å forårsake en aktivering av koagulasjonskaskaden. 5 Således, innredning av kamrene med CHS, blodet endothelial cell kammermodell muliggjør bruk av meget lave konsentrasjoner av antikoagulant i blodet. Å unngå tilsetning av høye konsentrasjoner av antikoagulant i blodet endotelial kammeret modellen gjør det mulig å studere interaksjoner følsomme innenfor et blodkar som ellers kunne maskeres. 6
Blodet endotelial cellekammer modellen består av to kammere som dannes ved å feste plastsylindre (høyde: 8 mm, radius: 9 mm) til en plast-objektglass. Kantene som vender oppover på sylindrene er utstyrt med spor som er utstyrt med O-ringer som benyttes for forsegling av de mot kamrene cellekulturen lysbilde. Kamrene er bare delvis fylt med blod som luften som er igjen i kammeret holder blod i bevegelse når kamrene blir deretter rotert i en vertikal stilling (figur 1).
For å vurdere funksjonaliteten av modellen, vi utført eksperimenter med enten en helt CHS belagtkammer eller Menneskelig navleveneendotel Cells (HUVEC). To separate blodvolum ble analysert og dannelsen av trombin antitrombin (TAT) komplekser (en indirekte markør for koagulering) ble målt med enzymbundet immunosorbent assay (ELISA). Vi så vurdert effekten av blodvolum og tumornekrosefaktor (TNF-alfa) stimulerte endotelceller på leukocytt rekruttering av bildeanalyse.
Figur 1. Oppsett av blodet endotelceller kammer modell. (A) ovenfra skjematisk tegning av blodkammeret laget i PMMA. (B) Primære humane endoteliale celler dyrkes på 1-brønners kammerobjektglass. Friskt humant helblod ble tilsatt til to kammere på et objektglass. Kamrene og alle stoffer som benyttes for håndtering av blodet er behandlet med et beskyttende belegg HS. Etter fjerning veggene av cell kultur slide, blir cellene plassert vender mot blodet, og systemet er klemt stengt. (C) Det blod endotelial cellekamre inkuberes deretter i henhold til dreining i 37 ° C. Etterpå kan reaksjonene i blodrommet bli analysert ved hjelp av ELISA og endotelcellene kan bli analysert ved hjelp av mikroskopi.
Flere interaksjoner mellom blodet og beholderveggen er normalt holdes i en hviletilstand på grunn av ikke-klebende og anti-trombotisk natur av endotel. 7 Under patologiske tilstander som involverer inflammasjon, blir den aktivert endotel med en resulterende økning i adhesjon reseptor ekspresjon og 8 en redusert evne til å inhibere hemostase. 9 Aktivering av kaskadesystemene i blodet i sin tur forsterker trombogenisiteten av endotelet forårsaker ytterligere trombose og leukocytt-rekruttering. 10 For å få en bedre forståelse av denne delikate interaksjoner mellom endotelceller og fullblod, har vi utviklet en ny metode for in vitro hvor dyrkede endotelceller blir plassert i kontakt med helt blod. Så vidt vi vet, er vårt oppsett den første til å vise endotelceller inkubert med hele menneskeblod med ingen eller svært lite antikoagulant for lengre tidsperioder.
nt "> Følsomheten av dette systemet blir aktivert ved å åpent system venepunksjon i kombinasjon med et beskyttende lag av immobilisert heparin på alle overflater som er plassert i kontakt med blod. Bruken av et åpent system under blod anskaffelse reduserer aktivering av kaskadesystemene under venepunksjon mens tillater bruken av en selvbestemt mengde antikoagulant. Kommersielt tilgjengelige evakuert blodprøverør kan imidlertid anvendes, avhengig av den tiltenkte sluttpunktene av studien. Den endelige konsentrasjonen av antikoagulant tilsatt til de fleste kommersielt tilgjengelige lukket system rør kan hemme følsomme og ellers er vanskelig å studere, interaksjoner i oppsettet. 6 En beskyttende heparin overflate eliminerer ytterligere aktivering av blod gjennom overflatekontakt på andre måter enn de endotelceller overflater. 5 Faktisk inkubasjon av fullblod supplert med en liten mengde av ufraksjonert heparin kammeret uten beskyttelse av CHS resulterte i klumpdannelse. <pclass = "jove_content"> Den luftboble inne i kammeret gjør det mulig for blandingen av blod under inkubasjon med endotelcellene. For å vurdere virkningen av luftboblestørrelse, vi brukte to forskjellige blodvolum. I denne modellen har vi målt tilsvar TAT nivåer uavhengig av luftboble størrelse i kamre inkubert med HUVEC. TAT ble imidlertid øket med en mindre luftboblestørrelse i det fullt CHS behandlet kamre. Dette, i samsvar med tidligere beskrevne endoteliale celleegenskaper 11, indikerer en regulerende virkning på den økte aktivering av koagulasjon gitt av de endoteliale celler som mangler i den inerte CHS kammeret. Den luftbobler i systemet skaper en strømning ved rotasjon av kammeret. Størrelsen av boblen vil påvirke de krefter innenfor dette roterende system. Dette er vist ved resultatene i figur 2D var en mindre boble skaper høyere TAT verdier som representerer en minsket kraft ved blod dvs. blodet bevegelseninne i kammeret er lavere og derved aktivering av kaskadesystemet skjer til en høyere grad. Det bør nevnes at i dette system blir vi skape en roterende strømning som vil være forskjellig i hastighet tvers over kammeret med den høyeste hastighet langs veggene og lavest i midten. Dette er åpenbart ikke et optimalt miljø med hensyn til strømning og skjærspenning for endotelceller, men fortsatt vi har et system for å produsere stabile og repeterbare resultater. Mer optimale betingelser ville omfatte sirkulerende laminær strømning i fravær av turbulens. Dette er imidlertid ikke mulig i modellen representeres her og til vår kunnskap om et slikt system er ikke tilgjengelig til dags dato. Selv om det finnes flere systemer microfluidic tilgjengelig kommersielt som ikke er mulig å kombinere med helt blod med eller uten lave nivåer av antikoagulant tilsatt til systemet for derved å unngå å muliggjøre korrekt følsomme evaluering av interaksjonene mellom alle komponenter som er tilstede i blod og endotelceller.Videre var det en to-fold økning i rekruttering av blodceller mot TNFa aktivert HUVEC i kombinasjon med en doblet dannelsen av TAT uavhengig av blodvolum. Dette bekrefter stabiliteten av modellsystemet, og viser også muligheten for å bruke et aktivert endotel i kombinasjon med helt blod. Fremtid på, kan blod endotelial cellekammer brukes til å undersøke blodcellerekruttering mot aktiverte endotelceller ved en rekke forskjellige markører som blir uttrykt på celler under forskjellige betingelser og stadier av aktiveringen. Videre kan modellen brukes i kombinasjon med farmakologiske midler for å vurdere effektene på inflammatoriske tilstander.
Oppsummert viser vi den store fordelen av å kombinere et kammermodell med humane blod og vaskulære celler for å skape et helt menneske in vitro system for å utføre relevante undersøkelser av vaskulær sykdom.
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet med tilskudd fra Vetenskapsrådet (90293501, A0290401, A0290402), EU syvende rammeprogram henhold tilskuddsavtalen n ° 602699 (DIREKT), den NovoNordisk Foundation, Gurli og Edward Brunnberg Foundation, Stem Therapy, Vleugel Foundation og Åke Wiberg Foundation.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Human Umbilican Vein Endothelial Cells (HUVEC) | PromoCell | C-12200 | Any other type of primary human endothelial cell may be used. |
Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM MV) | PromoCell | C-22120 | |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G-2500 | Prepare 1% gelatin in PBS, incubate 5 ml in a T75 for 15 min and remove before culturing cells. |
TAT ELISA | Enzyme Research Lab. | TAT-EIA-C | |
Mouse anti-human CD16 | DAKO | F7011 | Dilution 1:100 |
Goat anti-mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11001 | Dilution 1:500 |
Phalloidin-Texas Red | Molecular Probes | A22287 | Dilution 1:200 |
DAPI | Molecular Probes | D1306 | Dilution 10 μg/ml |
EDTA | Sigma | E-6758 | |
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco Life Tecnologies | 25200-056 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Life Technologies | 10437 | |
1 well cell culture slides | BD Falcon | 354101 | |
Blood Chambers | NA | NA | Blood Chamber may be manufactured in PMMA or any other plastic able to bind CHS |
Clamps | Office Depot | 2052204 | |
Corline Heparin Surface (CHS) | Corline Systems AB | 945-00 | |
Hypodermic needle | Terumo | NN-1850R | Size: 18 G x 5 mm |
Unfractionated Heparin (UFH) | Leo Pharma | 585679 | |
K3EDTA | Alfa Aesar | 1709958 | Prepare a 0.34 M stock solution in milliQ H20 |
PFA | Sigma-Aldrich | P-6148 | |
Fluorescence microscope | Nikon | 80i | |
Light microscope | Nikon | TS100 | |
Image analysis software | Broad Institute | CellProfiler | Available for free at www.cellprofiler.org |